JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يصف هذا البروتوكول اختيار واسمات البلازموديزم المثلى للتحليلات القائمة على الفحص المجهري متحد البؤر لاستهداف البروتين إلى البلازموديزما أثناء تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم.

Abstract

البلازموديزما هي مسام نانوية غشائية تربط سيتوبلازم الخلايا النباتية المجاورة وتمكن من الاتجار من خلية إلى أخرى بالمغذيات والجزيئات الكبيرة وكذلك الفيروسات الغازية. تلعب البلازموديزما أدوارا أساسية في تنظيم الاتصال بين الخلايا ، مما يساهم في تطوير النبات ، والاستجابات البيئية ، والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية. يمكن أن يوفر اكتشاف توطين البلازموديزمي للبروتينات النباتية أو الفيروسية معلومات وظيفية مفيدة حول البروتين وهو مهم لفهم آليات تفاعلات الفيروسات النباتية. لتسهيل هذه الدراسات ، وصفنا بروتوكولا للتحليل القائم على الفحص المجهري متحد البؤر لمختلف البروتينات المستهدفة للبلازموديزمال لاختيار أفضل علامة بلازمودية لدراسة تفاعلات الفيروس والبلازموديزما أو نقل البلازموديزم. على وجه التحديد ، يتم توضيح تحليلات هذه الأحداث باستخدام بروتين الحركة من خلية إلى خلية (MP) لفيروس إزالة الوريد اللفت (TVCV) ، والبروتين الموضعي البلازموديزمي أرابيدوبسيس 5 (PDLP5) وبروتين ربط البلازموديزما كالوز 1 (PDCB1). يتم تحليل بيانات توطين البروتين البلازموديزمي بالتوازي مع التصور العالمي للبلازموديزما باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق للأنسجة التي تم أخذ عينات منها. يمكن تكييف هذه الأساليب بسهولة لتحليل توطين البلازموديزمي لأي بروتينات خلوية أو ممرضة في لسان النبات.

Introduction

تلعب البلازموديزما (PD) دورا أساسيا في التحكم في نمو النبات والاستجابات البيئية والتفاعلات مع مسببات الأمراض الفيروسية من خلال تنظيم الاتصال بين الخلايا 1,2. يتشكل PD في البداية أثناء التحريك الخلوي ، مع إدخال المئات من PD في الخلية الجديدة بين الخليتين الابنتين ، وبالتالي توفير قنوات الاتصال من خلية إلى خلية 3,4. PD هو هيكل غني بالغشاء ، يحتوي على غشاء مشتق من الشبكة الإندوبلازمية (ER) ، وهو أنبوب عبر PD ، في الجزء المركزي من المسام التي يصطف عليها غشاء البلازما 3,4. حددت النهج البروتينية المقارنة العديد من البروتينات الوظيفية PD ، بما في ذلك β-1،3-glucanases (BGs) ، سينسيز كالوز (CALSs) ، البروتينات الموجودة في البلازموديزما (PDLPs) ، البروتينات المرتبطة بالكالوز (PDCBs) ، بروتينات المنطقة عبر الغشاء المتعددة C2 (MCTPs) 3 ، والكينازات الشبيهة بالمستقبلات المتكررة الغنية بالليوسين (RLK) 5. في الآونة الأخيرة ، طور كيرك وآخرون أداة تسمى البلازموديزما في بروتين السيليكو 1 (PIP1) ، مما جعل من الممكن التنبؤ ببروتينات PD الجديدة في 22 نوعا نباتيا6. يختلف PD في النفاذية والهيكل أثناء تطوير النبات والاستجابة للضغوط المختلفة. يعد ترسب كالوز (β-1،3-جلوكان) والتحلل المائي في منطقة الرقبة المحيطة ب PD إحدى الآليات المعروفة على نطاق واسع للائحةPD 7.

يمكن للعديد من الميكروبات المسببة للأمراض ، بما في ذلك الفطريات والبكتيريا والفيروسات ، التلاعب بتمدد أو بنية PD أثناء العدوى2،8،9. Magnaporthe oryzae ، العامل المسبب لانفجار الأرز ، ينشر خيوط غازية داخل الخلايا للانتقال من خلية إلى أخرى من خلال PD8. أحد مسببات الأمراض البكتيرية Pseudomonas syringae pv. تتطلب الطماطم بروتين مستجيب HopO1-1 للحركة بين الخلايا وينتشر في النبات المضيف من خلال التفاعل مع PDLP7 وزعزعة استقراره ، وبالتالي زيادة التدفق الجزيئي في الخلايا المجاورة في Arabidopsis9. ومع ذلك ، فإن فيروسات النبات أكثر تنوعا في تنظيم مرض باركنسون أثناء انتقالها بين الخلايا ، حيث يعزز بروتين الحركة الفيروسية (MP) الحركة من خلية إلىخلية 2. نظرا لوظيفتها الهامة في تنظيم نمو النبات ونموه ، فضلا عن تفاعلها مع الميكروبات المسببة للأمراض النباتية ، اكتسبت PD اهتماما متزايدا في السنوات الأخيرة. في Arabidopsis thaliana ، هناك نوعان رئيسيان من البروتينات الوظيفية PD ، PDLPs (1-8) و PDCBs (1-5) ، والعديد منها ، على سبيل المثال ، PDLP51،10،11 ، PDLP112 ، PDLP613 ، PDLP714 ، و PDCB115 ، لعبت دورا في التلاعب بنفاذية PD من خلال تنظيم ترسب الكالوس. ومع ذلك ، وجد أن بعض PDLPs لديها تكرار وظيفي ، على سبيل المثال ، لم تؤثر طفرات الضربة القاضية ل pdlp1 و pdlp1,2 على الاتجار الجزيئي ، على الرغم من أن طفرات الضربة القاضية المزدوجة من pdlp1,3 و pdlp2,3 أظهرت زيادة نفاذية البلازموديزمال16. ومن المثير للاهتمام ، أن انخفاض التنظيم / خروج المغلوب أو الإفراط في التعبير عن PDLP5 وحده يؤدي إلى زيادة أو نقصان في نفاذية البلازموديزمال ، على التوالي 1,17. في الآونة الأخيرة ، وجد Li et al. أن PDLP5 و PDLP6 يعملان في واجهات خلوية مختلفة13. تشير هذه النتائج إلى أن PDLP5 قد يكون له وظائف غير زائدة عن الحاجة مع PDLPs الأخرى.

نظرا للوظيفة الحاسمة ل PD في التواصل بين الخلايا ، قمنا بتطوير بروتوكول لنشر بروتينات PD النباتية PDLP5 و PDCB1 وبروتين الحركة الفيروسية من خلية إلى خلية (MP) لفيروس إزالة الوريد اللفت (TVCV) كعلامات PD بسيطة ومريحة وموثوقة لتجربة بيولوجيا الخلية. لمزيد من التحقق ، استمر تصور PD باستخدام تلطيخ الأنيلين الأزرق للأنسجة التي تم أخذ عينات منها بالتوازي. يمكن تكييف البروتوكولات الموصوفة لتوطين PDLP5 و PDCB1 و TVCV MP بسهولة لتحليل توطين PD المحتمل لأي بروتينات خلوية أو مشتقة من مسببات الأمراض في النباتات الحية.

Protocol

تفاصيل الكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة مدرجة في جدول المواد.

1. نمو النبات

  1. قم بزراعة بذور Nicotiana benthamiana في التربة الرطبة في غرفة بيئة خاضعة للرقابة عند 23 درجة مئوية تحت 16 ساعة من الضوء و 8 ساعات من الظلام.
  2. بعد حوالي 2 أسابيع ، قم بنقل الشتلات بعناية مع كريات الخث حول جذورها إلى أواني أكبر واستمر في النمو في ظل نفس الظروف لمدة 4-5 أسابيع لتجارب التسلل الزراعي.
    ملاحظة: لا تستخدم النباتات عندما تبدأ في الإزهار ، حيث سيقل تراكم GFP في مرحلة الإزهار18.

2. بناء ناقلات

  1. استخدم تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم تسلسلات الترميز ذات الأهمية باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة Q5 واستنساخها في ناقل الدخول pDONR207 بواسطة تفاعل BP19 باستخدام مجموعة BP Clonase المتاحة تجاريا.
  2. نقل الجينات المستهدفة في بلازميدات الدخول الناتجة إلى ناقل الوجهة pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 بواسطة تفاعل LR19 باستخدام مجموعة LR Clonase المتاحة تجاريا لإنتاج البلازميدات مع علامة EGFP المنصهرة في النهاية C للبروتينات المستهدفة.
  3. تحقق من جميع الإنشاءات بواسطة PCR والتسلسل19.

3. التسلل الزراعي

  1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 خلايا تحتوي على ناقلات مختلفة على ألواح أجار LB وتحضن لمدة يومين تحت 28 درجة مئوية.
  2. انقل مستعمرة واحدة إلى 2 مل من مرق LB واحتضانها طوال الليل عند 28 درجة مئوية مع التقليب (250 دورة في الدقيقة).
  3. قم بإزالة 1 مل من المزرعة الليلية ، متبوعا بإضافة 4 مل من مرق LB الطازج ، وإعادة الزراعة لمدة ساعة واحدة في ظل نفس الظروف.
  4. اضبط التعليق البكتيري على OD600 = 0.1 (OD600 = 0.2 للتعبير المشترك لبروتينين) مع مخزن مؤقت للتسلل (MgCl2 ، 10 mM ؛ MES ، 10 مللي متر ، درجة الحموضة 5.6).
  5. امزج معلقات بكتيرية مختلفة بنسبة 1: 1 (v / v) لعمل تركيز نهائي من OD600 = 0.1. (اختياري).
  6. احتضان التعليق البكتيري في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات مع التحريض الناعم.
  7. تسلل إلى السطح المحوري للأوراق الموسعة بالكامل من نباتات مختلفة باستخدام حقنة عديمة الإبر سعة 1 مل ، وقم بتمييز المنطقة المتسللة (لون أغمق من الأنسجة المحيطة غير المخترقة) بقلم مقاوم للماء.
  8. انتقل إلى قسم الفحص المجهري متحد البؤر من هذا البروتوكول (الخطوة 5).
    ملاحظة: يمكن أيضا استخدام سلالات أخرى من Agrobacterium tumefaciens مناسبة لتحويل الأنواع النباتية ذات الأهمية.

4. أنيلين بلو وصمة عار

  1. أضف قسامة 200 ميكرولتر من 1٪ أزرق أنيلين (في 50 mM فوسفات البوتاسيوم العازلة ، درجة الحموضة 8.0) إلى شريحة المجهر20.
  2. قم باستئصال المنطقة المتسللة التي تبلغ حوالي 0.5 سم × 0.5 سم ، بعيدا عن الوريد ، بشفرة ، وانقل عينات أنسجة الأوراق إلى محلول الأنيلين الأزرق (الجانب المحوري لأعلى) على شريحة المجهر ، وتأكد من غمر عينات أنسجة الأوراق في محلول الأنيلين الأزرق ، ثم قم بتغطيتها بغطاء زجاجي (22 مم × 50 مم).
  3. ضع شرائح المجهر مع العينات في مجفف متصل بمضخة تفريغ وقم بإخلائها لمدة 2 دقيقة (<0.8 باسكال) ، متبوعا بإطلاق بطيء للضغط والحضانة في الظلام لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
  4. تصور إشارة الفلورسنت للأنيلين الأزرق تحت مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر باستخدام برنامج متوافق.
    ملاحظة: هنا ، تم استخدام طريقة تلطيخ الأنيلين الأزرق بواسطة Huang et al.20 . في تعديل لهذه التقنية ، تم إجراء نفس التجربة بدون خطوة فراغ 2 دقيقة ، مما أدى إلى نتائج مماثلة واقتراح أن التجفيف بالفراغ ليس ضروريا لتلطيخ الأنيلين. أيضا ، قد يختلف تركيز صبغة الأنيلين الزرقاء ووقت التلوين وفقا لمصدر أنسجة الأوراق ، إلخ.

5. المجهر متحد البؤر

  1. حصاد ورقتين من نباتين في نقاط زمنية مختلفة بعد التسلل. قطع منطقة التسلل إلى حوالي 0.5 سم × 0.5 سم شرائح بعيدا عن الوريد بشفرة.
    1. ضع عينات الأنسجة في قطرة من الماء المعقم (الجانب المحوري لأعلى) في الجزء المركزي من شريحة المجهر ، وقم بتغطيتها بغطاء زجاجي (22 مم × 50 مم) ، مع الحرص على تجنب الفقاعات.
  2. تأكد من أن الأطوال الموجية للإثارة للكشف عن إشارات CFP و GFP و RFP هي 405 نانومتر و 488 نانومتر و 561 نانومتر على التوالي ، وكانت مرشحات الانبعاث للكشف 410-602 نانومتر ل CFP ، و 400-602 نانومتر ل EGFP و RFP ، مع تعيين الثقب 1 AU و Master Gain على 769 فولت.
  3. تصور إشارة الفلورسنت لعلامات الفلورسنت الذاتي في المنطقة المخترقة باستخدام مجهر متحد البؤر للمسح بالليزر مع برنامج متوافق في 1 يوم و 2 أيام و 3 أيام و 5 أيام و 7 أيام و 10 أيام بعد التسلل.
    1. استخدم عدسة موضوعية 10x ومرشحات GFP لتحديد موقع الخلايا التي تحتوي على إشارة الفلورسنت ثم قم بالتبديل إلى عدسة موضوعية 40x لتصور التوطين تحت الخلوي وتسجيل الصور.
  4. اجمع 20 صورة لكل حالة ، باستخدام نسختين بيولوجيتين مستقلتين على الأقل.
  5. سجل توطين PD للبروتين المختبر بناء على المظهر التشخيصي للإشارة في محيط الخلية21,22.
    ملاحظة: عند اكتشاف التوطين تحت الخلوي لبروتين غير معروف ، يوصى باستخدام ثلاثة نباتات على الأقل.

6. تحليل البيانات

  1. استخدم برنامج فيجي لتقسيم القنوات وإضافة شريط المقياس إلى الصور للتصور.
  2. استخدم برنامج فيجي لتقسيم القنوات قبل قياس متوسط قيمة التدرج الرمادي لكل صورة لتقييم كثافة مضان GFP (ل MP و PDCB1 و PDLP5) أو CFP (لتلطيخ أزرق الأنيلين) في نقاط زمنية مختلفة.
  3. استخدم برنامج فيجي لتقسيم القنوات قبل تطبيع صور GFP (ل MP و PDCB1 و PDLP5) أو CFP (لتلطيخ أزرق الأنيلين). تم قياس مساحة الصورة ، وتم حساب PD puncta يدويا. تم حساب عدد نقاط PD لكل 100 ميكرومتر2 .
  4. استخدم ANOVA ثنائي الاتجاه مع اختبار المقارنات المتعددة ل Tukey23 لتحديد قيم P بين العينات المختلفة والنقاط الزمنية المختلفة باستخدام برنامج إحصائي ورسوم بيانية.
    ملاحظة: بالنسبة لصورة مضان أحادية القناة، تمثل قيمة التدرج الرمادي لكل بكسل شدة التألق لتلك النقطة24. هنا ، تم استخدام متوسط قيمة التدرج الرمادي لتقييم شدة التألق لكل عينة في نقاط زمنية مختلفة.

النتائج

لتسهيل دراسات وظيفة PD في فسيولوجيا النبات والتفاعلات مع مسببات الأمراض ، تم تطوير ثلاثة بروتينات مرجعية بسيطة وموثوقة لتوطين PD. تم اختيار اثنين من بروتينات PD الخلوية وبروتين MP مشتق من مسببات الأمراض مشفر بواسطة فيروس توبامو TVCV النباتي. تم تصور التوطين تحت الخلوي لهذه ال...

Discussion

تتطلب أي دراسات بيولوجية للخلايا للاتصال بين الخلايا النباتية والنقل من خلية إلى خلية أثناء نمو النبات الطبيعي والتشكل ، وكذلك أثناء التفاعلات بين مسببات الأمراض النباتية ، اكتشاف ومراقبة فرز البروتينات - الداخلية والممرضة المشفرة - إلى الوصلات بين الخلايا النباتية ، ?...

Disclosures

يعلن المؤلفون عدم وجود مصالح متنافسة.

Acknowledgements

تم دعم العمل في مختبر VC بمنح من NIH (R35GM144059) و NSF (MCB 1913165 و IOS 1758046) و BARD (IS-5276-20) إلى VC. لم يكن للممولين أي دور في تصميم الدراسة وجمع البيانات وتفسيرها أو قرار النشر.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

References

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21 (2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880 (2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128 (2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160 (2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496 (2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7 (2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378 (2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695 (2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved