JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מתארים לעומק שיטה, המבוססת על טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת, לפלח ולמדוד מודלים תלת-ממדיים של עצמות קרניומקסילופציאליות בעכברים, להערכה טובה יותר של התפתחות עצם קרניומקסילופציאלית בעכברים ממה שמתאפשר בשיטות הנוכחיות.

Abstract

כדי למדל מומים גולגולתיים הנגרמים על ידי מחסור בוויטמין A (VAD), ביטאנו מוטציה דומיננטית-שלילית בקולטן רטינואיד באוסטאובלסטים כדי לעכב באופן ספציפי את פעילות שעתוק RAR בעכברים. גישה זו אפשרה לנו לחקור את ההשפעות של VAD על היפומינרליזציה גולגולתית, עיוות מנדיבולרי והיפופלזיה קלאביקולרית במקרים קליניים. במחקר זה, סריקת טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT) של אזור הקרניומה-לסת של עכברים ייצגה כלי רב ערך לחקר הצמיחה וההתפתחות של מודל בעלי חיים זה. הערכה ידנית של תמונות היא גם גוזלת זמן וגם לא מדויקת. לכן, כאן, אנו מציגים גישה פשוטה, יעילה ומדויקת לפילוח וכימות תמונות microCT של כל עצם craniomaxillofacial . תוכנת MicroCT שימשה לחיתוך הלסת התחתונה, העצם המצחית, העצם הקודקודית, עצם האף, הפרמקסילה, המקסילה, העצם הבין-קודקודית והעצם העורפית של עכברים ומדידת אורכם ורוחבם המתאימים. שיטת סגמנטציה זו יכולה להיות מיושמת לחקר גדילה והתפתחות בביולוגיה התפתחותית, ביו-רפואה ומדעים קשורים אחרים ומאפשרת לחוקרים לנתח את ההשפעות של מוטציות גנטיות על עצמות גולגולת בודדות.

Introduction

ההתפתחות המורכבת של הגולגולת והפנים האנושיות כוללת תהליך מורפוגנטי תלת-ממדי מתוחכם, המתוזמר באופן מורכב על ידי גנים רבים. גנים אלה ממלאים תפקיד מרכזי בוויסות הדפוסים המורכבים, ההתרבות וההתמיינות של רקמות שמקורן במקורות עובריים מגוונים. תהליך מתואם מאוד זה מדגיש את המורכבות של צמיחה והתפתחות גולגולתית אנושית. מומים קרניופציאליים (כולל שפה וחיך שסועים, סגירת תפר גולגולתי והיפופלזיה בפנים) המתרחשים כתוצאה מהפרעות התפתחותיות מהווים יותר משליש מכלל המומים המולדים. כחיית מודל נפוצה במחקר ביו-רפואי, העכבר הוא בעל מבנה עצם קרניומקסילופציאלי מורכב ועדין, הדומה מאוד לעצם הקרניומקסיו-לסת האנושית מבחינת אנטומיה ופיזיולוגיה. המחקר של ביולוגיה התפתחותית craniomaxillofacial עבר דרך ארוכה בשנים האחרונות עם כניסתן של טכניקות חדשות בגנטיקה של עכברים, במיוחד במומים1.

חומצה רטינואית (RA) היא מטבוליט in vivo של ויטמין A2. מחסור בוויטמין A (VAD) קשור למגוון הפרעות רב מערכתיות חמורות, כגון עיצוב מחדש של עצם ירודה, שברים, כמו גם מומים גולגולתיים ומומים בשלד המאופיינים בגמדות 3,4 . קולטני רטינואיד (RARs) הם גורמי שעתוק חיוניים באיתות רטינואיד5. מוטנט דומיננטי-שלילי RARα403 (dnRARα) תוכנן6 והוקם מודל עכבר שבו אוסטאובלסטים מבטאים dnRARα. זה גרם לעכברים להפגין גמדות, עיוותים גולגולתיים, היווצרות עצם קליפת המוח לא שלמה, ועצם טרבקולרית מוגברת אך משופצת בצורה גרועה.

טומוגרפיה מיקרו-ממוחשבת (microCT) יש פוטנציאל גדול לחקר מומים craniomaxillofacial . יש לו את היכולת לזהות ולעקוב אחר האבולוציה של הפרעות שלד מולדות ונרכשות במודלים של מכרסמים. ניתוח הדמיית MicroCT מציע חקירה מעמיקה של הפרעות גדילה גולגולתיות במודלים של עכברים מהונדסים גנטית 7,8. יתר על כן, הדמיה תלת-ממדית מתגלה ככלי חיוני לשרטוט תכונות מורפולוגיות, ומאפשרת גישות ניתוח והדמיה מותאמות אישית9. מיקרו-CT שימש במספר מחקרים לניתוח פנוטיפים גולגולתיים, כולל הגדרת ציוני דרך אנטומיים בבני אדם ובעכברים וניתוח נפחי של כל עצם גולגולתית 10,11,12. כאן, אנו מתארים בפירוט שיטה המבוססת על טכנולוגיית microCT להפריד ולמדוד מודלים תלת ממדיים של עצמות קרניומה-לסת של עכבר כדי לאפשר הערכה וניתוח טובים יותר של התפתחות השלד הקרניומקסילופציאלי של עכבר מאשר אפשרי בשיטות הנוכחיות.

Protocol

עמדנו בכל התקנות האתיות הרלוונטיות לניסויים ומחקר בבעלי חיים. כל ההליכים הניסיוניים בבעלי חיים אושרו על ידי הוועדה המייעצת לטיפול ומחקר מוסדי בבעלי חיים של בית החולים העממי התשיעי בשנחאי, בית הספר לרפואה, אוניברסיטת ג'יאוטונג בשנחאי.

הן זן Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 (R26dn/dn) והן זן Osterix-Cre (OsxCre) (No.006361) של עכברים שנעשה בו שימוש כאן נשמרו על רקע C57BL/6. עכברי R26 dn/dn הוצלבו עם עכברי OsxCre כדי ליצור OSXCre; עכבריR26 dn/dn. כל העכברים גודלו ותוחזקו בתנאים ספציפיים ללא פתוגן (SPF).

1. גידול עכברים

הערה: F פירושו מספר הדורות של עכברים; N פירושו מספר דורות ההזדווגות בין עכברים זיגוטיים לעכברי רקע. לפיכך, F2+N מייצג את הדור השני, כמו גם את כל תוכניות גידול העכבר הבאות. F0 פירושו עכברים ראשוניים.

  1. זוג עכבר זכר בוגר מינית עם זוג עכברים נקבות בגיל דומה. יש להתחיל בבדיקות יומיות לגורים שזה עתה נולדו לאחר תקופה ראשונית של 18 יום. עם זיהוי נקבות בהריון, בודדו אותן במידת הצורך כדי להבטיח טיפול אימהי. במקרה שלא נצפו הריונות בתוך חודש מהזיווג הראשוני, שקול להחליף את העכבר הזכר בין מערכי רבייה שונים כדי לקדם הפריה.
  2. עכבריR26 dn/dnעם עכבריOSX Cre (F0). קוצצים את הזנבות לגנוטיפ ושומרים על זכר OSX Cre; R26dn/+עכברים בכלובים עד לבגרות מינית, שהיא ~ 6 שבועות של גיל (F1).
  3. קרוס זכר בן שישה שבועות OSX Cre; עכבריR26 dn/+mice עם נקבות עכבריR26 dn/dn(F2). גזור את הזנבות לגנוטיפ והחלף את עכברי הרבייה הישנים בעכברים צעירים יותר בזמן (F2+N).

2. הכנה

  1. הכינו ארבעה זוגות של OsxCre בן 4 שבועות, OSXCre; R26dn/+ ו-OSXCre; עכבריR26 dn/dn. בנפרד המתת חסד את העכברים באמצעות הממשל של פחמן דו חמצני aspixiation.
    הערה: כדי להבטיח המתת חסד יעילה, יש לכוונן את קצב זרימת ה-CO2 כך שיזוז כ-30% מנפח הכלוב בכל דקה. לדוגמה, בכלוב בגודל 45 ס"מ x 30 ס"מ x 30 ס"מ, מומלץ קצב זרימה של 40 ליטר לדקה.
  2. חתכו את צוואר העכבר במספריים תוך כדי החזקת גופו, והותירו את הגולגולת שלמה.
    הערה: כדי לקבל גולגולת שלמה, פתח את פיו של העכבר, חתוך לאורך פינת הפה עם מספריים אופתלמיים, משוך את שתי הידיים לשני הצדדים וסובב כדי לקלף את עור ראשו של העכבר.
  3. לטבול את גולגולות העכבר 4% paraformaldehyde במשך 48 שעות, ולאחר מכן לאחסן אותם 70% אתנול.
    זהירות: Paraformaldehyde הוא רעיל; יש ללבוש הגנה מתאימה.
  4. סרוק את הגולגולות שנאספו באמצעות סורק microCT - רזולוציה: 4.5 מיקרומטר; מתח: 70 kV; זרם: 114 μA; סנן: 0.5 מ"מ Al; שלב סיבוב: 0.5°.
  5. אחסן תמונות סריקת CT. תמונות בתבנית DICOM נבחרות לייבוא לתוכנה ומנותחות.

3. הדמיית MicroCT ושחזור תלת מימד

הערה: כל העצמות ששימשו במחקר זה חולקו באופן ידני.

  1. לחץ על לחצן העכבר הימני בדף MASKs ובחר מסיכה חדשה; שכבה חדשה בשם ירוק מופיעה.
  2. בחר את טווח הסף של 671-2,566 בדף סף שמופיע. חזור על תהליך זה עבור כל השכבות הקשורות. (איור 1A).
  3. השתמשו בכלי מחק בתפריט 'עריכה ' כדי למחוק ידנית את העצמות המחוברות ללסת התחתונה בכל שכבה במישור הקשת הדו-ממדי (איור 1B).
  4. בחרו את האזור של הלסת התחתונה במישור הקשת הדו-ממדי לאחר לחיצה על האפשרות Region Growing (איור 1C).
    התראה: ודא שהאזור המנדיבולרי נבחר במלואו בכל שכבה; אחרת, זה יגרום לסת לא שלמה לאחר שחזור.
  5. לחצו על השכבה החדשה שנוצרה בדף MASKS ובחרו Calculate 3D מהתפריט הנפתח (איור 1D).
  6. בממשק אובייקטים תלת-ממדיים , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על Mandible ולחץ על מאפיינים. לחץ כדי לשנות צבע. קוד צבע כל המודלים 3D משוחזר עם עצמות שונות.
  7. לחץ על מדידה בפינה השמאלית העליונה ובחר מרחק מהתפריט הנפתח שמופיע. חשב את האורך על-ידי סימון נקודות בתמונה התלת-ממדית (איור 1E).
    זהירות: הייחוס למדידת רוחב העצם הוא החלק הרחב ביותר של העצם.
  8. בממשק האובייקטים התלת-ממדיים , לחץ באמצעות לחצן העכבר הימני על Mandible ולחץ על מאפיינים. מודול Properties-Info-Volume לקריאת ערכי הנפח המשוחזרים עבור כל גוש עצם קרניומה-לסת. (איור 1F).
  9. מדדו את הלסת התחתונה, העצם הקדמית, העצם הקודקודית, עצם האף, הפרמקסילה, המקסילה, העצם הבין-קודקודית והעצם העורפית באותו אופן כמו לעיל וסמנו אותם בנפרד בצבעים שונים.

4. ניתוח סטטיסטי

  1. בצע ניתוח סטטיסטי באמצעות התוכנה הנבחרת. בצע מבחני t דו-זנביים של תלמיד (n = 4/קבוצה).
  2. עבור כל התרשימים, השתמש בקווי שגיאה כדי לייצג סטיות תקן. שקול ערכי P < 0.05 מובהק סטטיסטית.

תוצאות

מחקר מקיף מדגיש את ההשפעה רבת הפנים של מוטציות גנטיות על גדילת עכברים, התפתחותם ומערכות איברים. הערכה מקיפה של עצמות גולגולת בעכברים מוטנטיים מחייבת שיטות מעבר לרקמה בודדת או ניתוח תמונה דו-ממדית בשל מגבלותיהן. לכן, להבהרת התפתחות עצם הגולגולת יש חשיבו...

Discussion

MicroCT הוא כלי רב עוצמה לקבלת מידע תלת ממדי מציאותי ואיזוטרופי מדגימות ביולוגיות צפופות ואטומות ברזולוציית מיקרומטר. הנתונים המתקבלים מ- microCT מכוילים עבור גיאומטריה ועוצמה, מה שהופך אותו שימושי במיוחד עבור מחקרים כמותיים 13,14,15,16,17.

Disclosures

למחברים אין ניגודי עניינים לחשוף.

Acknowledgements

עבודה זו נתמכה בחלקה על ידי מענקים מהקרן למדעי הטבע של מחוז היינאן של סין (824MS152).

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
GraphPad Prism 6.01 SoftwareGraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA/
Micro-CTQuantum GX micro CT, PerkinElmer,
Waltham, MA, USA		/
Mimics Medical 19.0 Materialise, Leuven, Belgium/
Osterix-Cre (OsxCre) //from the Jackson Laboratory
Rosa26-loxp-stop-loxp-dnRARα403 strain//from the Columbia University, USA

References

  1. Chai, Y., Maxson, R. E. Recent advances in craniofacial morphogenesis. Dev Dyn. 235 (9), 2353-2375 (2006).
  2. Mason, J. B., et al. Should universal distribution of high dose vitamin A to children cease. BMJ. 360, k927 (2018).
  3. Roulier, S., Rochette-Egly, C., Rebut-Bonneton, C., Porquet, D., Evain-Brion, D. Nuclear retinoic acid receptor characterization in cultured human trophoblast cells: Effect of retinoic acid on epidermal growth factor receptor expression. Mol Cell Endocrinol. 105 (2), 165-173 (1994).
  4. Hayes, K. C., Cousins, R. J. Vitamin A deficiency and bone growth. I. Altered drift patterns. Calcif Tissue Res. 6 (2), 120-132 (1970).
  5. Ghyselinck, N. B., Duester, G. Retinoic acid signaling pathways. Development. 146 (13), dev167502 (2019).
  6. Damm, K., Heyman, R. A., Umesono, K., Evans, R. M. Functional inhibition of retinoic acid response by dominant negative retinoic acid receptor mutants. Proc Natl Acad Sci U S A. 90 (7), 2989-2993 (1993).
  7. Ford-Hutchinson, A. F., Cooper, D. M., Hallgrímsson, B., Jirik, F. R. Imaging skeletal pathology in mutant mice by microcomputed tomography. J Rheumatol. 30 (12), 2659-2665 (2003).
  8. Brewer, S., Feng, W., Huang, J., Sullivan, S., Williams, T. Wnt1-cre-mediated deletion of ap-2alpha causes multiple neural crest-related defects. Dev Biol. 267 (1), 135-152 (2004).
  9. Wong, M. D., Dorr, A. E., Walls, J. R., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. A novel 3d mouse embryo atlas based on micro-ct. Development. 139 (17), 3248-3256 (2012).
  10. Motch Perrine, S. M., et al. Craniofacial divergence by distinct prenatal growth patterns in fgfr2 mutant mice. BMC Dev Biol. 14, 8 (2014).
  11. Percival, C. J., Huang, Y., Jabs, E. W., Li, R., Richtsmeier, J. T. Embryonic craniofacial bone volume and bone mineral density in fgfr2(+/p253r) and nonmutant mice. Dev Dyn. 243 (4), 541-551 (2014).
  12. Titiz, I., Laubinger, M., Keller, T., Hertrich, K., Hirschfelder, U. Repeatability and reproducibility of landmarks--a three-dimensional computed tomography study. Eur J Orthod. 34 (3), 276-286 (2012).
  13. Mizutani, R., Suzuki, Y. X-ray microtomography in biology. Micron. 43 (2-3), 104-115 (2012).
  14. Salomé, M., et al. A synchrotron radiation microtomography system for the analysis of trabecular bone samples. Med Phys. 26 (10), 2194-2204 (1999).
  15. Mizutani, R., et al. Three-dimensional microtomographic imaging of human brain cortex. Brain Res. 1199, 53-61 (2008).
  16. De Crespigny, A., et al. 3D micro-CT imaging of the postmortem brain. J Neurosci Methods. 171 (2), 207-213 (2008).
  17. Johnson, J. T., et al. Virtual histology of transgenic mouse embryos for high-throughput phenotyping. PLoS Genet. 2 (4), e61 (2006).
  18. Zou, W., Hunter, N., Swain, M. V. Application of polychromatic µct for mineral density determination. J Dent Res. 90 (1), 18-30 (2011).
  19. Neues, F., Epple, M. X-ray microcomputer tomography for the study of biomineralized endo- and exoskeletons of animals. Chem Rev. 108 (11), 4734-4741 (2008).
  20. Gabner, S., Böck, P., Fink, D., Glösmann, M., Handschuh, S. The visible skeleton 2.0: Phenotyping of cartilage and bone in fixed vertebrate embryos and foetuses based on x-ray microCT. Development. 147 (11), dev187633 (2020).
  21. Ermakova, O., Orsini, T., Gambadoro, A., Chiani, F., Tocchini-Valentini, G. P. Three-dimensional microCT imaging of murine embryonic development from immediate post-implantation to organogenesis: Application for phenotyping analysis of early embryonic lethality in mutant animals. Mamm Genome. 29 (3-4), 245-259 (2018).
  22. Wong, M. D., Maezawa, Y., Lerch, J. P., Henkelman, R. M. Automated pipeline for anatomical phenotyping of mouse embryos using micro-ct. Development. 141 (12), 2533-2541 (2014).
  23. Rajion, Z. A., et al. A three-dimensional computed tomographic analysis of the cervical spine in unoperated infants with cleft lip and palate. Cleft Palate Craniofac J. 43 (5), 513-518 (2006).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

215

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved