JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Данный протокол описывает выбор оптимальных плазмодезальных маркеров для анализа нацеливания белков на плазмодесматы на основе конфокальной микроскопии во время взаимодействия вирус-плазмодесмат или плазмодесмального транспорта.

Аннотация

Плазмодесматы представляют собой мембранные нанопоры, которые соединяют цитоплазму соседних растительных клеток и обеспечивают межклеточный трафик питательных веществ, макромолекул, а также вторгающихся вирусов. Плазмодесматы играют фундаментальную роль в регуляции межклеточной коммуникации, способствуя развитию растений, реакциям окружающей среды и взаимодействию с вирусными патогенами. Обнаружение плазмодесмальной локализации растительных или вирусных белков может предоставить полезную функциональную информацию о белке и важно для понимания механизмов взаимодействия растений и вирусов. Чтобы облегчить эти исследования, мы описываем протокол анализа различных плазмодесмальных белков-мишеней на основе конфокальной микроскопии для выбора наилучшего плазмодесального маркера для изучения взаимодействия вирус-плазмодесмат или плазмодесмального транспорта. В частности, анализ этих событий проиллюстрирован с использованием белка межклеточного движения (MP) вируса очистки вен репы (TVCV), локализованного белка 5 плазмодесматы Arabidopsis (PDLP5) и каллозного связывающего белка 1 Plasmodesmata (PDCB1). Данные плазмодесальной локализации белков анализируются параллельно с глобальной визуализацией плазмодесмат с использованием анилинового синего окрашивания тканей образца. Эти подходы могут быть легко адаптированы для анализа плазмодесмальной локализации любых клеточных или патогенных белков в подорожке.

Введение

Плазмодесматы (ФД) играют фундаментальную роль в контроле развития растений, реакциях окружающей среды и взаимодействии с вирусными патогенами посредством регуляции межклеточной коммуникации 1,2. ФД первоначально образуется во время цитокинеза, при этом сотни ФД встраиваются в новую клетку между двумя дочерними клетками, обеспечивая таким образом каналы для межклеточной коммуникации 3,4. ФД представляет собой богатую мембраной структуру, содержащую мембрану, полученную из эндоплазматического ретикулума (ЭР), транс-ФД-десмотубулу, в центральной части пор, выстланных плазматической мембраной 3,4. Сравнительные протеомные подходы идентифицировали многочисленные функциональные белки БП, включая β-1,3-глюканазы (БГ), каллоз-синтазы (КАЛС), белки, расположенные в плазмодесматах (ПДЛП), каллез-связывающие белки (ПДКБ), белки трансмембранной области с множественными С2-доменами (MCTP)3 и богатые лейцином повторные рецептороподобные киназы (РЛК)5. Недавно Kirk et al. разработали инструмент под названием plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), который позволил предсказать новые белки PD у 22 видов растений6. PD изменяется по проницаемости и структуре в процессе развития растений и реакции на различные нагрузки. Отложение каллозы (β-1,3-глюкан) и гидролиз в области шейки, окружающей ПД, является одним из широко известных механизмов регуляции ПД7.

Многие патогенные микробы, включая грибы, бактерии и вирусы, могут манипулировать расширением или структурой БП во время их инфекции 2,8,9. Magnaporthe oryzae, возбудитель рисового бласта, развертывает внутриклеточные инвазивные гифы для перемещения от клетки к клетке через PD8. Бактериальный патоген Pseudomonas syringae pv. Томату требуется эффекторный белок HopO1-1 для межклеточного перемещения и распространения в растении-хозяине через взаимодействие и дестабилизацию PDLP7, тем самым увеличивая молекулярный поток в соседних клетках у Arabidopsis9. Тем не менее, растительные вирусы более универсальны в регуляции БП во время их межклеточной передачи, при этом белок движения вируса (МП) способствует перемещению от клетки к клетке2. Благодаря их важной функции в регулировании развития и роста растений, а также их взаимодействия с патогенными микробами растений, БП привлекают все большее внимание в последние годы. У Arabidopsis thaliana существует два основных типа функциональных белков PD, PDLP (1-8) и PDCB (1-5), и было обнаружено, что многие из них, например, PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 и PDCB115, играют роль в манипулировании проницаемостью PD посредством регуляции отложения каллозы. Тем не менее, было обнаружено, что некоторые PDLP обладают функциональной избыточностью, например, нокаутные мутанты pdlp1 и pdlp1,2 не влияли на молекулярный транспорт, хотя двойные нокаутные мутанты pdlp1,3 и pdlp2,3 показали повышенную плазмодесмальнуюпроницаемость16. Интересно, что подавление/нокаут или сверхэкспрессия PDLP5 в отдельности приводит к увеличению или уменьшению плазмодесальной проницаемости, соответственно 1,17. Недавно Li et al. обнаружили, что PDLP5 и PDLP6 функционируют на различных клеточных интерфейсах13. Эти результаты указывают на то, что PDLP5 может иметь неизбыточные функции с другими PDLP.

В связи с важной функцией БП в межклеточной коммуникации мы разработали протокол для развертывания растительных белков PDLP5 и PDCB1, а также вирусного белка межклеточного движения (MP) вируса очистки вен репы (TVCV) в качестве простых, удобных и надежных маркеров PD для экспериментов в области клеточной биологии. Для дальнейшей верификации параллельно продолжалась визуализация БП с помощью анилинового синего окрашивания отобранных тканей. Описанные протоколы локализации БП PDLP5, PDCB1 и TVCV MP могут быть легко адаптированы для анализа потенциальной локализации БП любых клеточных или патогенных белков в живых растениях.

протокол

Подробная информация о реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Рост растений

  1. Выращивайте семена Nicotiana benthamiana во влажной почве в камере с контролируемой средой при температуре 23 °C при 16 ч света и 8 ч в темноте.
  2. Примерно через 2 недели осторожно перенесите рассаду с торфяными гранулами вокруг корней в горшки большего размера и продолжайте рост в тех же условиях в течение 4-5 недель для экспериментов по агроинфильтрации.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Не используйте растения, когда они начинают цвести, так как накопление GFP уменьшится настадии соцветия 18.

2. Векторное построение

  1. С помощью ПЦР амплифицируют интересующие кодирующие последовательности с помощью высокоточной ДНК-полимеразы Q5 и клонируют их в входной вектор pDONR207 по реакции BP19 с использованием коммерчески доступного набора BP Clonase.
  2. Перенос генов-мишеней в полученных входных плазмидах в вектор назначения pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 с помощью реакции LR19 с использованием коммерчески доступного набора LR Clonase для получения плазмид с меткой EGFP, слитой с С-концом белков-мишеней.
  3. Верифицируйте все конструкции методом ПЦР и секвенирования19.

3. Агроинфильтрация

  1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 клеток, содержащих различные векторы на пластинах LB-агара и инкубированных в течение 2 дней при 28 °C.
  2. Поместите одну колонию в 2 мл бульона LB и инкубируйте в течение ночи при температуре 28 °C с перемешиванием (250 об/мин).
  3. Удалите 1 мл из ночной культуры, после чего добавьте 4 мл свежего бульона LB и повторно закваливайте в течение 1 ч в тех же условиях.
  4. Отрегулируйте бактериальную суспензию до OD600 = 0,1 (OD600 = 0,2 для совместной экспрессии двух белков) с помощью инфильтрационного буфера (MgCl2, 10 мМ; MES, 10 мМ, pH 5,6).
  5. Смешайте различные бактериальные суспензии в соотношении 1:1 (v/v), чтобы получить конечную концентрацию OD600 = 0,1. (необязательно).
  6. Бактериальную суспензию инкубировать при комнатной температуре в течение 3 ч при мягком перемешивании.
  7. Проникните в абаксиальную поверхность полностью раскрывшихся листьев с разных растений с помощью одноразового шприца объемом 1 мл и отметьте инфильтрированный участок (более темного цвета, чем окружающая неинфильтрированная ткань) водонепроницаемой ручкой.
  8. Перейдите к разделу «Конфокальная микроскопия» данного протокола (шаг 5).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Можно также использовать другие штаммы Agrobacterium tumefaciens, пригодные для трансформации интересующих видов растений.

4. Анилиновый синий морилка

  1. Добавьте аликвоту 200 мкл 1% анилинового синего (в 50 мМ буфере фосфата калия, pH 8,0) на предметное стекло микроскопа20.
  2. Иссеките инфильтрированный участок размером примерно от 0,5 см × 0,5 см от вены с помощью лезвия и перенесите образцы тканей листа в раствор анилинового синего цвета (абаксиальной стороной вверх) на предметное стекло микроскопа, убедитесь, что образцы тканей листа погружены в раствор анилинового синего, а затем накройте его покровным стеклом (22 мм x 50 мм).
  3. Поместите предметные стекла микроскопа с образцами в эксикатор, подключенный к вакуумному насосу, и вакуумируйте в течение 2 мин (<0,8 Па), после чего медленно сбросьте давление и инкубируйте в темноте в течение 30 мин при комнатной температуре.
  4. Визуализируйте флуоресцентный сигнал анилинового синего цвета под лазерным сканирующим конфокальным микроскопом с помощью совместимого программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь был использован метод окрашивания анилиновым синим цветом по Huang et al.20 . В модификации этой методики тот же эксперимент был проведен без 2-минутного вакуумного шага, что дало аналогичные результаты и показало, что вакуумная сушка не является существенной для анилинового окрашивания. Кроме того, концентрация анилинового синего пятна и время окрашивания могут варьироваться в зависимости от источника ткани листа и т.д.

5. Конфокальная микроскопия

  1. Соберите два листа с двух растений в разные моменты времени после проникновения. Разрежьте лезвием зону инфильтрации примерно на 0,5 см × 0,5 см срезов от жилы.
    1. Поместите образцы тканей в каплю стерильной воды (абаксиальной стороной вверх) в центральную часть предметного стекла микроскопа и накройте их покровным стеклом (22 мм x 50 мм), стараясь не допустить образования пузырьков.
  2. Убедитесь, что длины волн возбуждения для детектирования сигналов CFP, GFP и RFP составляют 405 нм, 488 нм и 561 нм соответственно, а эмиссионные фильтры для детектирования составляют 410–602 нм для CFP и 400–602 нм для EGFP и RFP, с отверстием 1 а.е. и общим усилением 769 В.
  3. Визуализируйте флуоресцентный сигнал автофлуоресцентных меток в инфильтрируемой зоне с помощью лазерного сканирующего конфокального микроскопа с совместимым программным обеспечением через 1, 2, 3, 5, 7 и 10 дней после инфильтрации.
    1. Используйте объектив с 10-кратным увеличением и фильтры GFP для определения местоположения клеток с флуоресцентным сигналом, а затем переключитесь на объектив с 40-кратным увеличением для визуализации субклеточной локализации и записи изображений.
  4. Соберите 20 изображений для каждого состояния, используя по крайней мере две независимые биологические реплики.
  5. Оценка локализации ПД исследуемого белка основана на диагностическом точечном появлении сигнала на периферии клетки21,22.
    Примечание: При обнаружении субклеточной локализации неизвестного белка рекомендуется использовать не менее трех растений.

6. Анализ данных

  1. Используйте программное обеспечение Fiji для разделения каналов и добавления масштабной линейки к изображениям для визуализации.
  2. Используйте программное обеспечение Fiji для разделения каналов перед измерением среднего значения оттенков серого для каждого изображения, чтобы оценить интенсивность флуоресценции GFP (для MP, PDCB1 и PDLP5) или CFP (для анилинового окрашивания в синий цвет) в разные моменты времени.
  3. Используйте программное обеспечение Fiji для разделения каналов перед нормализацией изображений GFP (для MP, PDCB1 и PDLP5) или CFP (для анилинового окрашивания в синий цвет). Измерялась площадь изображения, а PD puncta подсчитывались вручную. Рассчитывали количество PD puncta на 100мкм2 .
  4. Используйте двустороннюю ANOVA с тестом23 множественных сравнений Тьюки для определения P-значений между различными выборками и разными временными точками с помощью статистического и графического программного обеспечения.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для одноканального флуоресцентного изображения значение оттенков серого каждого пикселя представляет интенсивность флуоресценции этой точки24. Здесь среднее значение оттенков серого использовалось для оценки интенсивности флуоресценции каждого образца в разные моменты времени.

Результаты

Для облегчения изучения функции БП в физиологии растений и взаимодействия с патогенами были разработаны три простых и надежных референсных белка для локализации БП. Были выбраны два клеточных белка PD и патогенный MP-белок, кодируемый растительным тобамовирусом TVCV. Су...

Обсуждение

Любые клеточные биологические исследования межклеточной коммуникации растений и межклеточного транспорта при нормальном развитии растений и морфогенезе, а также при взаимодействии растений с патогенами требуют обнаружения и мониторинга сортировки белков, как энд...

Раскрытие информации

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Благодарности

Работа в лаборатории VC была поддержана грантами NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 и IOS 1758046) и BARD (IS-5276-20) для VC. Спонсоры не играли никакой роли в дизайне исследования, сборе и интерпретации данных, а также в принятии решения о публикации.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

Ссылки

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21 (2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880 (2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128 (2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160 (2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496 (2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7 (2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378 (2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695 (2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

213

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены