Nicotiana benthamiana'da Plasmodesmata'ya Protein Ayıklamasının Konfokal Mikroskopi Analizi

Özet

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Özet

Plazmodesmata, bitişik bitki hücrelerinin sitoplazmasını birbirine bağlayan ve besinlerin, makromoleküllerin ve istilacı virüslerin hücreden hücreye ticaretini sağlayan zarlı nanogözeneklerdir. Plazmodesmata, hücreler arası iletişimin düzenlenmesinde temel roller oynar, bitki gelişimine, çevresel tepkilere ve viral patojenlerle etkileşimlere katkıda bulunur. Bitki veya viral proteinlerin plazmodesmal lokalizasyonunu keşfetmek, protein hakkında yararlı fonksiyonel bilgiler sağlayabilir ve bitki-virüs etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamak için önemlidir. Bu çalışmaları kolaylaştırmak için, virüs-plazmodesmata etkileşimlerini veya plazmodesmal transportu incelemek için en iyi plazmodesmal markörü seçmek için farklı plazmodesmal hedefleme proteinlerinin konfokal mikroskopi tabanlı analizi için bir protokol açıklıyoruz. Spesifik olarak, bu olayların analizleri, Şalgam damar temizleme virüsünün (TVCV) hücreden hücreye hareket proteini (MP), Arabidopsis Plasmodesmata-Lokalize Protein 5 (PDLP5) ve Plasmodesmata Nasır Bağlayıcı Protein 1 (PDCB1) kullanılarak gösterilmiştir. Protein plazmodesmal lokalizasyon verileri, örneklenen dokuların anilin mavisi boyaması kullanılarak plazmodesmatanın global görselleştirmesine paralel olarak analiz edilir. Bu yaklaşımlar, plantadaki herhangi bir hücresel veya patojen proteinin plazmodesmal lokalizasyonunu analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Plazmodesmata (PD), hücreler arası iletişimin düzenlenmesi yoluyla bitki gelişimini, çevresel tepkileri ve viral patojenlerle etkileşimleri kontrol etmede temel bir rol oynar ^1,2. PD başlangıçta sitokinez sırasında oluşur, iki yavru hücre arasındaki yeni hücreye yüzlerce PD yerleştirilir ve böylece hücreden hücreye iletişim kanallarını sağlar ^3,4. PD, plazma zarı ^3,4 tarafından kaplanan gözeneklerin orta kısmında bir trans-PD desmotubülü olan endoplazmik retiku....

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyümesi

1. Nicotiana benthamiana tohumlarını ıslak toprakta, 23 ° C'de, 16 saat ışık ve 8 saat karanlıkta kontrollü bir ortam odasında büyütün.
2. Yaklaşık 2 hafta sonra, fideleri köklerinin etrafındaki turba peletleri ile dikkatlice daha büyük saksılara aktarın ve agroinfiltrasyon deneyleri için 4-5 hafta boyunca aynı koşullar altında büyümeye devam edin.
   NOT: Bitkileri çiçek açmaya başladıklarında kullanmayın, çünkü GFP birikimi çiçeklenme ....

Tartışmalar

Normal bitki gelişimi ve morfogenezi sırasında ve ayrıca bitki-patojen etkileşimleri sırasında bitki hücreler arası iletişim ve hücreden hücreye taşınımın herhangi bir hücre biyolojik çalışması, hem endojen hem de patojen kodlu proteinlerin bitki hücreler arası bağlantılarına, plazmodesmata (PD) sıralamasının tespit edilmesini ve izlenmesini gerektirir. Bu deneyler, ister endojen ister patojen kaynaklı olsun, PD'ye sadık ve tutarlı bir şekilde lokalize ol.......

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S