Конфокальный микроскопический анализ сортировки белков по плазмодесматам у Nicotiana benthamiana

Резюме

Данный протокол описывает выбор оптимальных плазмодезальных маркеров для анализа нацеливания белков на плазмодесматы на основе конфокальной микроскопии во время взаимодействия вирус-плазмодесмат или плазмодесмального транспорта.

Аннотация

Плазмодесматы представляют собой мембранные нанопоры, которые соединяют цитоплазму соседних растительных клеток и обеспечивают межклеточный трафик питательных веществ, макромолекул, а также вторгающихся вирусов. Плазмодесматы играют фундаментальную роль в регуляции межклеточной коммуникации, способствуя развитию растений, реакциям окружающей среды и взаимодействию с вирусными патогенами. Обнаружение плазмодесмальной локализации растительных или вирусных белков может предоставить полезную функциональную информацию о белке и важно для понимания механизмов взаимодействия растений и вирусов. Чтобы облегчить эти исследования, мы описываем протокол анализа различных плазмодесмальных белков-мишеней на основе конфокальной микроскопии для выбора наилучшего плазмодесального маркера для изучения взаимодействия вирус-плазмодесмат или плазмодесмального транспорта. В частности, анализ этих событий проиллюстрирован с использованием белка межклеточного движения (MP) вируса очистки вен репы (TVCV), локализованного белка 5 плазмодесматы Arabidopsis (PDLP5) и каллозного связывающего белка 1 Plasmodesmata (PDCB1). Данные плазмодесальной локализации белков анализируются параллельно с глобальной визуализацией плазмодесмат с использованием анилинового синего окрашивания тканей образца. Эти подходы могут быть легко адаптированы для анализа плазмодесмальной локализации любых клеточных или патогенных белков в подорожке.

Введение

Плазмодесматы (ФД) играют фундаментальную роль в контроле развития растений, реакциях окружающей среды и взаимодействии с вирусными патогенами посредством регуляции межклеточной коммуникации ^1,2. ФД первоначально образуется во время цитокинеза, при этом сотни ФД встраиваются в новую клетку между двумя дочерними клетками, обеспечивая таким образом каналы для межклеточной коммуникации ^3,4. ФД представляет собой богатую мембраной структуру, содержащую мембрану, полученную из эндоплазматического ретикулума (ЭР), транс-ФД-д....

протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Рост растений

1. Выращивайте семена Nicotiana benthamiana во влажной почве в камере с контролируемой средой при температуре 23 °C при 16 ч света и 8 ч в темноте.
2. Примерно через 2 недели осторожно перенесите рассаду с торфяными гранулами вокруг корней в горшки большего размера и продолжайте рост в тех же условиях в течение 4-5 недель для экспериментов по агроинфильтрации.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте растения, когда они начинают ц....

Результаты

Для облегчения изучения функции БП в физиологии растений и взаимодействия с патогенами были разработаны три простых и надежных референсных белка для локализации БП. Были выбраны два клеточных белка PD и патогенный MP-белок, кодируемый растительным тобамовирусом TVCV. Су.......

Обсуждение

Любые клеточные биологические исследования межклеточной коммуникации растений и межклеточного транспорта при нормальном развитии растений и морфогенезе, а также при взаимодействии растений с патогенами требуют обнаружения и мониторинга сортировки белков, как энд.......

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S