Análisis microscópico confocal de la clasificación de proteínas a plasmodesmos en Nicotiana benthamiana

Resumen

Este protocolo describe la selección de marcadores plasmodesmales óptimos para análisis basados en microscopía confocal de proteínas dirigidas a plasmodesmos durante las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal.

Resumen

Los plasmodesmos son nanoporos membranosos que conectan el citoplasma de las células vegetales adyacentes y permiten el tráfico de nutrientes, macromoléculas y virus invasores de célula a célula. Los plasmodesmos desempeñan un papel fundamental en la regulación de la comunicación intercelular, contribuyendo al desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y las interacciones con los patógenos virales. El descubrimiento de la localización plasmodésmica de proteínas vegetales o virales podría proporcionar información funcional útil sobre la proteína y es importante para comprender los mecanismos de las interacciones planta-virus. Para facilitar estos estudios, describimos un protocolo para el análisis basado en microscopía confocal de diferentes proteínas diana plasmodesmales para seleccionar el mejor marcador plasmodesmal para estudiar las interacciones virus-plasmodesmos o el transporte plasmodesmal. Específicamente, los análisis de estos eventos se ilustran utilizando la proteína de movimiento de célula a célula (MP) del virus de limpieza de venas de nabo (TVCV), la proteína 5 localizada por plasmodesmos de Arabidopsis (PDLP5) y la proteína de unión a callosa 1 de Plasmodesmata (PDCB1). Los datos de localización del plasmodesma de proteínas se analizan en paralelo con la visualización global de plasmodesmos mediante tinción con azul de anilina de los tejidos muestreados. Estos enfoques se pueden adaptar fácilmente para analizar la localización plasmodésmica de cualquier proteína celular o patógena en la planta.

Introducción

Los plasmodesmos (PD) desempeñan un papel fundamental en el control del desarrollo de las plantas, las respuestas ambientales y las interacciones con patógenos virales a través de la regulación de la comunicación intercelular ^1,2. La EP se forma inicialmente durante la citocinesis, con cientos de PD insertados en la nueva célula entre las dos células hijas, suministrando así los canales para la comunicación de célula a célula ^3,4. La EP es una estructura rica en membranas, que contiene la membrana derivada del retículo endoplásmico (RE), un desmotúbulo trans-PD, en la parte central de los poros revestidos por la membrana plasmática ^3,4. Los enfoques proteómicos comparativos identificaron numerosas proteínas funcionales de la PD, incluidas las β-1,3-glucanasas (BG), las calosa sintasas (CALS), las proteínas localizadas en plasmodesmos (PDLP), las proteínas de unión a callosa (PDCB), las proteínas de la región transmembrana de múltiples dominios C2 (MCTP)³ y las quinasas similares a receptores repetidos (RLK) ricas en leucina5. Recientemente, Kirk et al. desarrollaron una herramienta denominada plasmodesmos en el proteoma in silico 1 (PIP1), que permitió predecir nuevas proteínas PD en 22 especies de plantas⁶. La DP varía en permeabilidad y estructura durante el desarrollo de la planta y la respuesta a diversos estreses. La deposición e hidrólisis de calosa (β-1,3-glucano) en la región del cuello que rodea la EP es uno de los mecanismos ampliamente conocidos de la regulación de la EP⁷.

Muchos microbios patógenos, incluidos hongos, bacterias y virus, pueden manipular la dilatación o la estructura de la EP durante su infección ^2,8,9. Magnaporthe oryzae, el agente causante del brusone del arroz, despliega hifas invasivas intracelulares para pasar de una célula a otra a través de PD⁸. Un patógeno bacteriano Pseudomonas syringae pv. El tomate requiere una proteína efectora HopO1-1 para el movimiento intercelular y la propagación en la planta huésped a través de la interacción y la desestabilización de PDLP7, aumentando así el flujo molecular en las células vecinas en Arabidopsis⁹. Sin embargo, los virus de plantas son más versátiles en la regulación de la EP durante su transmisión intercelular, con la proteína de movimiento viral (MP) promoviendo el movimiento de célula a célula². Debido a su importante función en la regulación del desarrollo y crecimiento de las plantas, así como a su interacción con los microbios fitopatógenos, la EP ha ganado cada vez más atención en los últimos años. En Arabidopsis thaliana, hay dos tipos principales de proteínas funcionales de la EP, PDLP (1-8) y PDCB (1-5), y se encontró que muchas de ellas, por ejemplo, PDLP5 ^1,10,11, PDLP1¹², PDLP6¹³, PDLP7¹⁴ y PDCB1¹⁵, desempeñan un papel en la manipulación de la permeabilidad de la PD a través de la regulación de la deposición de calosa. Sin embargo, se encontró que algunos PDLPs tenían una redundancia funcional, por ejemplo, los mutantes knockout de pdlp1 y pdlp1,2 no afectaron el tráfico molecular, aunque los mutantes knockout dobles de pdlp1,3 y pdlp2,3 mostraron una mayor permeabilidad plasmodésmica¹⁶. Curiosamente, la regulación a la baja/knockout o la sobreexpresión de PDLP5 por sí sola da lugar a un aumento o disminución de la permeabilidad plasmodésica, respectivamente ^1,17. Recientemente, Li et al. han encontrado que PDLP5 y PDLP6 funcionan en diferentes interfaces celulares¹³. Estos resultados indican que PDLP5 podría tener funciones no redundantes con otros PDLP.

Debido a la función crítica de la EP en la comunicación intercelular, desarrollamos un protocolo para desplegar las proteínas PDLP5 y PDCB1 de las plantas y la proteína de movimiento viral de célula a célula (MP) del virus de limpieza de venas de nabo (TVCV) como marcadores de EP simples, convenientes y confiables para la experimentación en biología celular. Para una mayor verificación, se procedió en paralelo a la visualización de la DP mediante la tinción con azul de anilina de los tejidos muestreados. Los protocolos descritos para la localización de PD de PDLP5, PDCB1 y TVCV MP se pueden adaptar fácilmente para analizar la posible localización de PD de cualquier proteína celular o derivada de patógenos en plantas vivas.

Protocolo

Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.

1. Crecimiento de las plantas

1. Cultive semillas de Nicotiana benthamiana en suelo húmedo en una cámara de ambiente controlado a 23 °C bajo 16 h de luz y 8 h de oscuridad.
2. Después de aproximadamente 2 semanas, transfiera con cuidado las plántulas con los gránulos de turba alrededor de sus raíces a macetas más grandes y continúe el crecimiento en las mismas condiciones durante 4-5 semanas para los experimentos de agroinfiltración.
   NOTA: No utilice las plantas cuando comiencen a florecer, ya que la acumulación de GFP disminuirá en la etapa de inflorescencia¹⁸.

2. Construcción vectorial

1. Utilice la PCR para amplificar las secuencias codificantes de interés con la ADN polimerasa de alta fidelidad Q5 y clonarlas en el vector de entrada pDONR207 mediante la reacción BP¹⁹ utilizando un kit de clonasa BP disponible en el mercado.
2. Transfiera los genes diana de los plásmidos de entrada resultantes al vector de destino pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 mediante la reacción^{LR 19} utilizando un kit de clonasa LR disponible en el mercado para producir plásmidos con la etiqueta EGFP fusionada con el extremo C-terminal de las proteínas diana.
3. Verificar todos los constructos por PCR y secuenciación¹⁹.

3. Agroinfiltración

1. Estrías de células de Agrobacterium tumefaciens EHA105 que contienen diferentes vectores en placas de agar LB e incubadas durante 2 días a 28 °C.
2. Transfiera una sola colonia a 2 mL de caldo LB e incube durante la noche a 28 °C con agitación (250 rpm).
3. Retirar 1 mL del cultivo durante la noche, seguido de la adición de 4 mL de caldo LB fresco, y recultivar durante 1 h en las mismas condiciones.
4. Ajuste la suspensión bacteriana a DE₆₀₀ = 0,1 (DE₆₀₀ = 0,2 para la coexpresión de dos proteínas) con tampón de infiltración (MgCl₂, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
5. Mezclar diferentes suspensiones bacterianas en una proporción de 1:1 (v/v) para obtener una concentración final de OD₆₀₀ = 0,1. (Opcional).
6. Incubar la suspensión bacteriana a temperatura ambiente durante 3 h con agitación suave.
7. Infiltre la superficie abaxial de las hojas completamente expandidas de diferentes plantas con una jeringa desechable sin aguja de 1 ml y marque el área infiltrada (un color más oscuro que el tejido circundante no infiltrado) con un bolígrafo a prueba de agua.
8. Continúe con la sección Microscopía confocal de este protocolo (paso 5).
   NOTA: También se pueden utilizar otras cepas de Agrobacterium tumefaciens adecuadas para la transformación de especies vegetales de interés.

4. Mancha azul de anilina

1. Añadir una alícuota de 200 μL de azul de anilina al 1% (en tampón de fosfato potásico de 50 mM, pH 8,0) a un portaobjetos de microscopio²⁰.
2. Extirpar el área infiltrada de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm, lejos de la vena, con una cuchilla, y transferir las muestras de tejido foliar a la solución de azul de anilina (lado abaxial hacia arriba) en el portaobjetos del microscopio, y asegúrese de que las muestras de tejido foliar estén sumergidas en la solución de azul de anilina, y luego cúbrala con un cubreobjetos (22 mm x 50 mm).
3. Coloque los portaobjetos del microscopio con las muestras en un desecador conectado a una bomba de vacío y evacúe durante 2 min (<0,8 Pa), seguido de una liberación lenta de la presión e incubación en la oscuridad durante 30 min a temperatura ambiente.
4. Visualice la señal fluorescente del azul de anilina bajo un microscopio confocal de barrido láser con software compatible.
   NOTA: En este caso se utilizó el método de tinción con azul de anilina de Huang et ^al.20 . En una modificación de esta técnica, se realizó el mismo experimento sin el paso de vacío de 2 minutos, produciendo resultados similares y sugiriendo que el secado al vacío no es esencial para la tinción con anilina. Además, la concentración de la tinción de azul de anilina y el tiempo de tinción pueden variar según la fuente del tejido de la hoja, etc.

5. Microscopía confocal

1. Coseche dos hojas de dos plantas en diferentes momentos después de la infiltración. Corta la zona de infiltración en rodajas de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm de la vena con una cuchilla.
   1. Coloque las muestras de tejido en una gota de agua estéril (con el lado abaxial hacia arriba) en la parte central de un portaobjetos de microscopio y cúbralas con un cubreobjetos (22 mm x 50 mm), teniendo cuidado de evitar burbujas.
2. Asegúrese de que las longitudes de onda de excitación para la detección de señales CFP, GFP y RFP sean de 405 nm, 488 nm y 561 nm, respectivamente, y que los filtros de emisión para la detección sean de 410-602 nm para CFP y de 400-602 nm para EGFP y RFP, con el agujero de alfiler 1 UA y la ganancia maestra establecida en 769 V.
3. Visualice la señal fluorescente de las etiquetas autofluorescentes en el área infiltrada utilizando un microscopio confocal de barrido láser con software compatible 1 día, 2 días, 3 días, 5 días, 7 días y 10 días después de la infiltración.
   1. Utilice una lente de objetivo de 10x y filtros GFP para localizar las células con la señal fluorescente y, a continuación, cambie a una lente de objetivo de 40x para la visualización de la localización subcelular y la grabación de imágenes.
4. Recoja 20 imágenes para cada afección, utilizando al menos dos réplicas biológicas independientes.
5. Puntuación de la localización de la PD de la proteína ensayada en función del aspecto punteado diagnóstico de la señal en la periferia de la célula^21,22.
   NOTA: Al detectar la localización subcelular de una proteína desconocida, se recomienda utilizar al menos tres plantas.

6. Análisis de datos

1. Utilice el software Fiji para dividir los canales y añadir la barra de escala a las imágenes para su visualización.
2. Utilice el software Fiji para dividir los canales antes de medir el valor medio de la escala de grises de cada imagen para evaluar la intensidad de fluorescencia GFP (para MP, PDCB1 y PDLP5) o CFP (para tinción con azul de anilina) en diferentes puntos temporales.
3. Utilice el software Fiji para dividir los canales antes de la normalización de las imágenes de GFP (para MP, PDCB1 y PDLP5) o CFP (para la tinción con azul de anilina). Se midió el área de la imagen y se contaron manualmente los puntos de DP. Se calculó el número de puntos de PD por 100 μm² .
4. Utilice el ANOVA de dos factores con la prueba de comparaciones múltiples²³ de Tukey para determinar los valores P entre las diferentes muestras y los diferentes puntos de tiempo con software estadístico y gráfico.
   NOTA: Para una imagen de fluorescencia de un solo canal, el valor de la escala de grises de cada píxel representa la intensidad de fluorescencia de ese punto²⁴. Aquí, se utilizó el valor medio de la escala de grises para evaluar la intensidad de fluorescencia de cada muestra en diferentes puntos temporales.

Resultados

Para facilitar los estudios de la función de la EP en la fisiología de las plantas y las interacciones con los patógenos, se desarrollaron tres proteínas de referencia sencillas y fiables para la localización de la EP. Se seleccionaron dos proteínas PD celulares y una proteína MP derivada del patógeno codificada por el tobamovirus vegetal TVCV. La localización subcelular de estas proteínas se visualizó utilizando un EGFP reportero autofluorescente fusionado con el extremo C-te...

Discusión

Cualquier estudio biológico celular de la comunicación intercelular de las plantas y el transporte de célula a célula durante el desarrollo normal y la morfogénesis de las plantas, así como durante las interacciones entre plantas y patógenos, requiere la detección y el seguimiento de la clasificación de las proteínas, tanto endógenas como codificadas por patógenos, en las conexiones intercelulares de las plantas, los plasmodesmos (PD). Estos experimentos se verían facilitado...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S