Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.
Данный протокол описывает выбор оптимальных плазмодезальных маркеров для анализа нацеливания белков на плазмодесматы на основе конфокальной микроскопии во время взаимодействия вирус-плазмодесмат или плазмодесмального транспорта.
Плазмодесматы представляют собой мембранные нанопоры, которые соединяют цитоплазму соседних растительных клеток и обеспечивают межклеточный трафик питательных веществ, макромолекул, а также вторгающихся вирусов. Плазмодесматы играют фундаментальную роль в регуляции межклеточной коммуникации, способствуя развитию растений, реакциям окружающей среды и взаимодействию с вирусными патогенами. Обнаружение плазмодесмальной локализации растительных или вирусных белков может предоставить полезную функциональную информацию о белке и важно для понимания механизмов взаимодействия растений и вирусов. Чтобы облегчить эти исследования, мы описываем протокол анализа различных плазмодесмальных белков-мишеней на основе конфокальной микроскопии для выбора наилучшего плазмодесального маркера для изучения взаимодействия вирус-плазмодесмат или плазмодесмального транспорта. В частности, анализ этих событий проиллюстрирован с использованием белка межклеточного движения (MP) вируса очистки вен репы (TVCV), локализованного белка 5 плазмодесматы Arabidopsis (PDLP5) и каллозного связывающего белка 1 Plasmodesmata (PDCB1). Данные плазмодесальной локализации белков анализируются параллельно с глобальной визуализацией плазмодесмат с использованием анилинового синего окрашивания тканей образца. Эти подходы могут быть легко адаптированы для анализа плазмодесмальной локализации любых клеточных или патогенных белков в подорожке.
Плазмодесматы (ФД) играют фундаментальную роль в контроле развития растений, реакциях окружающей среды и взаимодействии с вирусными патогенами посредством регуляции межклеточной коммуникации 1,2. ФД первоначально образуется во время цитокинеза, при этом сотни ФД встраиваются в новую клетку между двумя дочерними клетками, обеспечивая таким образом каналы для межклеточной коммуникации 3,4. ФД представляет собой богатую мембраной структуру, содержащую мембрану, полученную из эндоплазматического ретикулума (ЭР), транс-ФД-десмотубулу, в центральной части пор, выстланных плазматической мембраной 3,4. Сравнительные протеомные подходы идентифицировали многочисленные функциональные белки БП, включая β-1,3-глюканазы (БГ), каллоз-синтазы (КАЛС), белки, расположенные в плазмодесматах (ПДЛП), каллез-связывающие белки (ПДКБ), белки трансмембранной области с множественными С2-доменами (MCTP)3 и богатые лейцином повторные рецептороподобные киназы (РЛК)5. Недавно Kirk et al. разработали инструмент под названием plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), который позволил предсказать новые белки PD у 22 видов растений6. PD изменяется по проницаемости и структуре в процессе развития растений и реакции на различные нагрузки. Отложение каллозы (β-1,3-глюкан) и гидролиз в области шейки, окружающей ПД, является одним из широко известных механизмов регуляции ПД7.
Многие патогенные микробы, включая грибы, бактерии и вирусы, могут манипулировать расширением или структурой БП во время их инфекции 2,8,9. Magnaporthe oryzae, возбудитель рисового бласта, развертывает внутриклеточные инвазивные гифы для перемещения от клетки к клетке через PD8. Бактериальный патоген Pseudomonas syringae pv. Томату требуется эффекторный белок HopO1-1 для межклеточного перемещения и распространения в растении-хозяине через взаимодействие и дестабилизацию PDLP7, тем самым увеличивая молекулярный поток в соседних клетках у Arabidopsis9. Тем не менее, растительные вирусы более универсальны в регуляции БП во время их межклеточной передачи, при этом белок движения вируса (МП) способствует перемещению от клетки к клетке2. Благодаря их важной функции в регулировании развития и роста растений, а также их взаимодействия с патогенными микробами растений, БП привлекают все большее внимание в последние годы. У Arabidopsis thaliana существует два основных типа функциональных белков PD, PDLP (1-8) и PDCB (1-5), и было обнаружено, что многие из них, например, PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 и PDCB115, играют роль в манипулировании проницаемостью PD посредством регуляции отложения каллозы. Тем не менее, было обнаружено, что некоторые PDLP обладают функциональной избыточностью, например, нокаутные мутанты pdlp1 и pdlp1,2 не влияли на молекулярный транспорт, хотя двойные нокаутные мутанты pdlp1,3 и pdlp2,3 показали повышенную плазмодесмальнуюпроницаемость16. Интересно, что подавление/нокаут или сверхэкспрессия PDLP5 в отдельности приводит к увеличению или уменьшению плазмодесальной проницаемости, соответственно 1,17. Недавно Li et al. обнаружили, что PDLP5 и PDLP6 функционируют на различных клеточных интерфейсах13. Эти результаты указывают на то, что PDLP5 может иметь неизбыточные функции с другими PDLP.
В связи с важной функцией БП в межклеточной коммуникации мы разработали протокол для развертывания растительных белков PDLP5 и PDCB1, а также вирусного белка межклеточного движения (MP) вируса очистки вен репы (TVCV) в качестве простых, удобных и надежных маркеров PD для экспериментов в области клеточной биологии. Для дальнейшей верификации параллельно продолжалась визуализация БП с помощью анилинового синего окрашивания отобранных тканей. Описанные протоколы локализации БП PDLP5, PDCB1 и TVCV MP могут быть легко адаптированы для анализа потенциальной локализации БП любых клеточных или патогенных белков в живых растениях.
Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.
1. Рост растений
2. Векторное построение
3. Агроинфильтрация
4. Анилиновый синий морилка
5. Конфокальная микроскопия
6. Анализ данных
Для облегчения изучения функции БП в физиологии растений и взаимодействия с патогенами были разработаны три простых и надежных референсных белка для локализации БП. Были выбраны два клеточных белка PD и патогенный MP-белок, кодируемый растительным тобамовирусом TVCV. Су...
Любые клеточные биологические исследования межклеточной коммуникации растений и межклеточного транспорта при нормальном развитии растений и морфогенезе, а также при взаимодействии растений с патогенами требуют обнаружения и мониторинга сортировки белков, как энд...
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.
Работа в лаборатории VC была поддержана грантами NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 и IOS 1758046) и BARD (IS-5276-20) для VC. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и интерпретации данных, а также в принятии решения о публикации.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
ABT AC 1 phase motor | BRANDTECH | ABF63/4C-7RQ | |
Agrobacterium tumefaciens EHA105 | |||
Contamination control | CCI | ||
Gateway BP Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11789020 | |
Gateway LR Clonase II Enzyme mix | Invitrogen | #11791020 | |
GraphPad Prism 8.0.1. | GraphPad Software Inc. | ||
Image J | National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation | ||
Laser scanning confocal microscope | Zeiss | LSM 900 | |
Nicotiana benthamiana | Plant species | ||
pDONR207 | Invitrogen | #12213013 | |
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase | NEB | #M0491S |
Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи
Запросить разрешениеСмотреть дополнительные статьи
This article has been published
Video Coming Soon
Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены