A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول اختيار واسمات البلازموديزم المثلى للتحليلات القائمة على الفحص المجهري متحد البؤر لاستهداف البروتين إلى البلازموديزما أثناء تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم.

Abstract

البلازموديزما هي مسام نانوية غشائية تربط سيتوبلازم الخلايا النباتية المجاورة وتمكن من الاتجار من خلية إلى أخرى بالمغذيات والجزيئات الكبيرة وكذلك الفيروسات الغازية. تلعب البلازموديزما أدوارا أساسية في تنظيم الاتصال بين الخلايا ، مما يساهم في تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين البلازموديزمي للبروتينات النباتية أو الفيروسية معلومات وظيفية مفيدة حول البروتين وهو مهم لفهم آليات تفاعلات الفيروسات النباتية. لتسهيل هذه الدراسات ، وصفنا بروتوكولا للتحليل القائم على الفحص المجهري متحد البؤر لمختلف البروتينات المستهدفة للبلازموديزمال لاختيار أفضل علامة بلازمودية لدراسة تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم. على وجه التحديد ، يتم توضيح تحليلات هذه الأحداث باستخدام بروتين الحركة من خلية إلى خلية (MP) لفيروس إزالة الوريد اللفت (TVCV) ، والبروتين الموضعي البلازموديزمي أرابيدوبسيس 5 (PDLP5) وبروتين ربط البلازموديزما كالوز 1 (PDCB1). يتم تحليل بيانات توطين البروتين البلازموديزمي بالتوازي مع التصور العالمي للبلازموديزما باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق للأنسجة التي تم أخذ عينات منها. يمكن تكييف هذه الأساليب بسهولة لتحليل توطين البلازموديزمي لأي بروتينات خلوية أو ممرضة في لسان النبات.

Introduction

تلعب البلازموديزما (PD) دورا أساسيا في التحكم في نمو النبات والاستجابات البيئية والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية من خلال تنظيم الاتصال بين الخلايا 1,2. يتشكل PD في البداية أثناء التحريك الخلوي ، مع إدخال المئات من PD في الخلية الجديدة بين الخليتين الابنتين ، وبالتالي توفير قنوات الاتصال من خلية إلى خلية 3,4. PD هو هيكل غني بالغشاء ، يحتوي على غشاء مشتق من الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وهو أنبوب عبر PD ، في الجزء المركزي من المسام التي يصطف عليها غشاء البلازما 3,4....

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. نمو النبات

  1. قم بزراعة بذور Nicotiana benthamiana في التربة الرطبة في غرفة بيئة خاضعة للرقابة عند 23 درجة مئوية تحت 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام.
  2. بعد حوالي 2 أسابيع ، قم بنقل الشتلات بعناية مع كريات الخث حول جذورها إلى أواني أكبر واستمر في النمو في ظل نفس الظروف لمدة 4-5 أسابيع لتجارب التسلل الزراعي.
    ملاحظة: لا تستخدم النباتات عندما تبدأ في الإزهار ، حيث سيقل تراكم GFP في مرحلة الإزهار18.

2. بناء ناقل....

النتائج

لتسهيل دراسات وظيفة PD في فسيولوجيا النبات والتفاعلات مع مسببات الأمراض ، تم تطوير ثلاثة بروتينات مرجعية بسيطة وموثوقة لتوطين PD. تم اختيار اثنين من بروتينات PD الخلوية وبروتين MP مشتق من مسببات الأمراض مشفر بواسطة فيروس توبامو TVCV النباتي. تم تصور التوطين تحت الخلوي لهذه ال.......

Discussion

تتطلب أي دراسات بيولوجية للخلايا للاتصال بين الخلايا النباتية والنقل من خلية إلى خلية أثناء نمو النبات الطبيعي والتشكل ، وكذلك أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية ، اكتشاف ومراقبة فرز البروتينات - الداخلية والممرضة المشفرة - إلى الوصلات بين الخلايا النباتية ، ?.......

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم العمل في مختبر VC بمنح من NIH (R35GM144059) و NSF (MCB 1913165 و IOS 1758046) و BARD (IS-5276-20) إلى VC. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتفسيرها أو قرار النشر.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

References

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved