Analyse von kraniomaxillofazialen Fehlbildungen bei Mäusen mittels dreidimensionaler Mikrocomputertomographie

Zusammenfassung

Hier beschreiben wir ausführlich eine Methode, die auf Mikrocomputertomographie basiert, um 3D-Modelle von kraniomaxillofazialen Knochen bei Mäusen zu segmentieren und zu vermessen, um die Entwicklung des kraniomaxillofazialen Knochens bei Mäusen besser beurteilen zu können, als dies mit aktuellen Methoden möglich ist.

Zusammenfassung

Um kraniofaziale Fehlbildungen, die durch Vitamin-A-Mangel (VAD) verursacht werden, zu modellieren, exprimierten wir eine dominant-negative Retinoidrezeptormutation in Osteoblasten, um die RAR-Transkriptionsaktivität in Mäusen spezifisch zu hemmen. Dieser Ansatz ermöglichte es uns, die Auswirkungen von VAD auf die kraniale Hypomineralisation, die Unterkieferdeformität und die Schlüsselbeinhypoplasie in klinischen Fällen zu untersuchen. In dieser Studie stellte die Mikrocomputertomographie (MikroCT) der kraniomaxillofazialen Region von Mäusen ein wertvolles Werkzeug dar, um das Wachstum und die Entwicklung dieses Tiermodells zu untersuchen. Die manuelle Schätzung von Bildern ist sowohl zeitaufwändig als auch ungenau. Daher präsentieren wir hier einen einfachen, effizienten und genauen Ansatz zur Segmentierung und Quantifizierung der MikroCT-Bilder jedes kraniomaxillofazialen Knochens. Die MicroCT-Software wurde verwendet, um den Unterkiefer, das Stirnbein, das Scheitelbein, das Nasenbein, den Prämaxilla, den Oberkiefer, den interparietalen Knochen und das Hinterhauptbein von Mäusen zu durchtrennen und die entsprechenden Längen und Breiten zu messen. Diese Segmentierungsmethode kann zur Untersuchung von Wachstum und Entwicklung in der Entwicklungsbiologie, Biomedizin und anderen verwandten Wissenschaften angewendet werden und ermöglicht es Forschern, die Auswirkungen genetischer Mutationen auf einzelne kraniofaziale Knochen zu analysieren.

Einleitung

Die komplizierte Entwicklung des menschlichen Schädels und Gesichts umfasst einen ausgeklügelten 3D-morphogenetischen Prozess, der von zahlreichen Genen kompliziert orchestriert wird. Diese Gene spielen eine zentrale Rolle bei der Regulierung der komplizierten Muster, der Proliferation und der Differenzierung von Geweben, die aus verschiedenen embryonalen Quellen stammen. Dieser hochgradig koordinierte Prozess unterstreicht die Komplexität des menschlichen kraniofazialen Wachstums und der Entwicklung. Kraniofaziale Fehlbildungen (einschließlich Lippen-Kiefer-Gaumenspalte, Schädelnahtverschluss und Gesichtshypoplasie), die als Folge von Entwicklungsstörungen auftreten, machen mehr als ein Drittel aller angeborenen Geburtsfehler aus. Als häufig eingesetztes Modelltier in der biomedizinischen Forschung besitzt die Maus eine komplexe und filigrane kraniomaxillofaziale Knochenstruktur, die dem menschlichen kraniomaxillofazialen Knochen in Anatomie und Physiologie sehr ähnlich ist. Die Erforschung der kraniomaxillofazialen Entwicklungsbiologie hat in den letzten Jahren mit dem Aufkommen neuer Techniken in der Mausgenetik, insbesondere bei Fehlbildungen, einen langen Weg zurückgelegt¹.

Retinsäure (RA) ist der In-vivo-Metabolit von Vitamin A². Vitamin-A-Mangel (VAD) ist mit einer Reihe schwerwiegender Multisystemerkrankungen verbunden, wie z. B. schlechtem Knochenumbau, Frakturen sowie kraniofazialen Fehlbildungen und Skelettfehlbildungen, die durch Zwergwuchs gekennzeichnet sind ^3,4 . Retinoid-Rezeptoren (RARs) sind entscheidende Transkriptionsfaktoren bei der Retinoid-Signalübertragung⁵. Es wurde eine dominant-negative RARα403-Mutante (dnRARα^{) entworfen 6} und ein Mausmodell etabliert, in dem Osteoblasten dnRARα exprimierten. Dies führte dazu, dass die Mäuse Zwergwuchs, kraniofaziale Deformitäten, eine unvollständige kortikale Knochenbildung und einen vermehrten, aber schlecht umgebauten trabekulären Knochen aufwiesen.

Die Mikrocomputertomographie (microCT) hat ein großes Potenzial für die Untersuchung von kraniomaxillofazialen Fehlbildungen. Es besitzt die Fähigkeit, die Evolution sowohl angeborener als auch erworbener Skelettanomalien in Nagetiermodellen zu erkennen und zu verfolgen. Die bildgebende Analyse der MikroCT bietet eine eingehende Untersuchung von kraniofazialen Wachstumsstörungen in genetisch veränderten Mausmodellen ^7,8 . Darüber hinaus erweist sich die 3D-Bildgebung als wichtiges Werkzeug zur Abgrenzung morphologischer Merkmale, das maßgeschneiderte Analyse- und Visualisierungsansätze ermöglicht⁹. Die Mikro-CT wurde in mehreren Studien zur Analyse kraniofazialer Phänotypen eingesetzt, einschließlich der Definition anatomischer Orientierungspunkte bei Menschen und Mäusen und der volumetrischen Analyse jedes kraniofazialen Knochens 10,11,12. Hier beschreiben wir detailliert eine auf der microCT-Technologie basierende Methode zur Trennung und Vermessung von 3D-Modellen von kraniomaxillofazialen Knochen von Mäusen, um eine bessere Bewertung und Analyse der kraniomaxillofazialen Skelettentwicklung von Mäusen zu ermöglichen, als dies mit aktuellen Methoden möglich ist.

Protokoll

Wir haben alle relevanten ethischen Vorschriften für Tierversuche und Forschung eingehalten. Alle Versuchstierverfahren wurden vom Institutional Animal Care and Research Advisory Committee des Shanghai Ninth People's Hospital, School of Medicine, Shanghai Jiaotong University, genehmigt.

Sowohl der hier verwendete Mäusestamm Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26^dn/dn) als auch der Mäusestamm Osterix-Cre (Osx^Cre) (Nr. 006361) wurden auf dem Hintergrund von C57BL/6 beibehalten. R26^dn/dn-Mäuse wurden mit Osx^Cre-Mäusen gekreuzt, um OSX^Cre zu erzeugen; R26^dn/dn-Mäuse . Alle Mäuse wurden unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gezüchtet und gehalten.

1. Zucht von Mäusen

HINWEIS: F bedeutet die Anzahl der Generationen von Mäusen; N bedeutet die Anzahl der Paarungsgenerationen zwischen zygotischen Mäusen und Hintergrundmäusen. Damit stellt F2+N sowohl die zweite Generation als auch alle nachfolgenden Mauszuchtprogramme dar. F0 steht für primäre Mäuse.

1. Paaren Sie eine geschlechtsreife männliche Maus mit einem Paar weiblicher Mäuse vergleichbaren Alters. Beginnen Sie nach einem anfänglichen Zeitraum von 18 Tagen mit täglichen Inspektionen für neugeborene Welpen. Wenn Sie trächtige Weibchen identifizieren, isolieren Sie sie gegebenenfalls, um eine optimale mütterliche Versorgung zu gewährleisten. Für den Fall, dass innerhalb eines Monats nach der ersten Paarung keine Trächtigkeiten beobachtet werden, sollten Sie in Betracht ziehen, die männliche Maus zwischen verschiedenen Zuchtaufbauten zu wechseln, um die Befruchtung zu fördern.
2. Kreuzen Sie R26^dn/dn-Mäusemit OSX^Cre-Mäusen (F0). Schneiden Sie die Schwänze für die Genotypisierung ab und behalten Sie das männliche ^{OSX Cre}; R26^dn/+Mäuse in Käfigen bis zur Geschlechtsreife, was einem Alter von ~6 Wochen entspricht (F1).
3. Kreuzen Sie das sechs Wochen alte männliche OSX^Cre; R26^dn/+-Mäuse mit weiblichen R26^{dn/dn-Mäusen}(F2). Schneiden Sie die Schwänze für die Genotypisierung ab und ersetzen Sie die alten Zuchtmäuse rechtzeitig durch jüngere Mäuse (F2+N).

2. Vorbereitung

1. Bereiten Sie vier Paare des 4 Wochen alten Osx^Cre, OSX^Cre vor; R26^dn/+ und OSX^Cre; R26^dn/dn-Mäuse . Euthanasieren Sie die Mäuse einzeln durch die Verabreichung von Kohlendioxid-Erstickung.
   HINWEIS: Um eine effiziente Euthanasie zu gewährleisten, sollte die CO_{2 -} Durchflussrate so eingestellt werden, dass jede Minute etwa 30 % des Käfigvolumens verdrängt werden. In einem Käfig mit den Maßen 45 cm x 30 cm x 30 cm wird beispielsweise eine Durchflussmenge von 40 l/min empfohlen.
2. Schneide den Hals der Maus mit einer Schere ab, während du ihren Körper festhältst, und lasse den Schädel intakt.
   HINWEIS: Um einen vollständigen Schädel zu erhalten, öffnen Sie den Mund der Maus, schneiden Sie mit einer Augenschere entlang des Mundwinkels, ziehen Sie beide Hände zu beiden Seiten und drehen Sie, um die Haut des Mauskopfes zu schälen.
3. Tauchen Sie die Mäuseschädel 48 h lang in 4% Paraformaldehyd und lagern Sie sie anschließend in 70% Ethanol.
   ACHTUNG: Paraformaldehyd ist giftig; Tragen Sie einen angemessenen Schutz.
4. Scannen Sie die gesammelten Schädel mit einem microCT-Scanner - Auflösung: 4,5 μm; Spannung: 70 kV; Strom: 114 μA; Filter: 0,5 mm Al; Rotationsschritt: 0,5°.
5. Speichern Sie CT-Scanbilder. Bilder im DICOM-Format werden für den Import in die Software ausgewählt und analysiert.

3. MicroCT-Bildgebung und 3D-Rekonstruktion

HINWEIS: Alle Knochen, die in dieser Studie verwendet wurden, wurden manuell segmentiert.

1. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf der Seite MASKEN und wählen Sie Neue Maske; Ein neuer Layer mit dem Namen Grün wird angezeigt.
2. Wählen Sie den Schwellenwertbereich von 671 bis 2.566 auf der Schwellenwertseite aus , die angezeigt wird. Wiederholen Sie diesen Vorgang für alle zugehörigen Layer. (Abbildung 1A).
3. Verwenden Sie das Radiergummi-Werkzeug im Menü "Bearbeiten ", um die am Unterkiefer befestigten Bones in jeder Ebene der 2D-Sagittalebene manuell zu löschen (Abbildung 1B).
4. Wählen Sie die Region des Unterkiefers auf der 2D-Sagittalebene aus, nachdem Sie auf die Option Region Growing geklickt haben (Abbildung 1C).
   ACHTUNG: Stellen Sie sicher, dass der Unterkieferbereich in jeder Schicht vollständig ausgewählt ist. Andernfalls kommt es nach der Rekonstruktion zu einem unvollständigen Unterkiefer.
5. Klicken Sie auf der Seite MASKEN auf die neu erstellte Ebene Unterkiefer und wählen Sie 3D berechnen aus dem Dropdown-Menü (Abbildung 1D).
6. Klicken Sie in der Benutzeroberfläche für 3D-Objekte mit der rechten Maustaste auf Unterkiefer, und klicken Sie auf Eigenschaften. Klicken Sie, um die Farbe zu ändern. Kennzeichnen Sie alle 3D-Modelle, die mit verschiedenen Knochen rekonstruiert wurden, farblich.
7. Klicken Sie auf Messen in der oberen linken Ecke und wählen Sie Entfernung aus dem erscheinenden Dropdown-Menü. Berechnen Sie die Länge , indem Sie Punkte im 3D-Bild markieren (Abbildung 1E).
   ACHTUNG: Die Referenz für die Messung der Knochenbreite ist die breiteste Stelle des Knochens.
8. Klicken Sie in der Benutzeroberfläche für 3D-Objekte mit der rechten Maustaste auf Unterkiefer, und klicken Sie auf Eigenschaften. Properties-Info-Volume-Modul zum Auslesen der rekonstruierten Volumenwerte für jeden kraniomaxillofazialen Knochenblock. (Abbildung 1F).
9. Messen Sie den Unterkiefer, das Stirnbein, das Scheitelbein, das Nasenbein, die Prämaxilla, den Oberkiefer, das Interparietalbein und das Hinterhauptbein auf die gleiche Weise wie oben und markieren Sie sie einzeln mit verschiedenen Farben.

4. Statistische Auswertung

1. Führen Sie statistische Analysen mit der Software Ihrer Wahl durch. Führen Sie zweiseitige Student's t-Tests durch (n = 4/Gruppe).
2. Verwenden Sie für alle Diagramme Fehlerbalken, um Standardabweichungen darzustellen. Betrachten Sie P-Werte < 0,05 als statistisch signifikant.

Ergebnisse

Umfangreiche Forschungsarbeiten unterstreichen die vielfältigen Auswirkungen genetischer Mutationen auf das Wachstum, die Entwicklung und die Organsysteme von Mäusen. Eine umfassende Bewertung der kraniofazialen Knochen in mutierten Mäusen erfordert aufgrund ihrer Grenzen Methoden, die über die Einzelgewebe- oder 2D-Bildanalyse hinausgehen. Daher ist die Aufklärung der kraniofazialen Knochenentwicklung von größter Bedeutung für die Erforschung kra...

Diskussion

MicroCT ist ein leistungsstarkes Werkzeug, um realistische und isotrope 3D-Informationen aus dichten und undurchsichtigen biologischen Proben mit Mikrometerauflösung zu erhalten. Die aus der MikroCT gewonnenen Daten sind hinsichtlich Geometrie und Intensität kalibriert, was sie besonders nützlich für quantitative Studien^macht 13,14,15,16,17.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GraphPad Prism 6.01 Software	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA	/
Micro-CT	Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA	/
Mimics Medical 19.0	Materialise, Leuven, Belgium	/
Osterix-Cre (OsxCre)	/	/	from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain	/	/	from the Columbia University, USA