Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Zusammenfassung

Plasmodesmen sind membranöse Nanoporen, die das Zytoplasma benachbarter Pflanzenzellen verbinden und den Zell-zu-Zell-Transport von Nährstoffen, Makromolekülen sowie eindringenden Viren ermöglichen. Plasmodesmata spielen eine grundlegende Rolle bei der Regulation der interzellulären Kommunikation und tragen zur Pflanzenentwicklung, zu Umweltreaktionen und Interaktionen mit viralen Krankheitserregern bei. Die Entdeckung der plasmosmodesmalen Lokalisation von pflanzlichen oder viralen Proteinen könnte nützliche funktionelle Informationen über das Protein liefern und ist wichtig für das Verständnis der Mechanismen von Pflanzen-Virus-Interaktionen. Um diese Studien zu erleichtern, beschreiben wir ein Protokoll für die konfokale mikroskopische Analyse verschiedener plasmodesmaler Zielproteine, um den besten plasmodesmalen Marker für die Untersuchung der Virus-Plasmodesmata-Wechselwirkungen oder des plasmodesmalen Transports auszuwählen. Konkret werden die Analysen dieser Ereignisse anhand des Zell-zu-Zell-Bewegungsproteins (MP) des Turnip-Venen-Clearing-Virus (TVCV), des Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) und des Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1 (PDCB1) veranschaulicht. Die plasmosmodesmalen Lokalisationsdaten des Proteins werden parallel zur globalen Visualisierung der Plasmodesmen mittels Anilinblau-Färbung der beprobten Gewebe analysiert. Diese Ansätze können leicht angepasst werden, um die plasmmodesmale Lokalisation von zellulären oder pathogenen Proteinen in planta zu analysieren.

Einleitung

Plasmodesmata (PD) spielen eine grundlegende Rolle bei der Kontrolle der Pflanzenentwicklung, der Umweltreaktionen und der Wechselwirkungen mit viralen Krankheitserregern durch die Regulation der interzellulären Kommunikation ^1,2. Parkinson bildet sich zunächst während der Zytokinese, wobei Hunderte von Parkinson zwischen den beiden Tochterzellen in die neue Zelle eingefügt werden und so die Kanäle für die Zell-zu-Zell-Kommunikation liefern ^3,4. PD ist eine membranreiche Struktur, die die vom endoplasmatischen Retikulum (ER) abgeleitete Membran, ein trans-PD-Desmotubulum, im zentralen Teil der Poren enthält, die von der Plasmamembran^ausgekleidet sind ^3,4. Vergleichende proteomische Ansätze identifizierten zahlreiche funktionelle Parkinson-Proteine, darunter β-1,3-Glucanasen (BGs), Callose-Synthasen (CALSs), Plasmodesmata-lokalisierte Proteine (PDLPs), Callose-bindende Proteine (PDCBs), Transmembranregionenproteine mit mehreren C2-Domänen (MCTPs)³ und leucinreiche Repeatrezeptor-ähnliche Kinasen (RLK)⁵. Vor kurzem haben Kirk et al. ein Werkzeug namens Plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1) entwickelt, das es ermöglichte, neue Parkinson-Proteine in 22 Pflanzenarten^{vorherzusagen 6}. PD variiert in Durchlässigkeit und Struktur während der Pflanzenentwicklung und der Reaktion auf verschiedene Stressfaktoren. Die Ablagerung und Hydrolyse von Callose (β-1,3-Glucan) in der Halsregion, die die Parkinson-Krankheit umgibt, ist einer der weithin bekannten Mechanismen der Parkinson-Regulation⁷.

Viele pathogene Mikroben, darunter Pilze, Bakterien und Viren, können die Erweiterung oder Struktur der Parkinson-Krankheit während ihrer Infektion manipulieren ^2,8,9. Magnaporthe oryzae, der Erreger der Reisexplosion, setzt intrazelluläre invasive Hyphen ein, um durch PD⁸ von Zelle zu Zelle zu gelangen. Ein bakterieller Erreger Pseudomonas syringae pv. Die Tomate benötigt ein Effektorprotein HopO1-1 für die interzelluläre Bewegung und Ausbreitung in der Wirtspflanze durch Interaktion mit und Destabilisierung von PDLP7, wodurch der molekulare Fluss in benachbarten Zellen in Arabidopsis⁹ erhöht wird. Pflanzenviren sind jedoch vielseitiger bei der Regulierung von Parkinson während ihrer interzellulären Übertragung, wobei das virale Bewegungsprotein (MP) die Bewegung von Zelle zu Zelle fördert². Aufgrund ihrer wichtigen Funktion bei der Regulierung der Pflanzenentwicklung und des Pflanzenwachstums sowie ihrer Interaktion mit pflanzenpathogenen Mikroben hat die Parkinson-Krankheit in den letzten Jahren zunehmend an Bedeutung gewonnen. In Arabidopsis thaliana gibt es zwei Haupttypen von PD-funktionellen Proteinen, PDLPs (1-8) und PDCBs (1-5), und viele von ihnen, z. B. PDLP5 ^1,10,11, PDLP1¹², PDLP6¹³, PDLP7¹⁴ und PDCB1¹⁵, spielten eine Rolle bei der Manipulation der PD-Permeabilität durch Regulation der Calloseablagerung. Es wurde jedoch festgestellt, dass einige PDLPs eine funktionelle Redundanz aufwiesen, z.B. beeinflussten Knockout-Mutanten von pdlp1 und pdlp1,2 den molekularen Transport nicht, obwohl Doppel-Knockout-Mutanten von pdlp1,3 und pdlp2,3 eine erhöhte plasmosmodesmale Permeabilität zeigten¹⁶. Interessanterweise führt eine Herunterregulation/Knockout oder Überexpression von PDLP5 allein zu einer Erhöhung bzw. Abnahme der plasmosmodesmalen Permeabilität ^1,17. Kürzlich haben Li et al. herausgefunden, dass PDLP5 und PDLP6 an unterschiedlichen Zellgrenzflächen funktionieren¹³. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass PDLP5 möglicherweise nicht redundante Funktionen mit anderen PDLPs hat.

Aufgrund der kritischen Funktion von Parkinson in der interzellulären Kommunikation haben wir ein Protokoll entwickelt, um die pflanzlichen Parkinson-Proteine PDLP5 und PDCB1 sowie das virale Zell-zu-Zell-Bewegungsprotein (MP) des Turnip-Venen-Clearing-Virus (TVCV) als einfache, bequeme und zuverlässige Parkinson-Marker für zellbiologische Experimente einzusetzen. Zur weiteren Verifizierung wurde parallel die Visualisierung der Parkinson-Krankheit mittels Anilinblau-Färbung der entnommenen Gewebe durchgeführt. Die beschriebenen Protokolle für die PD-Lokalisierung von PDLP5, PDCB1 und TVCV MP können leicht angepasst werden, um eine potenzielle PD-Lokalisierung von zellulären oder pathogenen Proteinen in lebenden Pflanzen zu analysieren.

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Pflanzenwachstum

1. Nicotiana benthamiana Samen in feuchter Erde in einer kontrollierten Umgebung bei 23 °C unter 16 h Licht und 8 h Dunkelheit anbauen.
2. Nach ca. 2 Wochen setzen Sie die Sämlinge mit den Torfpellets um die Wurzeln vorsichtig in größere Töpfe um und setzen Sie das Wachstum unter den gleichen Bedingungen für die Agroinfiltrationsversuche 4-5 Wochen lang fort.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Pflanzen nicht, wenn sie zu blühen beginnen, da die GFP-Akkumulation im Stadium des Blütenstandes¹⁸ abnimmt.

2. Vektor-Konstruktion

1. Verwenden Sie PCR, um die kodierenden Sequenzen von Interesse mit Q5 High-Fidelity DNA-Polymerase zu amplifizieren und sie durch die BP-Reaktion¹⁹ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen BP-Clonase-Kits in den Eintrittsvektor pDONR207 zu klonieren.
2. Übertragen Sie die Zielgene in den resultierenden Eintrittsplasmiden in den Zielvektor pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 durch die LR-Reaktion¹⁹ unter Verwendung eines kommerziell erhältlichen LR-Clonase-Kits, um Plasmide herzustellen, bei denen der EGFP-Tag an den C-Terminus der Zielproteine fusioniert ist.
3. Verifizieren Sie alle Konstrukte durch PCR und Sequenzierung¹⁹.

3. Agroinfiltration

1. Streak Agrobacterium tumefaciens EHA105 Zellen, die verschiedene Vektoren auf LB-Agarplatten enthalten und 2 Tage lang unter 28 °C inkubiert wurden.
2. Eine einzelne Kolonie in 2 mL LB-Bouillon überführen und über Nacht bei 28 °C unter Rühren (250 U/min) inkubieren.
3. 1 ml aus der Übernachtkultur nehmen, anschließend 4 ml frische LB-Brühe hinzufügen und 1 h unter den gleichen Bedingungen rekulturieren.
4. Die bakterielle Suspension wird mit Infiltrationspuffer (MgCl₂, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
5. Mischen Sie verschiedene bakterielle Suspensionen im Verhältnis 1:1 (v/v), um eine Endkonzentration von OD₆₀₀ = 0,1 zu erreichen. (fakultativ).
6. Inkubieren Sie die bakterielle Suspension 3 h lang bei Raumtemperatur unter leichtem Rühren.
7. Infiltrieren Sie die abaxiale Oberfläche der vollständig expandierten Blätter verschiedener Pflanzen mit einer nadellosen 1-ml-Einwegspritze und markieren Sie den infiltrierten Bereich (eine dunklere Farbe als das umgebende, nicht infiltrierte Gewebe) mit einem wasserfesten Stift.
8. Fahren Sie mit dem Abschnitt Konfokale Mikroskopie dieses Protokolls fort (Schritt 5).
   HINWEIS: Andere Stämme von Agrobacterium tumefaciens, die für die Umwandlung von Pflanzenarten von Interesse geeignet sind, können ebenfalls verwendet werden.

4. Anilinblauer Fleck

1. Ein Aliquot von 200 μl 1 % Anilinblau (in 50 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 8,0) wird auf einen Objektträger²⁰ gegeben.
2. Schneiden Sie den infiltrierten Bereich von ca. 0,5 cm × 0,5 cm von der Vene weg mit einer Klinge heraus und überführen Sie die Blattgewebeproben in die Anilinblaulösung (abaxiale Seite nach oben) auf dem Objektträger, stellen Sie sicher, dass die Blattgewebeproben in die Anilinblaulösung getaucht sind, und decken Sie sie dann mit einem Deckglas (22 mm x 50 mm) ab.
3. Legen Sie die Objektträger mit den Proben in einen Exsikkator, der an einer Vakuumpumpe befestigt ist, und evakuieren Sie sie für 2 Minuten (<0,8 Pa), gefolgt von einem langsamen Ablassen des Drucks und einer 30-minütigen Inkubation im Dunkeln bei Raumtemperatur.
4. Visualisieren Sie das Fluoreszenzsignal von Anilinblau unter einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop mit kompatibler Software.
   HINWEIS: Hier wurde die Anilinblau-Färbemethode von Huang et ^al.20 verwendet. In einer Modifikation dieser Technik wurde das gleiche Experiment ohne den 2-minütigen Vakuumschritt durchgeführt, was zu ähnlichen Ergebnissen führte und darauf hindeutet, dass die Vakuumtrocknung für die Anilinfärbung nicht unbedingt erforderlich ist. Außerdem können die Konzentration des Anilinblau-Flecks und die Färbezeit je nach Quelle des Blattgewebes usw. variieren.

5. Konfokale Mikroskopie

1. Ernte zwei Blätter von zwei Pflanzen zu unterschiedlichen Zeitpunkten nach der Infiltration. Schneiden Sie die Infiltrationszone mit einer Klinge in ca. 0,5 cm × 0,5 cm große Scheiben von der Vene entfernt.
   1. Legen Sie die Gewebeproben in einen Tropfen sterilen Wassers (abaxiale Seite nach oben) in den mittleren Teil eines Objektträgers und decken Sie sie mit einem Deckglas (22 mm x 50 mm) ab, wobei Sie darauf achten, dass keine Blasen entstehen.
2. Stellen Sie sicher, dass die Anregungswellenlängen für die Detektion von CFP-, GFP- und RFP-Signalen 405 nm, 488 nm bzw. 561 nm betragen und die Emissionsfilter für die Detektion 410-602 nm für CFP und 400-602 nm für EGFP und RFP betragen, wobei die Lochblende 1 AU und die Master-Verstärkung auf 769 V eingestellt sind.
3. Visualisieren Sie das Fluoreszenzsignal von autofluoreszierenden Tags im infiltrierten Bereich mit einem konfokalen Laserscanning-Mikroskop mit kompatibler Software 1 Tag, 2 Tage, 3 Tage, 5 Tage, 7 Tage und 10 Tage nach der Infiltration.
   1. Verwenden Sie eine 10-fach-Objektivlinse und GFP-Filter, um Zellen mit dem Fluoreszenzsignal zu lokalisieren, und wechseln Sie dann zu einer 40-fach-Objektivlinse, um die subzelluläre Lokalisierung und Bildaufzeichnung zu visualisieren.
4. Sammeln Sie 20 Bilder für jede Bedingung mit mindestens zwei unabhängigen biologischen Replikaten.
5. Score Die PD-Lokalisation des getesteten Proteins basiert auf dem diagnostischen punktuellen Auftreten des Signals an der Peripherie der Zelle^21,22.
   HINWEIS: Beim Nachweis der subzellulären Lokalisation eines unbekannten Proteins wird die Verwendung von mindestens drei Pflanzen empfohlen.

6. Datenanalyse

1. Verwenden Sie die Fidschi-Software, um Kanäle zu teilen und die Maßstabsleiste zur Visualisierung zu den Bildern hinzuzufügen.
2. Verwenden Sie die Fiji-Software, um Kanäle zu teilen, bevor Sie den mittleren Graustufenwert für jedes Bild messen, um die Fluoreszenzintensität von GFP (für MP, PDCB1 und PDLP5) oder CFP (für Anilinblau-Färbung) zu verschiedenen Zeitpunkten zu beurteilen.
3. Verwenden Sie die Fiji-Software, um Kanäle vor der Normalisierung der Bilder von GFP (für MP, PDCB1 und PDLP5) oder CFP (für Anilinblau-Färbung) zu teilen. Der Bereich des Bildes wurde vermessen, und die PD-Punkte wurden manuell gezählt. Es wurde die Anzahl der PD-Punkte pro 100^{μm 2} berechnet.
4. Verwenden Sie die bidirektionale ANOVA mit dem Tukey-Mehrfachvergleichstest²³ , um die P-Werte zwischen den verschiedenen Stichproben und verschiedenen Zeitpunkten mit Statistik- und Grafiksoftware zu bestimmen.
   HINWEIS: Bei einem Einkanal-Fluoreszenzbild stellt der Graustufenwert jedes Pixels die Fluoreszenzintensität dieses Punktes²⁴ dar. Hier wurde der mittlere Graustufenwert verwendet, um die Fluoreszenzintensität jeder Probe zu verschiedenen Zeitpunkten zu beurteilen.

Ergebnisse

Um die Untersuchung der Funktion von Parkinson in der Pflanzenphysiologie und der Wechselwirkungen mit Krankheitserregern zu erleichtern, wurden drei einfache und zuverlässige Referenzproteine für die Parkinson-Lokalisierung entwickelt. Es wurden zwei zelluläre PD-Proteine und ein von Krankheitserregern abgeleitetes MP-Protein ausgewählt, das vom pflanzlichen Tobamovirus TVCV kodiert wird. Die subzelluläre Lokalisation dieser Proteine wurde mit Hilfe eines autofluoreszierenden Repor...

Diskussion

Alle zellbiologischen Untersuchungen der interzellulären Kommunikation und des Zell-zu-Zell-Transports von Pflanzen während der normalen Pflanzenentwicklung und Morphogenese sowie während der Interaktionen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern erfordern den Nachweis und die Überwachung der Sortierung von Proteinen - sowohl endogenen als auch pathogenen, die für pflanzliche interzelluläre Verbindungen kodiert sind, die Plasmodesmata (PD). Diese Experimente würden wesentlich erle...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S