Konfokalmikroskopische Analyse der Proteinsortierung zu Plasmodesmata bei Nicotiana benthamiana

Zusammenfassung

Dieses Protokoll beschreibt die Auswahl optimaler plasmodesmaler Marker für konfokalmikroskopische Analysen von Proteinen, die während Virus-Plasmodesmata-Interaktionen oder des plasmosmodesmalen Transports auf Plasmodesmen abzielen.

Zusammenfassung

Plasmodesmen sind membranöse Nanoporen, die das Zytoplasma benachbarter Pflanzenzellen verbinden und den Zell-zu-Zell-Transport von Nährstoffen, Makromolekülen sowie eindringenden Viren ermöglichen. Plasmodesmata spielen eine grundlegende Rolle bei der Regulation der interzellulären Kommunikation und tragen zur Pflanzenentwicklung, zu Umweltreaktionen und Interaktionen mit viralen Krankheitserregern bei. Die Entdeckung der plasmosmodesmalen Lokalisation von pflanzlichen oder viralen Proteinen könnte nützliche funktionelle Informationen über das Protein liefern und ist wichtig für das Verständnis der Mechanismen von Pflanzen-Virus-Interaktionen. Um diese Studien zu erleichtern, beschreiben wir ein Protokoll für die konfokale mikroskopische Analyse verschiedener plasmodesmaler Zielproteine, um den besten plasmodesmalen Marker für die Untersuchung der Virus-Plasmodesmata-Wechselwirkungen oder des plasmodesmalen Transports auszuwählen. Konkret werden die Analysen dieser Ereignisse anhand des Zell-zu-Zell-Bewegungsproteins (MP) des Turnip-Venen-Clearing-Virus (TVCV), des Arabidopsis Plasmodesmata-Localized Protein 5 (PDLP5) und des Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1 (PDCB1) veranschaulicht. Die plasmosmodesmalen Lokalisationsdaten des Proteins werden parallel zur globalen Visualisierung der Plasmodesmen mittels Anilinblau-Färbung der beprobten Gewebe analysiert. Diese Ansätze können leicht angepasst werden, um die plasmmodesmale Lokalisation von zellulären oder pathogenen Proteinen in planta zu analysieren.

Einleitung

Plasmodesmata (PD) spielen eine grundlegende Rolle bei der Kontrolle der Pflanzenentwicklung, der Umweltreaktionen und der Wechselwirkungen mit viralen Krankheitserregern durch die Regulation der interzellulären Kommunikation ^1,2. Parkinson bildet sich zunächst während der Zytokinese, wobei Hunderte von Parkinson zwischen den beiden Tochterzellen in die neue Zelle eingefügt werden und so die Kanäle für die Zell-zu-Zell-Kommunikation liefern ^3,4. PD ist eine membranreiche Struktur, die die vom endoplasmatischen Retikulu....

Protokoll

Die Einzelheiten zu den Reagenzien und der Ausrüstung, die in dieser Studie verwendet wurden, sind in der Materialtabelle aufgeführt.

1. Pflanzenwachstum

1. Nicotiana benthamiana Samen in feuchter Erde in einer kontrollierten Umgebung bei 23 °C unter 16 h Licht und 8 h Dunkelheit anbauen.
2. Nach ca. 2 Wochen setzen Sie die Sämlinge mit den Torfpellets um die Wurzeln vorsichtig in größere Töpfe um und setzen Sie das Wachstum unter den gleichen Bedingungen für die Agroinfiltrationsversuche 4-5 Wochen lang fort.
   HINWEIS: Verwenden Sie die Pflanzen ni....

Diskussion

Alle zellbiologischen Untersuchungen der interzellulären Kommunikation und des Zell-zu-Zell-Transports von Pflanzen während der normalen Pflanzenentwicklung und Morphogenese sowie während der Interaktionen zwischen Pflanzen und Krankheitserregern erfordern den Nachweis und die Überwachung der Sortierung von Proteinen - sowohl endogenen als auch pathogenen, die für pflanzliche interzelluläre Verbindungen kodiert sind, die Plasmodesmata (PD). Diese Experimente würden wesentlich erle.......

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S