Analisi al microscopio confocale dello smistamento delle proteine in Plasmodesmata in Nicotiana benthamiana

Riepilogo

Questo protocollo descrive la selezione di marcatori plasmodesmici ottimali per analisi basate su microscopia confocale del targeting proteico dei plasmodesmi durante le interazioni virus-plasmodesmi o il trasporto plasmodesmico.

Abstract

I plasmodesmi sono nanopori membranosi che collegano il citoplasma delle cellule vegetali adiacenti e consentono il traffico da cellula a cellula di nutrienti, macromolecole e virus invasori. I plasmodesmi svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della comunicazione intercellulare, contribuendo allo sviluppo delle piante, alle risposte ambientali e alle interazioni con i patogeni virali. La scoperta della localizzazione plasmodesmale di proteine vegetali o virali potrebbe fornire utili informazioni funzionali sulla proteina ed è importante per comprendere i meccanismi delle interazioni pianta-virus. Per facilitare questi studi, descriviamo un protocollo per l'analisi basata sulla microscopia confocale di diverse proteine bersaglio plasmodesmale per selezionare il miglior marcatore plasmodesmale per studiare le interazioni virus-plasmodesma o il trasporto plasmodestmico. In particolare, le analisi di questi eventi sono illustrate utilizzando la proteina del movimento cellula-cellula (MP) del virus della vena di rapa (TVCV), la proteina localizzata 5 di Arabidopsis Plasmodesma (PDLP5) e la proteina legante il callosio 1 di Plasmodesmata. I dati di localizzazione dei plasmodami proteici sono analizzati in parallelo con la visualizzazione globale dei plasmodesmi utilizzando la colorazione con blu all'anilina dei tessuti campionati. Questi approcci possono essere facilmente adattati per analizzare la localizzazione plasmodesmale di qualsiasi proteina cellulare o patogena nelle planta.

Introduzione

I plasmodesmi (PD) svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo delle piante, delle risposte ambientali e delle interazioni con i patogeni virali attraverso la regolazione della comunicazione intercellulare ^1,2. La PD si forma inizialmente durante la citochinesi, con centinaia di PD inserite nella nuova cellula tra le due cellule figlie, fornendo così i canali per la comunicazione cellula-cellula ^3,4. La PD è una struttura ricca di membrana, contenente la membrana derivata dal reticolo endoplasmatico (ER....

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Crescita delle piante

1. Coltiva i semi di Nicotiana benthamiana in terreno umido in una camera in ambiente controllato a 23 °C sotto 16 ore di luce e 8 ore di buio.
2. Dopo circa 2 settimane, trasferisci con cura le piantine con i pellet di torba attorno alle loro radici in vasi più grandi e continua la crescita nelle stesse condizioni per 4-5 settimane per gli esperimenti di agroinfiltrazione.
   NOTA: Non utilizzare le piante quand....

Discussione

Qualsiasi studio di biologia cellulare sulla comunicazione intercellulare delle piante e sul trasporto da cellula a cellula durante il normale sviluppo e morfogenesi delle piante, così come durante le interazioni pianta-patogeno, richiede l'individuazione e il monitoraggio dello smistamento delle proteine, sia endogene che codificate per i patogeni, nelle connessioni intercellulari delle piante, i plasmodesmi (PD). Questi esperimenti sarebbero sostanzialmente facilitati dall'uso di prot.......

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S