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요약

이 프로토콜은 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데스마 수송 중 플라스모데스마타를 표적으로 하는 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 최적의 플라스모데스마 마커 선택에 대해 설명합니다.

초록

Plasmodesmata는 인접한 식물 세포의 세포질을 연결하고 영양분, 거대분자 및 침입 바이러스의 세포 간 이동을 가능하게 하는 막질 나노 기공입니다. Plasmodesmata는 세포 간 통신 조절에 근본적인 역할을 하여 식물 발달, 환경 반응 및 바이러스 병원체와의 상호 작용에 기여합니다. 식물 또는 바이러스 단백질의 plasmodesmal localization을 발견하는 것은 단백질에 대한 유용한 기능적 정보를 제공할 수 있으며 식물-바이러스 상호 작용의 메커니즘을 이해하는 데 중요합니다. 이러한 연구를 용이하게 하기 위해 바이러스-플라스모데스마타 상호 작용 또는 플라스모데즘 수송을 연구하기 위한 최상의 플라스모데즘 마커를 선택하기 위해 다양한 플라스모데스 표적 단백질의 컨포칼 현미경 기반 분석을 위한 프로토콜을 설명합니다. 구체적으로, 순무 정맥 청소 바이러스 (TVCV)의 세포 간 이동 단백질(MP), 애기장대 Plasmodesmata-Localized Protein 5(PDLP5) 및 Plasmodesmata Callose-Binding Protein 1(PDCB1)을 사용하여 이러한 이벤트의 분석을 설명합니다. 단백질 plasmodesmal localization 데이터는 샘플링된 조직의 아닐린 블루 염색을 사용하여 plasmodesmata의 전체 시각화와 병행하여 분석됩니다. 이러한 접근법은 planta의 세포 또는 병원체 단백질의 plasmodesmal localization을 분석하는 데 쉽게 적용할 수 있습니다.

서문

Plasmodesmata (PD)는 세포 간 통신 조절을 통해 식물 발달, 환경 반응 및 바이러스 병원체와의 상호 작용을 제어하는 데 근본적인 역할을 합니다 1,2. PD는 초기에 사이토키네시스(cytokinesis) 중에 형성되며, 수백 개의 PD가 두 딸 세포 사이의 새로운 세포에 삽입되어 세포 간 통신을 위한 채널을 공급합니다 3,4. PD는 원형질막(3,4)에 의해 늘어선 기공의 중앙 부분에 소포체(ER) 유래 막, 트랜스-PD 데스모튜불(trans-PD desmotubule)을 포함하는 막이 풍부한 구조입니다. 비교 단백질체학 접근법은 β-1,3-glucanases(BG), callose synthase(CALS), plasmodesmata-located proteins(PDLP), callose-binding proteins(PDCB), multiple C2 domains transmembrane region proteins(MCTP)3 및 류신이 풍부한 반복 수용체 유사 kinases(RLK)5를 포함한 수많은 PD 기능성 단백질을 식별했습니다. 최근 Kirk et al.은 plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1)이라는 도구를 개발하여 22 종의 식물6에서 새로운 PD 단백질을 예측할 수 있게 되었습니다. PD는 식물 발달 및 다양한 스트레스에 대한 반응 중에 투과성과 구조가 다양합니다. PD를 둘러싼 목 부위의 칼로스(β-1,3-glucan) 침착 및 가수분해는 PD 조절7의 널리 알려진 메커니즘 중 하나입니다.

곰팡이, 박테리아 및 바이러스를 포함한 많은 병원성 미생물은 감염 중에 PD 확장 또는 구조를 조작할 수 있습니다 2,8,9. 벼 돌풍의 원인 물질인 Magnaporthe oryzae는 세포 내 침습성 균사를 배치하여 PD8을 통해 세포에서 세포로 이동합니다. 세균성 병원체 Pseudomonas syringae pv. 토마토는 세포 간 이동을 위해 effector protein HopO1-1이 필요하며, PDLP7과 상호 작용하고 불안정하게 만들어 숙주 식물에서 확산시켜 애기장대9의 인접 세포에서 분자 플럭스를 증가시킵니다. 그러나 식물 바이러스는 바이러스 이동 단백질(MP)이 세포 간 이동을 촉진하여 세포 간 전염 중에 PD를 조절하는 데 더 다양합니다2. PD는 식물의 발달과 성장을 조절하는 중요한 기능과 식물 병원성 미생물과의 상호 작용으로 인해 최근 몇 년 동안 점점 더 주목을 받고 있습니다. 애기장대(Arabidopsis thaliana)에는 PDLP(1-8)와 PDCB(1-5)의 두 가지 주요 유형의 PD 기능성 단백질이 있으며, 그 중 많은 유형, 예를 들어 PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 및 PDCB115는 칼로스 침착의 조절을 통해 PD 투과성을 조작하는 역할을 하는 것으로 밝혀졌습니다. 그러나, 일부 PDLP는 기능적 중복성을 갖는 것으로 나타났는데, 예를 들어, pdlp1,3 및 pdlp2,3의 이중 knockout 돌연변이체는 증가된 플라스모데스말 투과성을 보였지만, pdlp1,3 및 pdlp1,2의 knockout 돌연변이체는 분자 이동에 영향을 미치지 않았다16. 흥미롭게도, PDLP5 단독의 하향 조절/녹아웃 또는 과발현은 각각 플라스모드 투과성의 증가 또는 감소를 초래합니다 1,17. 최근에, Li 등은 PDLP5 및 PDLP6가 서로 다른 세포 계면에서 기능한다는 것을 발견했다13. 이러한 결과는 PDLP5가 다른 PDLP와 중복되지 않는 기능을 가질 수 있음을 나타냅니다.

세포 간 통신에서 PD의 중요한 기능으로 인해 당사는 식물 PD 단백질 PDLP5 및 PDCB1과 순무 정맥 청소 바이러스 (TVCV)의 바이러스 세포 간 이동 단백질(MP)을 세포 생물학 실험을 위한 간단하고 편리하며 신뢰할 수 있는 PD 마커로 배포하기 위한 프로토콜을 개발했습니다. 추가 검증을 위해 샘플링된 조직의 아닐린 블루 염색을 사용한 PD의 시각화가 병렬로 진행되었습니다. PDLP5, PDCB1 및 TVCV MP의 PD 국소화에 대해 설명된 프로토콜은 살아있는 식물에서 세포 또는 병원체 유래 단백질의 잠재적인 PD 국소화를 분석하기 위해 쉽게 조정할 수 있습니다.

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프로토콜

이 연구에 사용된 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. 식물 성장

  1. Nicotiana benthamiana 씨앗을 23 ° C의 통제 된 환경 챔버에서 16 시간의 빛과 8 시간의 어둠 아래에서 젖은 토양에서 성장시킵니다.
  2. 약 2 주 후, 뿌리 주위의 이탄 알갱이가있는 묘목을 조심스럽게 더 큰 화분으로 옮기고 그로인 여과 실험을 위해 4-5 주 동안 동일한 조건에서 성장을 계속합니다.
    참고 : 꽃이 피기 시작할 때 식물을 사용하지 마십시오., GFP 축적은 꽃이 핌단계 18에서 감소합니다.

2. 벡터 구성

  1. PCR을 사용하여 Q5 High-Fidelity DNA Polymerase로 관심 있는 코딩 염기서열을 증폭하고 상업적으로 이용 가능한 BP Clonase kit를 사용하여 BP 반응19 에 의해 entry vector pDONR207로 클로닝합니다.
  2. 결과적으로 입수된 entry plasmids의 target genes를 상업적으로 이용 가능한 LR Clonase kit를 사용하여 LR 반응19 에 의해 대상 벡터 pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1로 전달하여 target 단백질의 C-말단에 융합된 EGFP tag를 가진 plasmid를 생성합니다.
  3. PCR 및 염기서열분석19로 모든 구조를 확인합니다.

3. 사로인침습

  1. LB 한천 플레이트에 다른 벡터를 포함하는 줄무늬 Agrobacterium tumefaciens EHA105 세포를 28°C에서 2일 동안 배양합니다.
  2. 단일 콜로니를 2mL의 LB 육수에 옮기고 교반(250rpm)으로 28°C에서 밤새 배양합니다.
  3. 하룻밤 배양액에서 1mL를 제거한 다음 신선한 LB 육수 4mL를 추가하고 동일한 조건에서 1시간 동안 재배양합니다.
  4. 박테리아 현탁액을 침투 완충액(MgCl2, 10mM; MES, 10mM, pH 5.6)를 참조하십시오.
  5. 서로 다른 박테리아 현탁액을 1:1(v/v)의 비율로 혼합하여 최종 농도를 OD600 = 0.1로 만듭니다. (선택 사항).
  6. 박테리아 현탁액을 실온에서 부드러운 교반으로 3시간 동안 배양합니다.
  7. 다른 식물에서 완전히 팽창 한 잎의 abaxial 표면을 1mL의 바늘없는 일회용 주사기로 침투시키고 침투 부위 (주변의 비 침투 조직보다 어두운 색)를 방수 펜으로 표시합니다.
  8. 이 프로토콜의 Confocal microscopy 섹션으로 진행합니다(5단계).
    참고: 관심 식물 종의 변형에 적합한 Agrobacterium tumefaciens 의 다른 균주도 사용할 수 있습니다.

4. 아닐린 블루 스테인

  1. 200μL의 1% 아닐린 블루(50mM 인산칼륨 완충액, pH 8.0)의 분취액을 현미경 슬라이드20에 추가합니다.
  2. 정맥에서 약 0.5cm × 0.5cm의 침투 부위를 칼날로 절제하고 잎 조직 샘플을 현미경 슬라이드의 아닐린 블루 용액(abaxial side-up)으로 옮기고 잎 조직 샘플이 아닐린 블루 용액에 잠겼는지 확인한 다음 커버 유리(22mm x 50mm)로 덮습니다.
  3. 샘플과 함께 현미경 슬라이드를 진공 펌프에 부착된 데시케이터에 넣고 2분(<0.8Pa) 동안 배출한 다음 압력을 천천히 해제하고 어두운 곳에서 실온에서 30분 동안 배양합니다.
  4. 호환 가능한 소프트웨어를 사용하여 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경으로 아닐린 블루의 형광 신호를 시각화할 수 있습니다.
    참고: 여기에서는 Huang et al.20 의 아닐린 블루 염색 방법이 사용되었습니다. 이 기법을 수정하여 2분 진공 단계 없이 동일한 실험을 수행하여 유사한 결과를 얻었으며 진공 건조가 아닐린 염색에 필수적이지 않음을 시사했습니다. 또한, 아닐린 블루 염색의 농도와 염색 시간은 잎 조직의 출처 등에 따라 달라질 수 있습니다.

5. 공초점 현미경 검사

  1. 침투 후 서로 다른 시점에서 두 식물의 잎 두 개를 수확하십시오. 침윤 부위를 약 0.5cm로 자르× 칼날로 정맥에서 0.5cm 잘라냅니다.
    1. 현미경 슬라이드의 중앙 부분에 있는 멸균수 한 방울(abaxial side-up)에 조직 샘플을 넣고 기포가 생기지 않도록 주의하면서 커버 유리(22mm x 50mm)로 덮습니다.
  2. CFP, GFP 및 RFP 신호 검출을 위한 여기 파장이 각각 405nm, 488nm 및 561nm이고 검출을 위한 방출 필터가 CFP의 경우 410-602nm, EGFP 및 RFP의 경우 400-602nm이고 핀홀은 1AU이고 마스터 게인은 769V로 설정되어 있는지 확인합니다.
  3. 침입 후 1일, 2일, 3일, 5일, 7일, 10일에 호환 가능한 소프트웨어가 있는 레이저 스캐닝 컨포칼 현미경을 사용하여 침투 영역에서 자가형광 태그의 형광 신호를 시각화합니다.
    1. 10x 대물렌즈와 GFP 필터를 사용하여 형광 신호가 있는 세포를 찾은 다음 40x 대물렌즈로 전환하여 세포 내 국소화 및 이미지 기록을 시각화합니다.
  4. 두 개 이상의 독립적인 생물학적 복제를 사용하여 각 조건에 대해 20개의 이미지를 수집합니다.
  5. 세포 주변부에서 신호의 진단적 반점 모양을 기반으로 테스트된 단백질의 PD 국소화를 점수화합니다(21,22).
    참고: 알려지지 않은 단백질의 세포 내 국소화를 검출할 때는 최소 3개의 식물을 사용하는 것이 좋습니다.

6. 데이터 분석

  1. Fiji 소프트웨어를 사용하여 채널을 분할하고 시각화를 위해 이미지에 스케일 바를 추가합니다.
  2. 각 이미지의 평균 그레이스케일 값을 측정하기 전에 Fiji 소프트웨어를 사용하여 채널을 분할하여 서로 다른 시점에서 GFP(MP, PDCB1 및 PDLP5의 경우) 또는 CFP(아닐린 블루 염색의 경우) 형광 강도를 평가합니다.
  3. GFP(MP, PDCB1 및 PDLP5의 경우) 또는 CFP(아닐린 블루 염색의 경우) 이미지를 정규화하기 전에 Fiji 소프트웨어를 사용하여 채널을 분할합니다. 이미지의 면적을 측정하고 PD puncta를 수동으로 계산했습니다. 100μm2 당 PD puncta의 수를 계산하였다.
  4. Tukey의 다중 비교 테스트23 과 함께 양방향 분산 분석을 사용하여 통계 및 그래프 소프트웨어로 서로 다른 샘플과 다른 시점 간의 P-값을 결정합니다.
    참고: 단일 채널 형광 이미지의 경우, 각 픽셀의 그레이스케일 값은 해당 점24의 형광 강도를 나타냅니다. 여기서, 평균 그레이스케일 값은 서로 다른 시점에서 각 샘플의 형광 강도를 평가하는 데 사용되었습니다.

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결과

식물 생리학에서 PD 기능 및 병원체와의 상호 작용에 대한 연구를 용이하게 하기 위해 PD 국소화를 위해 간단하고 신뢰할 수 있는 세 가지 참조 단백질이 개발되었습니다. 2개의 세포 PD 단백질과 식물 토바모바이러스 TVCV에 의해 암호화된 병원체 유래 MP 단백질을 선택하였다. 이러한 단백질의 세포 내 국소화는 각 단백질의 C-말단에 융합된 자가형광 리포터 EGFP를 사용하여...

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토론

정상적인 식물 발달 및 형태 형성 중 및 식물-병원체 상호 작용 중 식물 세포 간 통신 및 세포 간 수송에 대한 모든 세포 생물학적 연구는 내인성 및 병원체로 암호화된 단백질과 식물 세포 간 연결, 즉 플라스모데스마타(PD)의 분류를 검출하고 모니터링해야 합니다. 이러한 실험은 내인성 또는 병원체 유래 여부에 관계없이 PD에 충실하고 일관되게 국한되어 이러한 구조를 ...

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공개

저자는 상충되는 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 말

벤처캐피털 연구소의 연구는 NIH(R35GM144059), NSF(MCB 1913165 및 IOS 1758046) 및 BARD(IS-5276-20)의 보조금으로 지원되었습니다. 연구비 제공자는 연구 설계, 데이터 수집, 해석 또는 출판 결정에 아무런 역할도 하지 않았다.

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자료

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

참고문헌

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