Análisis de Malformaciones Craneomaxilofaciales en Ratones mediante Tomografía Microcomputarizada Tridimensional

Resumen

Aquí, describimos en profundidad un método, que se basa en la tomografía microcomputarizada, para segmentar y medir modelos 3D de huesos craneomaxilofaciales en ratones, para una mejor evaluación del desarrollo óseo craneomaxilofacial en ratones que lo que es posible con los métodos actuales.

Resumen

Para modelar las malformaciones craneofaciales causadas por la deficiencia de vitamina A (VAD), expresamos una mutación del receptor de retinoides dominante-negativo en osteoblastos para inhibir específicamente la actividad transcripcional de RAR en ratones. Este enfoque nos permitió investigar los efectos de la VAD sobre la hipomineralización craneal, la deformidad mandibular y la hipoplasia clavicular en casos clínicos. En este estudio, la tomografía microcomputarizada (microTC) de la región craneomaxilofacial de ratones representó una herramienta valiosa para estudiar el crecimiento y desarrollo de este modelo animal. La estimación manual de las imágenes requiere mucho tiempo y es inexacta. Por lo tanto, aquí presentamos un enfoque sencillo, eficiente y preciso para segmentar y cuantificar las imágenes de microTC de cada hueso craneomaxilofacial. Se utilizó el software MicroCT para cortar la mandíbula, el hueso frontal, el hueso parietal, el hueso nasal, el premaxilar, el maxilar, el hueso interparietal y el hueso occipital de ratones y medir sus longitudes y anchuras correspondientes. Este método de segmentación se puede aplicar para estudiar el crecimiento y el desarrollo en biología del desarrollo, biomedicina y otras ciencias relacionadas y permite a los investigadores analizar los efectos de las mutaciones genéticas en los huesos craneofaciales individuales.

Introducción

El intrincado desarrollo del cráneo y la cara humana abarca un sofisticado proceso morfogenético en 3D, intrincadamente orquestado por numerosos genes. Estos genes desempeñan un papel fundamental en la regulación de los intrincados patrones, la proliferación y la diferenciación de los tejidos derivados de diversas fuentes embrionarias. Este proceso altamente coordinado subraya la complejidad del crecimiento y desarrollo craneofacial humano. Las malformaciones craneofaciales (incluyendo labio leporino y paladar hendido, cierre de suturas craneales e hipoplasia facial) que ocurren como resultado de anomalías del desarrollo representan más de un tercio de todos los defectos congénitos de nacimiento. Como animal modelo comúnmente utilizado en la investigación biomédica, el ratón tiene una estructura ósea craneomaxilofacial compleja y delicada que es muy similar al hueso craneomaxilofacial humano en términos de anatomía y fisiología. El estudio de la biología del desarrollo craneomaxilofacial ha recorrido un largo camino en los últimos años con el advenimiento de nuevas técnicas en genética de ratones, especialmente en malformaciones¹.

El ácido retinoico (AR) es el metabolito in vivo de la vitamina A². La deficiencia de vitamina A (VAD) se asocia con una serie de trastornos multisistémicos graves, como un mal remodelado óseo, fracturas, así como malformaciones craneofaciales y malformaciones esqueléticas caracterizadas por enanismo ^3,4 . Los receptores de retinoides (RARA) son factores de transcripción cruciales en la señalización de retinoides⁵. Se diseñó un mutante dominante-negativo RARα403 (dnRARα)⁶ y se estableció un modelo de ratón en el que los osteoblastos expresaban dnRARα. Esto dio lugar a que los ratones exhibieran enanismo, deformidades craneofaciales, formación incompleta de hueso cortical y hueso trabecular aumentado pero mal remodelado.

La microtomografía computarizada (microTC) tiene un gran potencial para el estudio de las malformaciones craneomaxilofaciales. Posee la capacidad de detectar y rastrear la evolución de las anomalías esqueléticas innatas y adquiridas en modelos de roedores. El análisis de imágenes MicroCT ofrece una exploración en profundidad de las alteraciones del crecimiento craneofacial en modelos de ratón modificados genéticamente ^7,8 . Además, las imágenes 3D emergen como una herramienta vital para delinear rasgos morfológicos, lo que facilita enfoques personalizados de análisis y visualización⁹. La micro-TC se ha utilizado en varios estudios para analizar fenotipos craneofaciales, incluyendo la definición de puntos de referencia anatómicos en humanos y ratones y el análisis volumétrico de cada hueso craneofacial 10,11,12. Aquí, describimos en detalle un método basado en la tecnología microCT para separar y medir modelos 3D de huesos craneomaxilofaciales de ratón para permitir una mejor evaluación y análisis del desarrollo esquelético craneomaxilofacial de ratón que lo que es posible con los métodos actuales.

Protocolo

Hemos cumplido con todas las normas éticas pertinentes para la experimentación e investigación con animales. Todos los procedimientos con animales de experimentación fueron aprobados por el Comité Asesor Institucional de Investigación y Cuidado de Animales del Noveno Hospital Popular de Shanghai, Facultad de Medicina de la Universidad Jiaotong de Shanghai.

Tanto la cepa de ratones Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26^dn/dn) como la cepa de ratones Osterix-Cre (Osx^Cre) (No.006361) utilizadas aquí se mantuvieron en el fondo C57BL/6. Los ratones R26^dn/dn se cruzaron con ratones Osx^Cre para generar OSX^Cre; Ratones^{R26 dn/dn} . Todos los ratones fueron criados y mantenidos en condiciones específicas libres de patógenos (SPF).

1. Cría de ratones

NOTA: F significa el número de generaciones de ratones; N significa el número de generaciones de apareamiento entre ratones cigóticos y ratones de fondo. Por lo tanto, F2 + N representa la segunda generación, así como cualquier programa de cría de ratones posterior. F0 significa ratones primarios.

1. Empareja un ratón macho sexualmente maduro con un par de ratones hembra de una edad comparable. Comience las inspecciones diarias para los cachorros recién nacidos después de un período inicial de 18 días. Al identificar a las hembras preñadas, aíslelas si es necesario para garantizar un cuidado materno óptimo. En el caso de que no se observen embarazos dentro de un mes después del emparejamiento inicial, considere alternar el ratón macho entre diferentes configuraciones de reproducción para promover la fertilización.
2. Cruce ratones R26^dn/dncon ratones^Cre OSX (F0). Corta las colas para el genotipado y conserva el macho OSX^Cre; R26^dn/+ratones en jaulas hasta la madurez sexual, que es ~6 semanas de edad (F1).
3. Cruce de OSX^Cre macho de seis semanas de edad; ratones R26^dn/+ con ratones hembra R26^dn/dn(F2). Cortar las colas para el genotipado y reemplazar los ratones reproductores viejos con ratones más jóvenes a tiempo (F2 + N).

2. Preparación

1. Prepare cuatro pares de Osx Cre de 4 semanas de edad, OSX^Cre; R26^dn/+, y OSX^Cre; Ratones^{R26 dn/dn}. Eutanasia individual de los ratones mediante la administración de asfixia con dióxido de carbono.
   NOTA: Para garantizar una eutanasia eficiente, el caudal de_CO2 debe ajustarse para desplazar aproximadamente el 30% del volumen de la jaula cada minuto. Por ejemplo, en una jaula de 45 cm x 30 cm x 30 cm, se recomienda un caudal de 40 L/min.
2. Corta el cuello del ratón con unas tijeras mientras sostienes su cuerpo, dejando el cráneo intacto.
   NOTA: Para obtener un cráneo completo, abra la boca del ratón, corte a lo largo de la comisura de la boca con unas tijeras oftálmicas, tire de ambas manos hacia ambos lados y gírela para pelar la piel de la cabeza del ratón.
3. Sumerja los cráneos de ratón en paraformaldehído al 4% durante 48 h, luego guárdelos en etanol al 70%.
   PRECAUCIÓN: El paraformaldehído es tóxico; Use la protección adecuada.
4. Escanee los cráneos recolectados con un escáner microCT: resolución: 4,5 μm; voltaje: 70 kV; corriente: 114 μA; filtro: 0,5 mm Al; paso de rotación: 0,5 °.
5. Guarde las imágenes de las tomografías computarizadas. Las imágenes en formato DICOM se seleccionan para importarlas al software y se analizan.

3. Imágenes MicroCT y reconstrucción 3D

NOTA: Todos los huesos utilizados en este estudio fueron segmentados manualmente.

1. Haga clic con el botón derecho del ratón en la página MASCARILLAS y seleccione Nueva máscara; Aparece una nueva capa llamada Verde .
2. Seleccione el intervalo de umbrales de 671-2.566 en la página Umbrales que aparece. Repita este proceso para todas las capas relacionadas. (Figura 1A).
3. Utilice la herramienta Borrador en el menú Editar para borrar manualmente los huesos unidos a la mandíbula en cada capa en el plano sagital 2D (Figura 1B).
4. Seleccione la región de la mandíbula en el plano sagital 2D después de hacer clic en la opción Región creciente (Figura 1C).
   PRECAUCIÓN: Asegúrese de que la región mandibular esté seleccionada completamente en cada capa; de lo contrario, resultará en una mandíbula incompleta después de la reconstrucción.
5. Haga clic en la capa recién creada Mandíbula en la página MÁSCARAS y seleccione Calcular 3D en el menú desplegable (Figura 1D).
6. En la interfaz de objetos 3D , haga clic con el botón secundario en Mandíbula y haga clic en Propiedades. Haga clic para cambiar el color. Codifica por colores todos los modelos 3D reconstruidos con diferentes huesos.
7. Haga clic en Medir en la esquina superior izquierda y seleccione distancia en el menú desplegable que aparece. Calcule la longitud marcando puntos en la imagen 3D (Figura 1E).
   PRECAUCIÓN: La referencia para medir el ancho del hueso es la parte más ancha del hueso.
8. En la interfaz de objetos 3D , haga clic con el botón secundario en Mandíbula y haga clic en Propiedades. Módulo Properties-Info-Volume para leer los valores de volumen reconstruidos para cada bloque óseo craneomaxilofacial. (Figura 1F).
9. Mida la mandíbula, el hueso frontal, el hueso parietal, el hueso nasal, el premaxilar, el maxilar, el hueso interparietal y el hueso occipital de la misma manera que arriba y márquelos individualmente con diferentes colores.

4. Análisis estadístico

1. Realice análisis estadísticos utilizando el software de su elección. Realizar pruebas t de Student de dos colas (n = 4/grupo).
2. Para todos los gráficos, utilice barras de error para representar las desviaciones estándar. Considere que los valores P < 0,05 son estadísticamente significativos.

Resultados

Una amplia investigación subraya el impacto multifacético de las mutaciones genéticas en el crecimiento, el desarrollo y los sistemas de órganos de los ratones. Una evaluación exhaustiva de los huesos craneofaciales en ratones mutantes requiere métodos más allá del análisis de imágenes en 2D o de un solo tejido debido a sus limitaciones. Por lo tanto, dilucidar el desarrollo óseo craneofacial es de suma importancia para la investigación de los...

Discusión

MicroCT es una potente herramienta para obtener información 3D realista e isotrópica a partir de muestras biológicas densas y opacas con resolución micrométrica. Los datos obtenidos de la microCT están calibrados por geometría e intensidad, lo que la hace especialmente útil para estudios cuantitativos 13,14,15,16,17. S...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
GraphPad Prism 6.01 Software	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA	/
Micro-CT	Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA	/
Mimics Medical 19.0	Materialise, Leuven, Belgium	/
Osterix-Cre (OsxCre)	/	/	from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain	/	/	from the Columbia University, USA