JoVE Logo
Autori
Contattaci

Accedi

È necessario avere un abbonamento a JoVE per visualizzare questo. Accedi o inizia la tua prova gratuita.

In questo articolo

  • Riepilogo
  • Abstract
  • Introduzione
  • Protocollo
  • Risultati
  • Discussione
  • Divulgazioni
  • Riconoscimenti
  • Materiali
  • Riferimenti
  • Ristampe e Autorizzazioni

Riepilogo

Questo protocollo descrive la selezione di marcatori plasmodesmici ottimali per analisi basate su microscopia confocale del targeting proteico dei plasmodesmi durante le interazioni virus-plasmodesmi o il trasporto plasmodesmico.

Abstract

I plasmodesmi sono nanopori membranosi che collegano il citoplasma delle cellule vegetali adiacenti e consentono il traffico da cellula a cellula di nutrienti, macromolecole e virus invasori. I plasmodesmi svolgono un ruolo fondamentale nella regolazione della comunicazione intercellulare, contribuendo allo sviluppo delle piante, alle risposte ambientali e alle interazioni con i patogeni virali. La scoperta della localizzazione plasmodesmale di proteine vegetali o virali potrebbe fornire utili informazioni funzionali sulla proteina ed è importante per comprendere i meccanismi delle interazioni pianta-virus. Per facilitare questi studi, descriviamo un protocollo per l'analisi basata sulla microscopia confocale di diverse proteine bersaglio plasmodesmale per selezionare il miglior marcatore plasmodesmale per studiare le interazioni virus-plasmodesma o il trasporto plasmodestmico. In particolare, le analisi di questi eventi sono illustrate utilizzando la proteina del movimento cellula-cellula (MP) del virus della vena di rapa (TVCV), la proteina localizzata 5 di Arabidopsis Plasmodesma (PDLP5) e la proteina legante il callosio 1 di Plasmodesmata. I dati di localizzazione dei plasmodami proteici sono analizzati in parallelo con la visualizzazione globale dei plasmodesmi utilizzando la colorazione con blu all'anilina dei tessuti campionati. Questi approcci possono essere facilmente adattati per analizzare la localizzazione plasmodesmale di qualsiasi proteina cellulare o patogena nelle planta.

Introduzione

I plasmodesmi (PD) svolgono un ruolo fondamentale nel controllo dello sviluppo delle piante, delle risposte ambientali e delle interazioni con i patogeni virali attraverso la regolazione della comunicazione intercellulare 1,2. La PD si forma inizialmente durante la citochinesi, con centinaia di PD inserite nella nuova cellula tra le due cellule figlie, fornendo così i canali per la comunicazione cellula-cellula 3,4. La PD è una struttura ricca di membrana, contenente la membrana derivata dal reticolo endoplasmatico (ER), un desmotubulo trans-PD, nella parte centrale dei pori che sono rivestiti dalla membrana plasmatica 3,4. Gli approcci proteomici comparativi hanno identificato numerose proteine funzionali del PD, tra cui β-1,3-glucanasi (BG), calcosio sintasi (CALS), proteine localizzate nei plasmodesmi (PDLP), proteine leganti il callosio (PDCB), proteine della regione transmembrana di domini C2 multipli (MCTP)3 e chinasi simili al recettore ripetuto ricche di leucina (RLK)5. Recentemente, Kirk et al. hanno sviluppato uno strumento chiamato plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), che ha reso possibile prevedere nuove proteine PD in 22 specie vegetali6. La PD varia in permeabilità e struttura durante lo sviluppo delle piante e la risposta a vari stress. La deposizione e l'idrolisi del callosio (β-1,3-glucano) nella regione del collo che circonda la PD è uno dei meccanismi ampiamente noti della regolazione della PD7.

Molti microbi patogeni, tra cui funghi, batteri e virus, possono manipolare la dilatazione o la struttura del PD durante la loro infezione 2,8,9. Magnaporthe oryzae, l'agente eziologico del blasto del riso, dispiega ife invasive intracellulari per spostarsi da una cellula all'altra attraverso PD8. Un patogeno batterico Pseudomonas syringae pv. il pomodoro richiede una proteina effettrice HopO1-1 per il movimento intercellulare e la diffusione nella pianta ospite attraverso l'interazione e la destabilizzazione di PDLP7, aumentando così il flusso molecolare nelle cellule vicine in Arabidopsis9. Tuttavia, i virus delle piante sono più versatili nella regolazione del PD durante la loro trasmissione intercellulare, con la proteina del movimento virale (MP) che promuove il movimento da cellula a cellula2. A causa della loro importante funzione nella regolazione dello sviluppo e della crescita delle piante, nonché della loro interazione con i microbi patogeni delle piante, la malattia di Parkinson ha guadagnato una crescente attenzione negli ultimi anni. In Arabidopsis thaliana, ci sono due tipi principali di proteine funzionali del PD, PDLP (1-8) e PDCB (1-5), e molte di esse, ad esempio PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 e PDCB115, hanno un ruolo nella manipolazione della permeabilità del PD attraverso la regolazione della deposizione di callosio. Tuttavia, è stato riscontrato che alcuni PDLP hanno una ridondanza funzionale, ad esempio, i mutanti knockout di pdlp1 e pdlp1,2 non hanno influenzato il traffico molecolare, sebbene i mutanti double knockout di pdlp1,3 e pdlp2,3 abbiano mostrato un aumento della permeabilità plasmodesmale16. È interessante notare che la sottoregolazione/knockout o la sovraespressione di PDLP5 da sola determinano un aumento o una diminuzione della permeabilità plasmodamale, rispettivamente 1,17. Recentemente, Li et al. hanno scoperto che PDLP5 e PDLP6 funzionano in diverse interfacce cellulari13. Questi risultati indicano che PDLP5 potrebbe avere funzioni non ridondanti con altri PDLP.

A causa della funzione critica della PD nella comunicazione intercellulare, abbiamo sviluppato un protocollo per l'implementazione delle proteine PD PDLP5 e PDCB1 e della proteina virale del movimento cellula-cellula (MP) del virus della vena di rapa (TVCV) come marcatori PD semplici, convenienti e affidabili per la sperimentazione di biologia cellulare. Per ulteriori verifiche, la visualizzazione della PD utilizzando la colorazione blu all'anilina dei tessuti campionati è proceduta in parallelo. I protocolli descritti per la localizzazione PD di PDLP5, PDCB1 e TVCV MP possono essere facilmente adattati per analizzare la potenziale localizzazione PD di qualsiasi proteina cellulare o derivata da patogeni nelle piante viventi.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocollo

I dettagli dei reagenti e delle attrezzature utilizzate in questo studio sono elencati nella tabella dei materiali.

1. Crescita delle piante

  1. Coltiva i semi di Nicotiana benthamiana in terreno umido in una camera in ambiente controllato a 23 °C sotto 16 ore di luce e 8 ore di buio.
  2. Dopo circa 2 settimane, trasferisci con cura le piantine con i pellet di torba attorno alle loro radici in vasi più grandi e continua la crescita nelle stesse condizioni per 4-5 settimane per gli esperimenti di agroinfiltrazione.
    NOTA: Non utilizzare le piante quando iniziano a fiorire, poiché l'accumulo di GFP diminuirà allo stadio18 dell'infiorescenza.

2. Costruzione vettoriale

  1. Utilizzare la PCR per amplificare le sequenze codificanti di interesse con la DNA polimerasi ad alta fedeltà Q5 e clonarle nel vettore di ingresso pDONR207 mediante la reazione BP19 utilizzando un kit di clonasi BP disponibile in commercio.
  2. Trasferire i geni bersaglio nei plasmidi di ingresso risultanti nel vettore di destinazione pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 mediante la reazione LR19 utilizzando un kit di clonasi LR disponibile in commercio per produrre plasmidi con il tag EGFP fuso al C-terminale delle proteine bersaglio.
  3. Verificare tutti i costrutti mediante PCR e sequenziamento19.

3. Agroinfiltrazione

  1. Cellule Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 contenenti diversi vettori su piastre di agar LB e incubate per 2 giorni a una temperatura inferiore a 28 °C.
  2. Trasferire una singola colonia in 2 mL di brodo LB e incubare per una notte a 28 °C con agitazione (250 giri/min).
  3. Rimuovere 1 ml dalla coltura notturna, seguito dall'aggiunta di 4 ml di brodo LB fresco e ricoltivare per 1 ora nelle stesse condizioni.
  4. Regolare la sospensione batterica a OD600 = 0,1 (OD600 = 0,2 per la co-espressione di due proteine) con tampone di infiltrazione (MgCl2, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
  5. Mescolare diverse sospensioni batteriche in un rapporto di 1:1 (v/v) per ottenere una concentrazione finale di OD600 = 0,1. (facoltativo).
  6. Incubare la sospensione batterica a temperatura ambiente per 3 ore con agitazione delicata.
  7. Infiltra la superficie aassiale delle foglie completamente espanse di diverse piante con una siringa monouso senza ago da 1 ml e contrassegna l'area infiltrata (di un colore più scuro rispetto al tessuto circostante non infiltrato) con una penna impermeabile.
  8. Procedere alla sezione di microscopia confocale di questo protocollo (passaggio 5).
    NOTA: Possono essere utilizzati anche altri ceppi di Agrobacterium tumefaciens adatti alla trasformazione di specie vegetali di interesse.

4. Colorazione blu all'anilina

  1. Aggiungere un'aliquota di 200 μl di blu anilina all'1% (in 50 mM di tampone fosfato di potassio, pH 8,0) a un vetrino da microscopio20.
  2. Asportare l'area infiltrata di circa 0,5 cm × 0,5 cm, lontano dalla vena, con una lama, e trasferire i campioni di tessuto fogliare nella soluzione di blu di anilina (lato abassiale rivolto verso l'alto) sul vetrino del microscopio, assicurarsi che i campioni di tessuto fogliare siano immersi nella soluzione di blu di anilina, quindi coprirla con un vetro di copertura (22 mm x 50 mm).
  3. Posizionare i vetrini del microscopio con i campioni in un essiccatore collegato a una pompa a vuoto ed evacuare per 2 minuti (<0,8 Pa), seguiti da un lento rilascio della pressione e dall'incubazione al buio per 30 minuti a temperatura ambiente.
  4. Visualizza il segnale fluorescente del blu di anilina sotto un microscopio confocale a scansione laser con software compatibile.
    NOTA: Qui è stato utilizzato il metodo di colorazione blu all'anilina di Huang et al.20 . In una modifica di questa tecnica, lo stesso esperimento è stato eseguito senza la fase di vuoto di 2 minuti, producendo risultati simili e suggerendo che l'essiccazione sotto vuoto non è essenziale per la colorazione all'anilina. Inoltre, la concentrazione della colorazione blu all'anilina e il tempo di colorazione possono variare a seconda della fonte del tessuto fogliare, ecc.

5. Microscopia confocale

  1. Raccogli due foglie da due piante in momenti diversi dopo l'infiltrazione. Tagliare la zona di infiltrazione a circa 0,5 cm × 0,5 cm di distanza dalla vena con una lama.
    1. Immergere i campioni di tessuto in una goccia di acqua sterile (con il lato abassiale rivolto verso l'alto) nella parte centrale di un vetrino da microscopio e coprirli con un vetro di copertura (22 mm x 50 mm), facendo attenzione a evitare bolle.
  2. Assicurarsi che le lunghezze d'onda di eccitazione per il rilevamento dei segnali CFP, GFP e RFP siano rispettivamente di 405 nm, 488 nm e 561 nm e che i filtri di emissione per il rilevamento siano 410-602 nm per CFP e 400-602 nm per EGFP e RFP, con il foro stenopeico 1 AU e il guadagno master impostato su 769 V.
  3. Visualizzare il segnale fluorescente dei tag autofluorescenti nell'area infiltrata utilizzando un microscopio confocale a scansione laser con software compatibile a 1 giorno, 2 giorni, 3 giorni, 5 giorni, 7 giorni e 10 giorni dopo l'infiltrazione.
    1. Utilizzare una lente dell'obiettivo 10x e filtri GFP per localizzare le cellule con il segnale fluorescente, quindi passare a una lente dell'obiettivo 40x per la visualizzazione della localizzazione subcellulare e la registrazione delle immagini.
  4. Raccogli 20 immagini per ogni condizione, utilizzando almeno due repliche biologiche indipendenti.
  5. Punteggio Localizzazione PD della proteina testata in base all'aspetto diagnostico puntato del segnale alla periferia della cellula21,22.
    NOTA: Quando si rileva la localizzazione subcellulare di una proteina sconosciuta, si consiglia di utilizzare almeno tre piante.

6. Analisi dei dati

  1. Usa il software Fiji per dividere i canali e aggiungere la barra di scala alle immagini per la visualizzazione.
  2. Utilizza il software Fiji per dividere i canali prima di misurare il valore medio della scala di grigi per ciascuna immagine per valutare l'intensità di fluorescenza GFP (per MP, PDCB1 e PDLP5) o CFP (per la colorazione blu all'anilina) in diversi punti temporali.
  3. Utilizzare il software Fiji per dividere i canali prima della normalizzazione delle immagini di GFP (per MP, PDCB1 e PDLP5) o CFP (per colorazione blu all'anilina). L'area dell'immagine è stata misurata e i punti PD sono stati contati manualmente. È stato calcolato il numero di punti PD per 100 μm2 .
  4. Utilizza l'ANOVA bidirezionale con il test di confronto multiplo23 di Tukey per determinare i valori P tra i diversi campioni e i diversi punti temporali con software statistici e grafici.
    NOTA: Per un'immagine a fluorescenza a canale singolo, il valore della scala di grigi di ciascun pixel rappresenta l'intensità di fluorescenza di quel punto24. In questo caso, il valore medio della scala di grigi è stato utilizzato per valutare l'intensità della fluorescenza di ciascun campione in diversi punti temporali.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Risultati

Per facilitare gli studi sulla funzione della malattia di Parkinson nella fisiologia delle piante e nelle interazioni con i patogeni, sono state sviluppate tre proteine di riferimento semplici e affidabili per la localizzazione della malattia di Parkinson. Sono state selezionate due proteine PD cellulari e una proteina MP derivata da patogeni codificata dal tobamovirus vegetale TVCV. La localizzazione subcellulare di queste proteine è stata visualizzata utilizzando un reporter autofluor...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussione

Qualsiasi studio di biologia cellulare sulla comunicazione intercellulare delle piante e sul trasporto da cellula a cellula durante il normale sviluppo e morfogenesi delle piante, così come durante le interazioni pianta-patogeno, richiede l'individuazione e il monitoraggio dello smistamento delle proteine, sia endogene che codificate per i patogeni, nelle connessioni intercellulari delle piante, i plasmodesmi (PD). Questi esperimenti sarebbero sostanzialmente facilitati dall'uso di prot...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Divulgazioni

Gli autori dichiarano di non avere interessi concorrenti.

Riconoscimenti

Il lavoro nel laboratorio VC è stato supportato da sovvenzioni da NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 e IOS 1758046) e BARD (IS-5276-20) a VC. I finanziatori non hanno avuto alcun ruolo nella progettazione dello studio, nella raccolta e nell'interpretazione dei dati o nella decisione di pubblicarlo.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materiali

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

Riferimenti

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160(2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496(2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378(2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Ristampe e Autorizzazioni

Richiedi autorizzazione per utilizzare il testo o le figure di questo articolo JoVE

Richiedi Autorizzazione

Esplora altri articoli

BiologiaNumero 213Plasmodesmilocalizzazione subcellularemovimento cellula cellulavirus vegetalimicroscopia confocaleagroinfiltrazione

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Riservatezza

Condizioni di utilizzo

Politiche

Contattaci

SUGGERISCI JOVE ALLA BIBLIOTECA

Newsletter di JoVE

Ricerca

Didattica

Autori

Personale delle biblioteche

CHI SIAMO

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. Tutti i diritti riservati