JoVE Logo
Yazarlar
Bize Ulaşın

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Bu protokol, virüs-plazmodesmata etkileşimleri veya plazmodesmal transport sırasında plazmodesmataya protein hedeflemenin konfokal mikroskopi tabanlı analizleri için optimal plazmodesmal belirteçlerin seçimini açıklar.

Özet

Plazmodesmata, bitişik bitki hücrelerinin sitoplazmasını birbirine bağlayan ve besinlerin, makromoleküllerin ve istilacı virüslerin hücreden hücreye ticaretini sağlayan zarlı nanogözeneklerdir. Plazmodesmata, hücreler arası iletişimin düzenlenmesinde temel roller oynar, bitki gelişimine, çevresel tepkilere ve viral patojenlerle etkileşimlere katkıda bulunur. Bitki veya viral proteinlerin plazmodesmal lokalizasyonunu keşfetmek, protein hakkında yararlı fonksiyonel bilgiler sağlayabilir ve bitki-virüs etkileşimlerinin mekanizmalarını anlamak için önemlidir. Bu çalışmaları kolaylaştırmak için, virüs-plazmodesmata etkileşimlerini veya plazmodesmal transportu incelemek için en iyi plazmodesmal markörü seçmek için farklı plazmodesmal hedefleme proteinlerinin konfokal mikroskopi tabanlı analizi için bir protokol açıklıyoruz. Spesifik olarak, bu olayların analizleri, Şalgam damar temizleme virüsünün (TVCV) hücreden hücreye hareket proteini (MP), Arabidopsis Plasmodesmata-Lokalize Protein 5 (PDLP5) ve Plasmodesmata Nasır Bağlayıcı Protein 1 (PDCB1) kullanılarak gösterilmiştir. Protein plazmodesmal lokalizasyon verileri, örneklenen dokuların anilin mavisi boyaması kullanılarak plazmodesmatanın global görselleştirmesine paralel olarak analiz edilir. Bu yaklaşımlar, plantadaki herhangi bir hücresel veya patojen proteinin plazmodesmal lokalizasyonunu analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

Giriş

Plazmodesmata (PD), hücreler arası iletişimin düzenlenmesi yoluyla bitki gelişimini, çevresel tepkileri ve viral patojenlerle etkileşimleri kontrol etmede temel bir rol oynar 1,2. PD başlangıçta sitokinez sırasında oluşur, iki yavru hücre arasındaki yeni hücreye yüzlerce PD yerleştirilir ve böylece hücreden hücreye iletişim kanallarını sağlar 3,4. PD, plazma zarı 3,4 tarafından kaplanan gözeneklerin orta kısmında bir trans-PD desmotubülü olan endoplazmik retikulum (ER) türevi zarı içeren zardan zengin bir yapıdır. Karşılaştırmalı proteomik yaklaşımlar, β-1,3-glukanazlar (BG'ler), kalloz sentazlar (CALS'ler), plazmodesmata yerleşimli proteinler (PDLP'ler), kalloz bağlayıcı proteinler (PDCB'ler), çoklu C2 alanları transmembran bölge proteinleri (MCTP'ler)3 ve lösin açısından zengin tekrar reseptörü benzeri kinazlar (RLK) dahil olmak üzere çok sayıda PD fonksiyonel proteini tanımladı5. Son zamanlarda, Kirk ve ark. plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1) adı verilen bir araç geliştirdi ve bu da 22 bitki türünde yeni PD proteinlerini tahmin etmeyi mümkün kıldı6. PD, bitki gelişimi sırasında geçirgenlik ve yapı bakımından değişir ve çeşitli streslere tepki verir. PD'yi çevreleyen boyun bölgesinde kalloz (β-1,3-glukan) birikimi ve hidrolizi, PD regülasyonu7'nin yaygın olarak bilinen mekanizmalarından biridir.

Mantarlar, bakteriler ve virüsler dahil olmak üzere birçok patojenik mikrop, enfeksiyonları sırasında PD genişlemesini veya yapısını manipüle edebilir 2,8,9. Pirinç patlamasının etken maddesi olan Magnaporthe oryzae, PD8 yoluyla hücreden hücreye hareket etmek için hücre içi invaziv hifleri dağıtır. Bakteriyel bir patojen Pseudomonas syringae pv. domates, hücreler arası hareket için bir efektör protein HopO1-1 gerektirir ve PDLP7 ile etkileşime girerek ve kararsızlaştırarak konakçı bitkide yayılır, böylece Arabidopsis9'daki komşu hücrelerdeki moleküler akıyı arttırır. Bununla birlikte, bitki virüsleri, hücreden hücreye hareketi teşvik eden viral hareket proteini (MP) ile hücreler arası iletimleri sırasında PD'yi düzenlemede daha çok yönlüdür2. Bitki gelişimi ve büyümesinin düzenlenmesindeki önemli işlevlerinin yanı sıra bitki patojenik mikropları ile etkileşimleri nedeniyle, PH son yıllarda artan bir ilgi kazanmıştır. Arabidopsis thaliana'da, PDLP'ler (1-8) ve PDCB'ler (1-5) olmak üzere iki ana PD fonksiyonel protein türü vardır ve bunların çoğunun, örneğin, PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 ve PDCB115'in, kalloz birikiminin düzenlenmesi yoluyla PD geçirgenliğini manipüle etmede rol oynadığı bulunmuştur. Bununla birlikte, bazı PDLP'lerin fonksiyonel bir fazlalığa sahip olduğu bulunmuştur, örneğin, pdlp1 ve pdlp1,2'nin nakavt mutantları moleküler trafiği etkilememiştir, ancak pdlp1,3 ve pdlp2,3'ün çift nakavt mutantları artmış plazmodesmal geçirgenlikgöstermiştir 16. İlginç bir şekilde, tek başına PDLP5'in aşağı regülasyonu/nakavtı veya aşırı ekspresyonu, sırasıyla plazmodesmal geçirgenlikte bir artış veya azalma ile sonuçlanır, 1,17. Son zamanlarda, Li ve ark. PDLP5 ve PDLP6'nın farklı hücre arayüzlerinde işlev gördüğünü bulmuşlardır13. Bu sonuçlar, PDLP5'in diğer PDLP'lerle yedekli olmayan işlevlere sahip olabileceğini göstermektedir.

PD'nin hücreler arası iletişimdeki kritik işlevi nedeniyle, bitki PD proteinleri PDLP5 ve PDCB1'i ve Şalgam damar temizleme virüsünün (TVCV) viral hücreden hücreye hareket proteinini (MP) hücre biyolojisi deneyleri için basit, kullanışlı ve güvenilir PD belirteçleri olarak dağıtmak için bir protokol geliştirdik. Daha fazla doğrulama için, örneklenen dokuların anilin mavisi boyanması kullanılarak PD'nin görselleştirilmesi paralel olarak ilerledi. PDLP5, PDCB1 ve TVCV MP'nin PD lokalizasyonu için açıklanan protokoller, canlı bitkilerde herhangi bir hücresel veya patojen türevli proteinin potansiyel PD lokalizasyonunu analiz etmek için kolayca uyarlanabilir.

Protokol

Bu çalışmada kullanılan reaktiflerin ve ekipmanların detayları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. Bitki büyümesi

  1. Nicotiana benthamiana tohumlarını ıslak toprakta, 23 ° C'de, 16 saat ışık ve 8 saat karanlıkta kontrollü bir ortam odasında büyütün.
  2. Yaklaşık 2 hafta sonra, fideleri köklerinin etrafındaki turba peletleri ile dikkatlice daha büyük saksılara aktarın ve agroinfiltrasyon deneyleri için 4-5 hafta boyunca aynı koşullar altında büyümeye devam edin.
    NOT: Bitkileri çiçek açmaya başladıklarında kullanmayın, çünkü GFP birikimi çiçeklenme aşamasında18 azalacaktır.

2. Vektör yapımı

  1. Q5 Yüksek Sadakatli DNA Polimeraz ile ilgilenilen kodlama dizilerini çoğaltmak için PCR kullanın ve bunları ticari olarak temin edilebilen bir BP Klonaz kiti kullanarak BP reaksiyonu19 ile giriş vektörü pDONR207'ye klonlayın.
  2. Elde edilen giriş plazmitlerindeki hedef genleri, hedef proteinlerin C-terminaline kaynaşmış EGFP etiketi ile plazmitler üretmek için ticari olarak temin edilebilen bir LR Klonaz kiti kullanarak LR reaksiyonu19 ile hedef vektör pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1'e aktarın.
  3. Tüm yapıları PCR ve sıralamaile doğrulayın 19.

3. Tarımsal Filtrasyon

  1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 hücreleri, LB agar plakaları üzerinde farklı vektörler içerir ve 28 °C'nin altında 2 gün inkübe edilir.
  2. Tek bir koloniyi 2 mL LB et suyuna aktarın ve gece boyunca 28 ° C'de çalkalama (250 rpm) ile inkübe edin.
  3. Gece boyunca kültürden 1 mL çıkarın, ardından 4 mL taze LB suyu ekleyin ve aynı koşullar altında 1 saat yeniden kültürleyin.
  4. Bakteriyel süspansiyonu infiltrasyon tamponu (MgCl2, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5.6).
  5. OD600 = 0.1'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için farklı bakteri süspansiyonlarını 1: 1 (v / v) oranında karıştırın. (isteğe bağlı).
  6. Bakteriyel süspansiyonu yumuşak çalkalama ile oda sıcaklığında 3 saat inkübe edin.
  7. 1 mL iğnesiz tek kullanımlık şırınga ile farklı bitkilerden tamamen genişlemiş yaprakların abaksiyal yüzeyine sızın ve sızan alanı (çevreleyen, sızmamış dokudan daha koyu bir renk) su geçirmez bir kalemle işaretleyin.
  8. Bu protokolün Konfokal mikroskopi bölümüne ilerleyin (adım 5).
    NOT: İlgilenilen bitki türlerinin dönüşümü için uygun olan diğer Agrobacterium tumefaciens suşları da kullanılabilir.

4. Anilin mavisi lekesi

  1. Bir mikroskop lamına200 μL% 1 anilin mavisi (50 mM potasyum fosfat tamponunda, pH 8.0) bir alikot ekleyin.
  2. Damardan yaklaşık 0,5 cm × 0,5 cm uzakta sızan alanı bir bıçakla eksize edin ve yaprak doku örneklerini mikroskop lamı üzerindeki anilin mavisi solüsyonuna (abaksiyal tarafı yukarı) aktarın ve yaprak doku numunelerinin anilin mavisi solüsyonuna batırıldığından emin olun ve ardından bir kapak camı (22 mm x 50 mm) ile örtün.
  3. Mikroskop slaytlarını numunelerle birlikte bir vakum pompasına bağlı bir kurutucuya yerleştirin ve 2 dakika (<0.8 Pa) boşaltın, ardından basıncın yavaşça serbest bırakılması ve karanlıkta oda sıcaklığında 30 dakika inkübasyon yapın.
  4. Anilin mavisinin floresan sinyalini, uyumlu yazılıma sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop altında görselleştirin.
    NOT: Burada Huang ve ark.20 tarafından üretilen anilin mavisi boyama yöntemi kullanılmıştır. Bu tekniğin bir modifikasyonunda, aynı deney 2 dakikalık vakum adımı olmadan gerçekleştirildi, bu da benzer sonuçlar verdi ve anilin boyama için vakumlu kurutmanın gerekli olmadığını düşündürdü. Ayrıca, anilin mavisi lekesinin konsantrasyonu ve lekelenme süresi, yaprak dokusunun kaynağına vb. göre değişebilir.

5. Konfokal mikroskopi

  1. Sızmadan sonra farklı zaman noktalarında iki bitkiden iki yaprak hasat edin. Sızma bölgesini bir bıçakla damardan yaklaşık 0,5 cm × 0,5 cm'lik dilimler halinde kesin.
    1. Doku örneklerini bir mikroskop lamının orta kısmındaki bir damla steril suya (abaksiyal tarafı yukarı) yerleştirin ve kabarcıkları önlemek için bir kapak camı (22 mm x 50 mm) ile örtün.
  2. CFP, GFP ve RFP sinyallerinin tespiti için uyarma dalga boylarının sırasıyla 405 nm, 488 nm ve 561 nm olduğundan ve algılama için emisyon filtrelerinin CFP için 410-602 nm ve EGFP ve RFP için 400-602 nm olduğundan emin olun, iğne deliği 1 AU ve Ana Kazanç 769 V olarak ayarlanmıştır.
  3. Sızmadan 1 gün, 2 gün, 3 gün, 5 gün, 7 gün ve 10 gün sonra uyumlu yazılıma sahip bir lazer taramalı konfokal mikroskop kullanarak sızan alandaki otomatik floresan etiketlerin floresan sinyalini görselleştirin.
    1. Floresan sinyalli hücreleri bulmak için 10x objektif lens ve GFP filtreleri kullanın ve ardından hücre altı lokalizasyonun görselleştirilmesi ve görüntü kaydı için 40x objektif lense geçin.
  4. En az iki bağımsız biyolojik kopya kullanarak her koşul için 20 görüntü toplayın.
  5. Hücrenin çevresindeki sinyalin tanısal noktasal görünümüne dayalı olarak test edilen proteinin PD lokalizasyonuskoru 21,22.
    NOT: Bilinmeyen bir proteinin hücre altı lokalizasyonunu tespit ederken, en az üç bitki kullanılması önerilir.

6. Veri analizi

  1. Kanalları bölmek ve görselleştirme için ölçek çubuğunu görüntülere eklemek için Fiji yazılımını kullanın.
  2. Farklı zaman noktalarında GFP (MP, PDCB1 ve PDLP5 için) veya CFP (anilin mavisi boyama için) floresan yoğunluğunu değerlendirmek için her görüntünün ortalama gri tonlama değerini ölçmeden önce kanalları ayırmak için Fiji yazılımını kullanın.
  3. GFP (MP, PDCB1 ve PDLP5 için) veya CFP (anilin mavisi boyama için) görüntülerinin normalleştirilmesinden önce kanalları bölmek için Fiji yazılımını kullanın. Görüntünün alanı ölçüldü ve PD punkta manuel olarak sayıldı. 100μm2'deki PD punkta sayısı hesaplandı.
  4. İstatistik ve grafik yazılımı ile farklı örnekler ve farklı zaman noktaları arasındaki P değerlerini belirlemek için Tukey'in çoklu karşılaştırma testi23 ile iki yönlü ANOVA kullanın.
    NOT: Tek kanallı bir floresan görüntü için, her pikselin gri tonlama değeri, onokta 24'ün floresan yoğunluğunu temsil eder. Burada, her bir numunenin farklı zaman noktalarında floresan yoğunluğunu değerlendirmek için ortalama gri tonlama değeri kullanılmıştır.

Sonuçlar

Bitki fizyolojisinde PH fonksiyonu ve patojenlerle etkileşimler üzerine yapılan çalışmaları kolaylaştırmak için, PD lokalizasyonu için üç basit ve güvenilir referans protein geliştirilmiştir. İki hücresel PD proteini ve bitki tobamovirüsü TVCV tarafından kodlanan patojen türevli bir MP proteini seçildi. Bu proteinlerin hücre altı lokalizasyonu, her bir proteinin C-terminaline kaynaşmış bir otofloresan raportör EGFP kullanılarak görselleştirildi. Alternatif...

Tartışmalar

Normal bitki gelişimi ve morfogenezi sırasında ve ayrıca bitki-patojen etkileşimleri sırasında bitki hücreler arası iletişim ve hücreden hücreye taşınımın herhangi bir hücre biyolojik çalışması, hem endojen hem de patojen kodlu proteinlerin bitki hücreler arası bağlantılarına, plazmodesmata (PD) sıralamasının tespit edilmesini ve izlenmesini gerektirir. Bu deneyler, ister endojen ister patojen kaynaklı olsun, PD'ye sadık ve tutarlı bir şekilde lokalize ol...

Açıklamalar

Yazarlar hiçbir rekabet çıkarı beyan etmezler.

Teşekkürler

VC laboratuvarındaki çalışma, NIH (R35GM144059), NSF (MCB 1913165 ve IOS 1758046) ve BARD (IS-5276-20) tarafından VC'ye verilen hibelerle desteklenmiştir. Fon sağlayıcıların çalışma tasarımı, veri toplama ve yorumlama veya yayınlama kararında hiçbir rolü yoktu.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

Referanslar

  1. Lee, J., et al. A plasmodesmata-localized protein mediates crosstalk between cell-to-cell communication and innate immunity in Arabidopsis. The Plant Cell. 23 (9), 3353-3373 (2011).
  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21 (2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880 (2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128 (2022).
  7. Levy, A., Erlanger, M., Rosenthal, M., Epel, B. L. A plasmodesmata-associated β-1,3-glucanase in Arabidopsis. The Plant J. 49 (4), 669-682 (2007).
  8. Kankanala, P., Czymmek, K., Valent, B. Roles for rice membrane dynamics and plasmodesmata during biotrophic invasion by the blast fungus. The Plant Cell. 19 (2), 706-724 (2007).
  9. Aung, K., et al. Pathogenic bacteria target plant plasmodesmata to colonize and invade surrounding tissues. The Plant Cell. 32 (3), 595-611 (2020).
  10. Cui, W., Lee, J. Arabidopsis callose synthases CalS1/8 regulate plasmodesmal permeability during stress. Nat Plants. 2 (5), 160 (2016).
  11. Liu, N. J., et al. Phytosphinganine affects plasmodesmata permeability via facilitating PDLP5-stimulated callose accumulation in Arabidopsis. Mol Plant. 13 (1), 128-143 (2020).
  12. Caillaud, M. C., et al. The plasmodesmal protein PDLP1 localizes to haustoria-associated membranes during downy mildew infection and regulates callose deposition. PLoS Pathog. 10 (11), e1004496 (2014).
  13. Li, Z., Su-Ling, L., Christian, M., Walley, J. W., Aung, K. Plasmodesmata-located protein 6 regulates plasmodesmal function in Arabidopsis vasculature. The Plant Cell. , (2024).
  14. Chen, X., et al. Arabidopsis PDLP7 modulated plasmodesmata function is related to BG10-dependent glucosidase activity required for callose degradation. Sci Bull. , (2024).
  15. Simpson, C., Thomas, C., Findlay, K., Bayer, E., Maule, A. J. An Arabidopsis GPI-anchor plasmodesmal neck protein with callose binding activity and potential to regulate cell-to-cell trafficking. The Plant Cell. 21 (2), 581-594 (2009).
  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7 (2008).
  17. Lim, G., et al. Plasmodesmata localizing proteins regulate transport and signaling during systemic acquired immunity in plants. Cell Host Microbe. 19 (4), 541-549 (2016).
  18. Sheludko, Y. V., Sindarovska, Y. R., Gerasymenko, I. M., Bannikova, M. A., Kuchuk, N. V. Comparison of several Nicotiana species as hosts for high-scale Agrobacterium-mediated transient expression. Biotechnol Bioeng. 96 (3), 608-614 (2007).
  19. Walhout, A. J. M., et al. GATEWAY recombinational cloning: Application to the cloning of large numbers of open reading frames or ORFeomes. Methods Enzymol. 328, 575-592 (2000).
  20. Huang, C., et al. dsRNA-induced immunity targets plasmodesmata and is suppressed by viral movement proteins. The Plant Cell. 35 (10), 3845-3869 (2023).
  21. Roberts, I. M., et al. Dynamic changes in the frequency and architecture of plasmodesmata during the sink-source transition in tobacco leaves. Protoplasma. 218, 31-44 (2001).
  22. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. The plasmodesmal localization signal of TMV MP is recognized by plant synaptotagmin SYTA. mBio. 9 (4), e01314-e01318 (2018).
  23. Ward, S. J., Ramirez, M. D., Neelakantan, H., Walker, E. A. Cannabidiol prevents the development of cold and mechanical allodynia in paclitaxel-treated female C57Bl6 mice. Anesth Analg. 113 (4), 947-950 (2011).
  24. Erkkilä, M. T., et al. Widefield fluorescence lifetime imaging of protoporphyrin IX for fluorescence-guided neurosurgery: An ex vivo feasibility study. J Biophotonics. 12 (6), e201800378 (2019).
  25. Levy, A., Zheng, J. Y., Lazarowitz, S. G. The tobamovirus Turnip vein clearing virus 30-kilodalton movement protein localizes to novel nuclear filaments to enhance virus infection. J Virol. 87 (11), 6428-6440 (2013).
  26. Yuan, C., Lazarowitz, S. G., Citovsky, V. Identification of a functional plasmodesmal localization signal in a plant viral cell-to-cell-movement protein. mBio. 7 (1), e2052-e2015 (2016).
  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695 (2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

BiyolojiSay 213Plasmodesmatah cre alt lokalizasyonh creden h creye hareketbitki vir slerikonfokal mikroskopiagroinfiltrasyon

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Bize Ulaşın

KÜTÜPHANEYE TAVSİYE ET

JoVE HABER BÜLTENLERİ

Araştırma

Eğitim

Yazarlar

Kütüphaneciler

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır