التحليل المجهري البؤري لفرز البروتين إلى البلازموديزما في نيكوتيانا بينثاميانا

Summary

يصف هذا البروتوكول اختيار واسمات البلازموديزم المثلى للتحليلات القائمة على الفحص المجهري متحد البؤر لاستهداف البروتين إلى البلازموديزما أثناء تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم.

Abstract

البلازموديزما هي مسام نانوية غشائية تربط سيتوبلازم الخلايا النباتية المجاورة وتمكن من الاتجار من خلية إلى أخرى بالمغذيات والجزيئات الكبيرة وكذلك الفيروسات الغازية. تلعب البلازموديزما أدوارا أساسية في تنظيم الاتصال بين الخلايا ، مما يساهم في تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين البلازموديزمي للبروتينات النباتية أو الفيروسية معلومات وظيفية مفيدة حول البروتين وهو مهم لفهم آليات تفاعلات الفيروسات النباتية. لتسهيل هذه الدراسات ، وصفنا بروتوكولا للتحليل القائم على الفحص المجهري متحد البؤر لمختلف البروتينات المستهدفة للبلازموديزمال لاختيار أفضل علامة بلازمودية لدراسة تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم. على وجه التحديد ، يتم توضيح تحليلات هذه الأحداث باستخدام بروتين الحركة من خلية إلى خلية (MP) لفيروس إزالة الوريد اللفت (TVCV) ، والبروتين الموضعي البلازموديزمي أرابيدوبسيس 5 (PDLP5) وبروتين ربط البلازموديزما كالوز 1 (PDCB1). يتم تحليل بيانات توطين البروتين البلازموديزمي بالتوازي مع التصور العالمي للبلازموديزما باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق للأنسجة التي تم أخذ عينات منها. يمكن تكييف هذه الأساليب بسهولة لتحليل توطين البلازموديزمي لأي بروتينات خلوية أو ممرضة في لسان النبات.

Introduction

تلعب البلازموديزما (PD) دورا أساسيا في التحكم في نمو النبات والاستجابات البيئية والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية من خلال تنظيم الاتصال بين الخلايا ^1,2. يتشكل PD في البداية أثناء التحريك الخلوي ، مع إدخال المئات من PD في الخلية الجديدة بين الخليتين الابنتين ، وبالتالي توفير قنوات الاتصال من خلية إلى خلية ^3,4. PD هو هيكل غني بالغشاء ، يحتوي على غشاء مشتق من الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وهو أنبوب عبر PD ، في الجزء المركزي من المسام التي يصطف عليها غشاء البلازما ^3,4....

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. نمو النبات

1. قم بزراعة بذور Nicotiana benthamiana في التربة الرطبة في غرفة بيئة خاضعة للرقابة عند 23 درجة مئوية تحت 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام.
2. بعد حوالي 2 أسابيع ، قم بنقل الشتلات بعناية مع كريات الخث حول جذورها إلى أواني أكبر واستمر في النمو في ظل نفس الظروف لمدة 4-5 أسابيع لتجارب التسلل الزراعي.
   ملاحظة: لا تستخدم النباتات عندما تبدأ في الإزهار ، حيث سيقل تراكم GFP في مرحلة الإزهار¹⁸.

2. بناء ناقل....

النتائج

لتسهيل دراسات وظيفة PD في فسيولوجيا النبات والتفاعلات مع مسببات الأمراض ، تم تطوير ثلاثة بروتينات مرجعية بسيطة وموثوقة لتوطين PD. تم اختيار اثنين من بروتينات PD الخلوية وبروتين MP مشتق من مسببات الأمراض مشفر بواسطة فيروس توبامو TVCV النباتي. تم تصور التوطين تحت الخلوي لهذه ال.......

Discussion

تتطلب أي دراسات بيولوجية للخلايا للاتصال بين الخلايا النباتية والنقل من خلية إلى خلية أثناء نمو النبات الطبيعي والتشكل ، وكذلك أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية ، اكتشاف ومراقبة فرز البروتينات - الداخلية والممرضة المشفرة - إلى الوصلات بين الخلايا النباتية ، ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S