ניתוח מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיון חלבונים לפלסמודסמאטה בניקוטיאנה בנטמיאנה

Summary

פרוטוקול זה מתאר את הבחירה של סמנים פלסמודסמליים אופטימליים עבור ניתוחים מבוססי מיקרוסקופיה קונפוקלית של מיקוד חלבונים לפלסמודסמאטה במהלך אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית.

Abstract

פלסמודסמאטה הן ננו-נקבוביות קרומיות המחברות את הציטופלסמה של תאי צמח סמוכים ומאפשרות מעבר בין תאים של חומרי מזון, מקרומולקולות וכן וירוסים פולשים. פלסמודסמאטה ממלאת תפקידים בסיסיים בוויסות התקשורת הבין-תאית, ותורמת להתפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ואינטראקציות עם פתוגנים נגיפיים. גילוי לוקליזציה פלסמודזמלית של חלבונים צמחיים או נגיפיים יכול לספק מידע פונקציונלי שימושי על החלבון, והוא חשוב להבנת המנגנונים של אינטראקציות צמחים-וירוסים. כדי להקל על מחקרים אלה, אנו מתארים פרוטוקול לניתוח מבוסס מיקרוסקופיה קונפוקלית של חלבוני מיקוד פלסמודסמליים שונים כדי לבחור את הסמן הפלסמודסמלי הטוב ביותר לחקר אינטראקציות וירוס-פלסמודסמאטה או הובלה פלסמודסמלית. באופן ספציפי, הניתוחים של אירועים אלה מודגמים באמצעות חלבון תנועת תא לתא (MP) של וירוס ניקוי ורידים לפת (TVCV), Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) וחלבון קושר פלסמודסמאטה קלוז 1 (PDCB1). נתוני הלוקליזציה של חלבונים מנותחים במקביל להדמיה הגלובלית של פלסמודסמאטה באמצעות צביעה כחולה אנילין של הרקמות שנדגמו. גישות אלה יכולות להיות מותאמות בקלות כדי לנתח את הלוקליזציה פלסמודזמלית של כל חלבונים תאיים או פתוגניים בצמח.

Introduction

פלסמודסמאטה (PD) ממלאת תפקיד בסיסי בבקרת התפתחות צמחים, תגובות סביבתיות ואינטראקציות עם פתוגנים נגיפיים באמצעות ויסות התקשורת הבין-תאית ^1,2. פרקינסון נוצר בתחילה במהלך ציטוקינזיס, כאשר מאות פרקינסון מוחדרים לתא החדש בין שני תאי הבת, ובכך מספקים את התעלות לתקשורת בין תאים ^3,4. PD הוא מבנה עשיר בקרום, המכיל את הממברנה הנגזרת מהרשתית האנדופלסמית (ER), desmotubule trans-PD, בחלק המרכזי של הנקבוביות המרופדות על ידי קרום פלזמה ^3,4. גישות פרוטאומיות השוואתיות זיהו חלבונים פונקציונליים רבים של פרקינסון, כולל β-1,3-גלוקנאזות (BGs), סינתזות קלוזה (CALS), חלבונים הממוקמים בפלזמודסמאטה (PDLPs), חלבונים קושרי יבלות (PDCBs), חלבוני אזור טרנסממברנה מרובים (MCTPs)³ וקינאזות דמויות קולטן חוזר עשיר בלאוצין (RLK)⁵. לאחרונה, קירק ועמיתיו פיתחו כלי שנקרא פלסמודסמאטה בסיליקו פרוטאום 1 (PIP1), שאיפשר לחזות חלבוני פרקינסון חדשים ב-22 מיני צמחים⁶. מחלת פרקינסון משתנה בחדירות ובמבנה במהלך התפתחות הצמח ובתגובה לעקות שונות. שקיעת קלוזה (β-1,3-גלוקן) והידרוליזה באזור הצוואר סביב מחלת פרקינסון היא אחד המנגנונים הידועים של ויסות פרקינסון⁷.

חיידקים פתוגניים רבים, כולל פטריות, חיידקים ונגיפים, יכולים להשפיע על התרחבות או מבנה מחלת פרקינסון במהלך ההדבקה שלהם ^2,8,9. Magnaporthe oryzae, הגורם הסיבתי לפיצוץ אורז, פורס קורים פולשניים תוך-תאיים כדי לעבור מתא לתא באמצעות PD⁸. פתוגן חיידקי Pseudomonas מזרקים pv. עגבנייה זקוקה לחלבון משפיע HopO1-1 לתנועה בין-תאית והתפשטות בצמח המארח באמצעות אינטראקציה עם PDLP7 ומערער יציבות, ובכך מגביר את השטף המולקולרי בתאים שכנים בארבידופסיס⁹. עם זאת, נגיפים צמחיים הם רב-תכליתיים יותר בוויסות מחלת פרקינסון במהלך ההעברה הבין-תאית שלהם, כאשר חלבון התנועה הנגיפית, MP, מקדם תנועה מתא^{לתא 2}. בשל תפקידם החשוב בוויסות התפתחות וצמיחת צמחים, כמו גם האינטראקציה שלהם עם חיידקים פתוגניים צמחיים, מחלת פרקינסון זוכה לתשומת לב גוברת בשנים האחרונות. בארבידופסיס תאליאנה, ישנם שני סוגים עיקריים של חלבונים פונקציונליים של פרקינסון, PDLPs (1-8) ו-PDCB (1-5), ורבים מהם, למשל, PDLP5 ^1,10,11, PDLP1¹², PDLP6¹³, PDLP7¹⁴ ו-PDCB1¹⁵, נמצאו כממלאים תפקיד במניפולציה של חדירות PD באמצעות ויסות של שקיעת קלוזה. עם זאת, חלק מה-PDLPs נמצאו בעלי יתירות תפקודית, למשל, מוטציות נוקאאוט של pdlp1 ו-pdlp1,2 לא השפיעו על הסחר המולקולרי, אם כי מוטציות נוקאאוט כפולות של pdlp1,3 ו-pdlp2,3 הראו חדירות פלסמודזמלית מוגברת¹⁶. באופן מעניין, ירידה ברגולציה/נוקאאוט או ביטוי יתר של PDLP5 בלבד גורמים לעלייה או ירידה בחדירות פלסמודזמלית, בהתאמה ^1,17. לאחרונה, Li et al. מצאו כי PDLP5 ו- PDLP6 פועלים בממשקי תאים שונים¹³. תוצאות אלה מצביעות על כך של-PDLP5 עשויות להיות פונקציות שאינן יתירות עם PDLPs אחרים.

בשל התפקיד הקריטי של מחלת פרקינסון בתקשורת בין-תאית, פיתחנו פרוטוקול לפריסת חלבוני PDLP5 ו-PDCB1 צמחיים ואת חלבון התנועה הנגיפי מתא לתא (MP) של נגיף ניקוי ורידים לפת (TVCV) כסמני PD פשוטים, נוחים ואמינים לניסויים בביולוגיה של התא. לאימות נוסף, הדמיה של PD באמצעות צביעה כחולה אנילין של הרקמות שנדגמו המשיכה במקביל. ניתן להתאים בקלות את הפרוטוקולים המתוארים עבור לוקליזציה של PDLP5, PDCB1 ו-TVCV MP כדי לנתח לוקליזציה פוטנציאלית של PD של חלבונים תאיים או חלבונים שמקורם בפתוגן בצמחים חיים.

Protocol

פרטי הריאגנטים והציוד ששימש במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.

1. גידול צמחים

1. לגדל זרעי Nicotiana benthamiana באדמה רטובה בתא סביבה מבוקרת ב 23 °C (75 °F) תחת 16 שעות של אור ו 8 שעות של חושך.
2. לאחר כשבועיים, מעבירים בזהירות את השתילים עם כדורי הכבול סביב שורשיהם לעציצים גדולים יותר וממשיכים לצמוח באותם תנאים במשך 4-5 שבועות לניסויי ההסתננות.
   הערה: אין להשתמש בצמחים כאשר הם מתחילים לפרוח, מכיוון שהצטברות GFP תפחת בשלב התפרחת¹⁸.

2. בנייה וקטורית

1. השתמש ב- PCR כדי להגביר את רצפי הקידוד המעניינים עם Q5 High-Fidelity DNA Polymerase ולשכפל אותם לווקטור הכניסה pDONR207 על ידי תגובת BP¹⁹ באמצעות ערכת BP Clonase זמינה מסחרית.
2. העבר את גני המטרה בפלסמידים הנכנסים המתקבלים לווקטור היעד pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 על ידי תגובת LR¹⁹ באמצעות ערכת LR Clonase זמינה מסחרית לייצור פלסמידים עם תג EGFP המאוחה למסוף C של חלבוני המטרה.
3. אמת את כל המבנים על ידי PCR ורצף¹⁹.

3. חדירה חקלאית

1. פס Agrobacterium tumefaciens EHA105 תאים המכילים וקטורים שונים על לוחות אגר LB מודגר במשך 2 ימים תחת 28 ° C.
2. מעבירים מושבה אחת לתוך 2 מ"ל של מרק LB ודגורים לילה ב 28 ° C עם תסיסה (250 סל"ד).
3. מוציאים 1 מ"ל מתרבית הלילה, ולאחר מכן מוסיפים 4 מ"ל של מרק LB טרי, ומשנים את התרבית למשך שעה אחת באותם תנאים.
4. התאם את תרחיף החיידקים ל- OD₆₀₀ = 0.1 (OD₆₀₀ = 0.2 לביטוי משותף של שני חלבונים) עם חיץ חדירה (MgCl₂, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5.6).
5. ערבבו תרחיפים חיידקיים שונים ביחס של 1:1 (v/v) לקבלת ריכוז סופי של OD₆₀₀ = 0.1. (אופציונלי).
6. לדגור על התרחיף החיידקי בטמפרטורת החדר במשך 3 שעות עם תסיסה רכה.
7. לחדור את פני השטח abaxial של עלים מורחבים לחלוטין צמחים שונים עם מזרק חד פעמי 1 מ"ל מחט, ולסמן את האזור חדר (צבע כהה יותר מאשר הרקמה שמסביב, לא חדר) עם עט עמיד למים.
8. המשך לסעיף מיקרוסקופ קונפוקלי של פרוטוקול זה (שלב 5).
   הערה: זנים אחרים של Agrobacterium tumefaciens המתאימים לשינוי של מיני צמחים מעניינים יכולים לשמש גם.

4. כתם כחול אנילין

1. הוסף aliquot של 200 μL של 1% כחול אנילין (ב 50 mM אשלגן פוספט חיציץ, pH 8.0) לשקופית מיקרוסקופ²⁰.
2. מוציאים את השטח המוחדר של כ-0.5 ס"מ ×-0.5 ס"מ, הרחק מהווריד, בעזרת להב, ומעבירים את דגימות רקמת העלה לתמיסה הכחולה אנילין (צד אבקסיאלי כלפי מעלה) בשקופית המיקרוסקופ, ומוודאים שדגימות רקמת העלה שקועות בתמיסה הכחולה אנילין, ולאחר מכן מכסים אותה בזכוכית כיסוי (22 מ"מ x 50 מ"מ).
3. מניחים את שקופיות המיקרוסקופ עם הדגימות במייבש המחובר למשאבת ואקום ומפנים למשך 2 דקות (0.8 < Pa), ולאחר מכן שחרור איטי של הלחץ והדגירה בחושך למשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
4. דמיינו את האות הפלואורסצנטי של כחול אנילין תחת מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם תוכנה תואמת.
   הערה: כאן, שיטת צביעת כחול אנילין על ידי Huang et ^al.20 שימש. בשינוי של טכניקה זו, אותו ניסוי בוצע ללא שלב ואקום של 2 דקות, הניב תוצאות דומות והציע כי ייבוש ואקום אינו חיוני לצביעת אנילין. כמו כן, ריכוז הכתם הכחול אנילין וזמן הצביעה עשויים להשתנות בהתאם למקור רקמת העלה וכו'.

5. מיקרוסקופ קונפוקלי

1. קוצרים שני עלים משני צמחים בנקודות זמן שונות לאחר החדירה. חותכים את אזור החדירה לכ 0.5 ס"מ × 0.5 ס"מ פרוסות מן הווריד עם להב.
   1. הניחו את דגימות הרקמה בטיפת מים סטריליים (abaxial side-up) בחלק המרכזי של מגלשת מיקרוסקופ, וכסו אותן בזכוכית כיסוי (22 מ"מ x 50 מ"מ), תוך הקפדה על מניעת בועות.
2. ודא שאורכי גל העירור לגילוי אותות CFP, GFP ו- RFP הם 405 ננומטר, 488 ננומטר ו- 561 ננומטר, בהתאמה, ומסנני הפליטה לגילוי היו 410-602 ננומטר עבור CFP, ו- 400-602 ננומטר עבור EGFP ו- RFP, כאשר חור הסיכה 1 AU והרווח הראשי מוגדרים כ- 769 V.
3. דמיינו את האות הפלואורסצנטי של תגים אוטופלואורסצנטיים באזור המסתנן באמצעות מיקרוסקופ קונפוקלי סורק לייזר עם תוכנה תואמת ביום אחד, יומיים, 3 ימים, 5 ימים, 7 ימים ו-10 ימים לאחר החדירה.
   1. השתמש בעדשה אובייקטיבית של 10x ובמסנני GFP כדי לאתר תאים עם אות פלואורסצנטי ולאחר מכן עבור לעדשה אובייקטיבית של 40x לתצוגה חזותית של לוקליזציה תת-תאית והקלטת תמונה.
4. אסוף 20 תמונות עבור כל מצב, באמצעות לפחות שני עותקים ביולוגיים בלתי תלויים.
5. ציון PD לוקליזציה של החלבון הנבדק מבוסס על מראה ניקוב אבחון של האות בשולי התא^21,22.
   הערה: בעת זיהוי לוקליזציה תת-תאית של חלבון לא ידוע, מומלץ להשתמש בשלושה צמחים לפחות.

6. ניתוח נתונים

1. השתמש בתוכנת פיג'י כדי לפצל ערוצים ולהוסיף את סרגל קנה המידה לתמונות לצורך תצוגה חזותית.
2. השתמש בתוכנת פיג'י כדי לפצל ערוצים לפני מדידת הערך הממוצע בגווני אפור עבור כל תמונה כדי להעריך את עוצמת הפלואורסצנטיות של GFP (עבור MP, PDCB1 ו- PDLP5) או CFP (עבור צביעה בצבע כחול אנילין) בנקודות זמן שונות.
3. השתמש בתוכנת פיג'י כדי לפצל ערוצים לפני נורמליזציה של תמונות GFP (עבור MP, PDCB1 ו- PDLP5) או CFP (עבור צביעה כחולה אנילין). שטח התמונה נמדד, וה-PD puncta נספרו ידנית. מספר PD puncta לכל 100 מיקרומטר² חושב.
4. השתמש ANOVA דו כיווני עם מבחן השוואות מרובות של Tukey²³ כדי לקבוע את ערכי P בין הדגימות השונות ונקודות זמן שונות עם תוכנות סטטיסטיות וגרפים.
   הערה: בתמונה פלואורסצנטית חד-ערוצית, ערך גווני האפור של כל פיקסל מייצג את עוצמת הפלואורסצנטיות של נקודה²⁴ זו. כאן, ערך גווני האפור הממוצע שימש להערכת עוצמת הפלואורסצנטיות של כל דגימה בנקודות זמן שונות.

תוצאות

כדי להקל על מחקרים של תפקוד פרקינסון בפיזיולוגיה של צמחים ובאינטראקציות עם פתוגנים, פותחו שלושה חלבוני ייחוס פשוטים ואמינים עבור לוקליזציה של פרקינסון. נבחרו שני חלבוני PD תאיים וחלבון MP שמקורו בפתוגן המקודד על ידי נגיף הצמח TVCV. הלוקליזציה התת-תאית של חלבונים אלה הודגמה ...

Discussion

כל מחקר ביולוגי של התא על תקשורת בין-תאית של צמחים והעברה בין תאים במהלך התפתחות נורמלית של צמחים ומורפוגנזה, כמו גם במהלך אינטראקציות צמחים-פתוגנים, מחייב זיהוי וניטור של מיון חלבונים - הן אנדוגניים והן מקודדים פתוגנים - לקשרים בין-תאיים צמחיים, פלסמודסמאטה (PD). ניסויים א...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S