本氏烟草中胞间连丝蛋白分选的共聚焦显微镜分析

摘要

该方案描述了在病毒-胞间连丝相互作用或胞间连丝运输过程中基于共聚焦显微镜分析蛋白质靶向胞间连丝的最佳胞间连丝标记物的选择。

摘要

胞间连丝是膜状纳米孔，连接相邻植物细胞的细胞质，使营养物质、大分子以及入侵病毒的细胞间运输成为可能。胞间连丝在细胞间通讯的调节中起着重要作用，有助于植物发育、环境反应以及与病毒病原体的相互作用。发现植物或病毒蛋白的胞间连丝定位可以提供有关蛋白质的有用功能信息，并且对于理解植物-病毒相互作用的机制非常重要。为了促进这些研究，我们描述了一种基于共聚焦显微镜分析不同胞质间连丝靶向蛋白的方案，以选择用于研究病毒-胞间连丝相互作用或胞浆连丝转运的最佳胞浆间连丝标记物。具体来说，使用 萝卜静脉清除病毒 （TVCV） 的细胞间运动蛋白 （MP）、 拟南芥 胞间连丝定位蛋白 5 （PDLP5） 和胞间连丝胼胝结合蛋白 1 （PDCB1） 来说明这些事件的分析。使用采样组织的苯胺蓝染色，将蛋白质胞间连丝定位数据与胞间连丝的整体可视化并行分析。这些方法可以很容易地用于分析植物中任何细胞或病原体蛋白的胞间连丝定位。

引言

胞间连丝 （PD） 通过调节细胞间通讯，在控制植物发育、环境反应和与病毒病原体的相互作用中发挥重要作用 ^1,2。PD 最初在胞质分裂过程中形成，数百个 PD 插入两个子细胞之间的新细胞中，从而为细胞间通讯提供通道 ^3,4。PD 是一种富含膜的结构，包含内质网 （ER） 衍生的膜，即反式 PD 桥管，位于质膜衬垫的孔的中央部分 ^3,4。比较蛋白质组学方法鉴定了许多 PD 功能蛋白，包括 β-1,3-葡聚糖酶 （BG）、胼胝质合酶 （CALS）、胞间连丝定位蛋白 （PDLP）、胼胝体结合蛋白 （PDCB）、多个 C2 结构域跨膜区蛋白 （MCTP）³ 和富含亮氨酸的重复受体样激酶 （RLK）⁵。最近，Kirk 等人开发了一种称为计算机蛋白质组胞间连丝 1 （PIP1） 的工具，该工具可以预测 22 种植物物种中的新 PD 蛋白⁶。PD 在植物发育过程中的渗透性和结构以及对各种胁迫....

研究方案

本研究中使用的试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 植物生长

1. 在 23°C 的受控环境室中，在 16 小时的光照和 8 小时的黑暗下，在潮湿的土壤中种植 Nicotiana benthamiana 种子。
2. 大约 2 周后，小心地将根部周围带有泥炭颗粒的幼苗转移到更大的花盆中，并在相同条件下继续生长 4-5 周以进行农杆菌渗透实验。
   注意：当植物开始开花时不要使用它们，因为 GFP 积累会在花序阶段¹⁸ 减少。

2. 载体构建

1. 使用 PCR 用 Q5 高保真 DNA 聚合酶扩增目标编码序列，并使用市售的 BP Clonase 试剂盒通过 BP 反应¹⁹ 将它们克隆到入门载体 pDONR207 中。
2. 使用市售的 LR Clonase 试剂盒，通过 LR 反应¹⁹ 将所得进入质粒中的靶基因转移到目标载体 pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 中，以产生带有 EGFP 标签融合到....

结果

为了促进 PD 在植物生理学中的功能以及与病原体相互作用的研究，开发了三种简单可靠的参比蛋白用于 PD 定位。筛选出植物生育病毒 TVCV 编码的 2 种细胞 PD 蛋白和 1 种病原体来源的 MP 蛋白。使用融合到每种蛋白质的 C 端的自发荧光报告基因 EGFP 观察这些蛋白质的亚细胞定位。在另一种方法中，使用 PD 相关胼胝质沉积物的苯胺蓝染色来可视化 PD。实验表明，PDLP5 和 MP 都.......

讨论

在正常的植物发育和形态发生以及植物与病原体相互作用期间，对植物细胞间通讯和细胞间运输的任何细胞生物学研究都需要检测和监测蛋白质的分选 - 内源性和病原体编码的 - 植物细胞间连接，胞间连丝 （PD）。通过使用忠实且一致地定位于 PD 的参考蛋白（无论是内源性还是病原体来源的）来极大地促进这些实验，从而装饰和可视化这些结构。通过选择三种已知的 PD ?.......

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S