使用三维显微计算机断层扫描分析小鼠颅颌面畸形

摘要

在这里，我们深入描述了一种基于显微计算机断层扫描的方法，用于分割和测量小鼠颅颌面骨的 3D 模型，以便比当前方法更好地评估小鼠颅颌面骨的发育。

摘要

为了模拟维生素 A 缺乏症 （VAD） 引起的颅面畸形，我们在成骨细胞中表达显性阴性类视黄醇受体突变，以特异性抑制小鼠的 RAR 转录活性。这种方法使我们能够研究 VAD 对临床病例颅骨矿化不足、下颌畸形和锁骨发育不全的影响。在这项研究中，小鼠颅颌面区域的显微计算机断层扫描 （microCT） 扫描是研究该动物模型生长发育的宝贵工具。手动估计图像既耗时又不准确。因此，在这里，我们提出了一种简单、高效和准确的方法来分割和量化每个颅颌面骨的 microCT 图像。采用 MicroCT 软件对小鼠的下颌骨、额骨、顶骨、鼻骨、前上颌骨、上颌骨、顶间骨和枕骨进行切片，并测量其相应的长度和宽度。这种分割方法可用于研究发育生物学、生物医学和其他相关科学中的生长和发育，并允许研究人员分析基因突变对单个颅面骨的影响。

引言

人类头骨和面部的复杂发育包括一个复杂的 3D 形态发生过程，由众多基因错综复杂地精心编排。这些基因在调节来自不同胚胎来源的组织的复杂性模式、增殖和分化中起着关键作用。这个高度协调的过程强调了人类颅面生长和发育的复杂性。由于发育异常而发生的颅面畸形（包括唇裂和腭裂、颅缝合闭合和面部发育不全）占所有先天性出生缺陷的三分之一以上。作为生物医学研究中常用的模型动物，小鼠具有复杂细腻的颅颌面骨骼结构，在解剖学和生理学上与人类颅颌面骨非常相似。近年来，随着小鼠遗传学新技术的出现，颅颌面发育生物学的研究取得了长足的进步，尤其是在畸形方面¹。

视黄酸 （RA） 是维生素 A² 的体内代谢物。维生素 A 缺乏症 （VAD） 与一系列严重的多系统疾病有关，例如骨重塑不良、骨折以及以侏儒症为特征的颅面畸形和骨骼畸形 ^3,4 。类视黄醇受体 （RAR） 是类视黄醇信号转导中的关键转录因子⁵。设计了一个显性阴性 RARα403 突变体 （dnRARα）⁶ 并建立了成骨细胞表达 dnRARα 的小鼠模型。这导致小鼠表现出侏儒症、颅面畸形、皮质骨形成不完全以及小梁骨增加但重塑不良。

显微计算机断层扫描 （microCT） 在颅颌面畸形研究方面具有巨大潜力。它具有检测和跟踪啮齿动物模型中先天性和获得性骨骼异常演变的能力。MicroCT 成像分析深入探讨了转基因小鼠模型中的颅面生长障碍 ^7,8。此外，3D 成像成为描绘形态学特征的重要工具，促进了量身定制的分析和可视化方法⁹。Micro-CT 已用于多项研究来分析颅面表型，包括定义人类和小鼠的解剖标志以及每个颅面骨的体积分析 10,11,12。在这里，我们详细描述了一种基于 microCT 技术的方法，用于分离和测量小鼠颅颌面骨骼的 3D 模型，从而能够比当前方法更好地评估和分析小鼠颅颌面骨骼发育。

研究方案

我们遵守了动物试验和研究的所有相关道德规定。所有实验动物程序均经上海交通大学医学院附属第九人民医院机构动物护理与研究咨询委员会批准。

此处使用的小鼠的 Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 菌株 （R26^dn/dn） 和 Osterix-Cre （Osx^Cre） （No.006361） 菌株均维持在 C57BL/6 背景上。 R26^dn/dn 小鼠与 Osx^Cre 小鼠杂交生成 OSX^Cre;R26^dn/dn 小鼠。所有小鼠均在无特定病原体 （SPF） 条件下饲养和维持。

1. 小鼠的繁殖

注:F 表示小鼠的世代数;N 表示合子小鼠和背景小鼠之间交配的世代数。因此，F2+N 代表第二代以及任何后续的小鼠育种计划。F0 表示原代小鼠。

1. 将一只性成熟的雄性小鼠与一对年龄相仿的雌性小鼠配对。在 18 天的初始阶段后开始对新生幼崽进行日常检查。在发现怀孕的雌性后，如有必要，对她们进行隔离，以确保最佳的孕产妇护理。如果在初始配对后的一个月内没有观察到怀孕，请考虑在不同的育种设置之间交替使用雄性小鼠以促进受精。
2. R26^dn/dn小鼠与 OSX^Cre 小鼠 （F0） 杂交。剪掉尾巴进行基因分型，保留雄性 OSX^Cre;R26^dn/+ 小鼠在笼子里直到性成熟，即 ~6 周龄 （F1）。
3. 杂交 6 周龄雄性 OSX^Cre;R26^dn/+ 小鼠与雌性 R26^dn/dn小鼠 （F2）。剪掉尾巴进行基因分型，并及时用年轻的小鼠替换旧的繁殖小鼠 （F2+N）。

2. 准备工作

1. 准备四对 4 周龄的 Osx^Cre、OSX^Cre;R26^dn/+ 和 OSX^Cre;R26^dn/dn 小鼠。通过施用二氧化碳窒息对小鼠单独实施安乐死。
   注意:为确保有效的安乐死，应调整 CO₂ 流速，以每分钟置换约 30% 的笼子体积。例如，在尺寸为 45 cm x 30 cm x 30 cm 的笼子中，建议流速为 40 L/min。
2. 握住老鼠的身体，用剪刀剪断老鼠的脖子，保持头骨完好无损。
   注意:要获得完整的头骨，请打开小鼠的嘴巴，用眼科剪刀沿着嘴角剪开，将双手向两侧拉，然后旋转以剥开小鼠头部的皮肤。
3. 将小鼠头骨浸入 4% 多聚甲醛中 48 小时，然后将它们储存在 70% 乙醇中。
   注意:多聚甲醛有毒;穿戴适当的防护装置。
4. 用 microCT 扫描仪扫描收集的头骨 - 分辨率:4.5 μm;电压:70 kV;电流:114 μA;过滤器:0.5 mm Al;旋转步长:0.5°。
5. 存储 CT 扫描图像。选择 DICOM 格式的图像以导入软件并进行分析。

3. MicroCT 成像和 3D 重建

注意:本研究中使用的所有骨骼都是手动分割的。

1. 在 MASKs 页面上单击鼠标右键，然后选择 New mask;此时将显示一个名为 Green 的新图层。
2. 在弹出的 阈值页面中选择 阈值范围 671-2,566。对所有相关图层重复此过程。（图 1A）。
3. 使用"编辑"菜单中的"橡皮擦"工具手动擦除 2D 矢状面上每层中附着在下颌骨上的骨骼（图 1B）。
4. 单击区域 增长 选项后，在 2D 矢状面上选择下颌骨区域（图 1C）。
   注意: 确保在每层中完全选择下颌区域;否则，重建后会导致下颌骨不完整。
5. 单击 MASKS 页面中新创建的 Mandible 层，然后从下拉菜单中选择 Calculate 3D（图 1D）。
6. 在 3D 对象 界面中，右键单击 Mandible 并单击 Properties 。单击以更改 Color。对用不同骨骼重建的所有 3D 模型进行颜色编码。
7. 单击左上角的 测量 ，然后从出现的下拉菜单中选择 距离 。通过在 3D 图像中标记点来计算 长度 （图 1E）。
   注意: 测量骨骼宽度的参考是骨骼最宽的部分。
8. 在 3D 对象 界面中，右键单击 Mandible 并单击 Properties 。 Properties-Info-Volume 模块读取每个颅颌面骨块的重建体积值。（图 1F）。
9. 用与上述相同的方法测量下颌骨、额骨、顶骨、鼻骨、前上颌骨、顶骨和枕骨，并用不同的颜色分别标记它们。

4. 统计分析

1. 使用所选软件执行统计分析。执行双尾学生 t 检验（n = 4/组）。
2. 对于所有图形，使用误差线表示标准差。考虑 P 值< 0.05 具有统计意义。

结果

广泛的研究强调了基因突变对小鼠生长、发育和器官系统的多方面影响。由于突变小鼠颅面骨的局限性，对突变小鼠颅面骨的全面评估需要超越单组织或 2D 图像分析的方法。因此，阐明颅面骨发育对于研究人类颅面疾病至关重要。

该方法为评估小鼠颅颌面骨的生长和发育提供了有用的工具（

讨论

MicroCT 是一种强大的工具，能够以微米级的分辨率从致密和不透明的生物样品中获取逼真的各向同性 3D 信息。从 microCT 获得的数据针对几何形状和强度进行了校准，使其特别适用于定量研究^{13、14、15、16、17}。它用于研究骨骼和牙齿的微观结构

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
GraphPad Prism 6.01 Software	GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA	/
Micro-CT	Quantum GX micro CT, PerkinElmer, Waltham, MA, USA	/
Mimics Medical 19.0	Materialise, Leuven, Belgium	/
Osterix-Cre (OsxCre)	/	/	from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain	/	/	from the Columbia University, USA