Nicotiana benthamianaにおけるPlasmodesmataへのタンパク質ソーティングの共焦点顕微鏡分析

要約

このプロトコルは、ウイルス-プラスモデスマタ相互作用またはプラスモデマーム輸送中にプラスモデスマタを標的とするタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のための最適なプラスモデスママーカーの選択を説明しています。

要約

Plasmodesmataは、隣接する植物細胞の細胞質をつなぎ、栄養素、高分子、侵入ウイルスの細胞間輸送を可能にする膜状のナノポアです。Plasmodesmataは、細胞間コミュニケーションの調節において基本的な役割を果たし、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用に貢献します。植物やウイルスのタンパク質の体質形成部局在を発見することは、タンパク質に関する有用な機能情報を提供する可能性があり、植物とウイルスの相互作用のメカニズムを理解するために重要です。これらの研究を容易にするために、ウイルス-プラスモデスマタの相互作用またはプラスモデスマの輸送を研究するための最適なプラスモードマーカーを選択するために、さまざまなプラスモードターゲティングタンパク質の共焦点顕微鏡法に基づく分析のプロトコルについて説明します。具体的には、これらの事象の解析は、 カブ静脈透明化ウイルス (TVCV)、 シロイヌナズナPlasmodesmata-Localized Protein 5(PDLP5)、およびPlasmodesmata Callose-Binding Protein 1(PDCB1)の細胞間移動タンパク質(MP)を用いて示されています。タンパク質の体質形成局在データは、サンプリングされた組織のアニリンブルー染色を使用して、体質形成体の全体的な可視化と並行して分析されます。これらのアプローチは、プランタ内の任意の細胞タンパク質または病原体タンパク質の体質形成局在を分析するために容易に適応できます。

概要

Plasmodesmata(PD)は、細胞間コミュニケーションの制御を通じて、植物の発生、環境応答、およびウイルス性病原体との相互作用を制御する上で基本的な役割を果たします^1,2。PDは、細胞質分裂中に最初に形成され、2つの娘細胞の間の新しい細胞に数百のPDが挿入され、細胞間コミュニケーションのためのチャネルが供給されます^3,4。PDは膜に富む構造であり、原形質膜^3,4によって裏打ちされた細孔の中央部分に小胞体(ER)由来の膜であるtrans-PDデスモチューブルが含まれています。比較プロテオミクスアプローチにより、β-1,3-グルカナーゼ(BG)、カロース合成酵素(CALS)、原形質形成タンパク質(PDLP)、カロース結合タンパク質(PDCB)、複数のC2ドメイン膜貫通領域タンパク質(MCTP)³、ロイシンリッチリピート受容体様キナーゼ(RLK)⁵など、多数のPD機能タンパク質が同定されました。最近、Kirkらはplas....

プロトコル

本試験で使用した試薬および装置の詳細は、 材料表に記載されています。

1.植物の成長

1. Nicotiana benthamianaの種子を、光16時間、暗闇8時間、23°Cの制御された環境チャンバーの湿った土壌で育てます。
2. 約2週間後、根の周りに泥炭ペレットを巻き付けた苗を大きな鉢に慎重に移し、農業浸透実験のために同じ条件下で4〜5週間成長を続けます。
   注:花序^段階18でGFPの蓄積が減少するため、開花し始めたときに植物を使用しないでください。

2. ベクトル構造

1. PCRを使用して、Q5 High-Fidelity DNAポリメラーゼで目的のコード配列を増幅し、市販のBP Clonaseキットを使用してBP反応¹⁹ によってエントリーベクターpDONR207にクローニングします。
2. 得られたエントリープラスミド中の標的遺伝子を、市販のLR Clonaseキットを用いてLR反応¹⁹ により目的ベクターpP....

ディスカッション

正常な植物の発生と形態形成、および植物と病原体の相互作用における植物の細胞間コミュニケーションと細胞間輸送に関する細胞生物学的研究では、内因性および病原体にコードされたタンパク質と植物の細胞間接続であるプラスモデスマタ(PD)への選別の検出とモニタリングが必要です。これらの実験は、内因性か病原体由来かにかかわらず、PDに忠実かつ一貫し.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S