Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Resumen

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Resumen

Los plasmodesmos son nanoporos membranosos que conectan el citoplasma de las células vegetales adyacentes y permiten el tráfico de nutrientes, macromoléculas y virus invasores de célula a célula. Los plasmodesmos desempeñan un papel fundamental en la regulación de la comunicación intercelular, contribuyendo al desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y las interacciones con los patógenos virales. El descubrimiento de la localización plasmodésmica de proteínas vegetales o virales podría proporcionar información funcional útil sobre la proteína y es importante para comprender los mecanismos de las interacciones planta-virus. Para facilitar estos estudios, describimos un protocolo para el análisis basado en microscopía confocal de diferentes proteínas diana plasmodesmales para seleccionar el mejor marcador plasmodesmal para estudiar las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal. Específicamente, los análisis de estos eventos se ilustran utilizando la proteína de movimiento de célula a célula (MP) del virus de limpieza de venas de nabo (TVCV), la proteína 5 localizada por plasmodesmos de Arabidopsis (PDLP5) y la proteína de unión a callosa 1 de Plasmodesmata (PDCB1). Los datos de localización del plasmodesma de proteínas se analizan en paralelo con la visualización global de plasmodesmos mediante tinción con azul de anilina de los tejidos muestreados. Estos enfoques se pueden adaptar fácilmente para analizar la localización plasmodésmica de cualquier proteína celular o patógena en la planta.

Introducción

Los plasmodesmos (PD) desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y las interacciones con patógenos virales a través de la regulación de la comunicación intercelular ^1,2. La EP se forma inicialmente durante la citocinesis, con cientos de PD insertados en la nueva célula entre las dos células hijas, suministrando así los canales para la comunicación de célula a célula ^3,4. La EP es una estructura rica en membranas, que contiene la membrana derivada del retículo....

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Crecimiento de las plantas

1. Cultive semillas de Nicotiana benthamiana en suelo húmedo en una cámara de ambiente controlado a 23 °C bajo 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
2. Después de aproximadamente 2 semanas, transfiera con cuidado las plántulas con los gránulos de turba alrededor de sus raíces a macetas más grandes y continúe el crecimiento en las mismas condiciones durante 4-5 semanas para los experimentos de agroinfiltración.
   NOTA: No ....

Discusión

Cualquier estudio biológico celular de la comunicación intercelular de las plantas y el transporte de célula a célula durante el desarrollo normal y la morfogénesis de las plantas, así como durante las interacciones entre plantas y patógenos, requiere la detección y el seguimiento de la clasificación de las proteínas, tanto endógenas como codificadas por patógenos, en las conexiones intercelulares de las plantas, los plasmodesmos (PD). Estos experimentos se verían facilitado.......

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S