Análise por microscopia confocal da classificação de proteínas para plasmodesmos em Nicotiana benthamiana

Resumo

Este protocolo descreve a seleção de marcadores plasmodésmicos ideais para análises baseadas em microscopia confocal de direcionamento de proteínas para plasmodesmos durante interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal.

Resumo

Plasmodesmos são nanoporos membranosos que conectam o citoplasma de células vegetais adjacentes e permitem o tráfego célula a célula de nutrientes, macromoléculas, bem como vírus invasores. Os plasmodesmos desempenham papéis fundamentais na regulação da comunicação intercelular, contribuindo para o desenvolvimento das plantas, respostas ambientais e interações com patógenos virais. A descoberta da localização plasmodésmica de proteínas vegetais ou virais pode fornecer informações funcionais úteis sobre a proteína e é importante para a compreensão dos mecanismos das interações planta-vírus. Para facilitar esses estudos, descrevemos um protocolo para análise baseada em microscopia confocal de diferentes proteínas de direcionamento plasmodesmal para selecionar o melhor marcador plasmodesmal para estudar as interações vírus-plasmodesmos ou transporte plasmodesmal. Especificamente, as análises desses eventos são ilustradas usando a proteína de movimento célula a célula (MP) do vírus de limpeza da veia do nabo (TVCV), a proteína localizada em plasmodesmos de Arabidopsis 5 (PDLP5) e a proteína de ligação à calose de plasmodesmos 1 (PDCB1). Os dados de localização plasmodésica da proteína são analisados em paralelo com a visualização global dos plasmodesmos usando coloração com azul de anilina dos tecidos amostrados. Essas abordagens podem ser facilmente adaptadas para analisar a localização plasmodésmica de qualquer proteína celular ou patogênica na planta.

Introdução

Os plasmodesmos (PD) desempenham um papel fundamental no controle do desenvolvimento vegetal, respostas ambientais e interações com patógenos virais por meio da regulação da comunicação intercelular ^1,2. A DP se forma inicialmente durante a citocinese, com centenas de PD inseridas na nova célula entre as duas células-filhas, fornecendo assim os canais para a comunicação célula a célula ^3,4. A DP é uma estrutura rica em membrana, contendo a membrana derivada do retículo endoplasmático (RE), um desmotúbulo trans-PD, na parte central dos poros que são revestidos pela membrana plasmática ^3,4. Abordagens proteômicas comparativas identificaram inúmeras proteínas funcionais da DP, incluindo β-1,3-glucanases (BGs), calose sintases (CALSs), proteínas localizadas em plasmodesmos (PDLPs), proteínas de ligação à calose (PDCBs), proteínas da região transmembrana de múltiplos domínios C2 (MCTPs)³ e quinases semelhantes a receptores repetidos ricos em leucina (RLK)⁵. Recentemente, Kirk et al. desenvolveram uma ferramenta denominada plasmodesmos in silico proteome 1 (PIP1), que possibilitou prever novas proteínas PD em 22 espécies de plantas⁶. A DP varia em permeabilidade e estrutura durante o desenvolvimento da planta e a resposta a vários estresses. A deposição e hidrólise da calose (β-1,3-glucana) na região do pescoço ao redor da DP é um dos mecanismos amplamente conhecidos da regulação da DP⁷.

Muitos micróbios patogênicos, incluindo fungos, bactérias e vírus, podem manipular a dilatação ou estrutura da DP durante sua infecção ^2,8,9. Magnaporthe oryzae, o agente causador da brusone do arroz, implanta hifas invasivas intracelulares para se mover de célula para célula através da DP⁸. Um patógeno bacteriano Pseudomonas syringae pv. o tomate requer uma proteína efetora HopO1-1 para movimento intercelular e disseminação na planta hospedeira por meio da interação e desestabilização do PDLP7, aumentando assim o fluxo molecular nas células vizinhas em Arabidopsis⁹. No entanto, os vírus de plantas são mais versáteis na regulação da DP durante sua transmissão intercelular, com a proteína de movimento viral (MP) promovendo o movimento célula a célula². Devido à sua importante função na regulação do desenvolvimento e crescimento das plantas, bem como sua interação com micróbios patogênicos de plantas, a DP tem ganhado cada vez mais atenção nos últimos anos. Em Arabidopsis thaliana, existem dois tipos principais de proteínas funcionais de PD, PDLPs (1-8) e PDCBs (1-5), e muitas delas, por exemplo, PDLP5 ^1,10,11, PDLP1¹², PDLP6¹³, PDLP7¹⁴ e PDCB1¹⁵, foram encontradas para desempenhar um papel na manipulação da permeabilidade da PD através da regulação da deposição de calose. No entanto, alguns PDLPs apresentaram redundância funcional, por exemplo, mutantes knockout de pdlp1 e pdlp1,2 não afetaram o tráfego molecular, embora mutantes knockout duplos de pdlp1,3 e pdlp2,3 tenham mostrado aumento da permeabilidade plasmodésica¹⁶. Curiosamente, a regulação negativa / nocaute ou superexpressão de PDLP5 isoladamente resulta em um aumento ou diminuição na permeabilidade plasmodésmica, respectivamente ^1,17. Recentemente, Li et al. descobriram que PDLP5 e PDLP6 funcionam em diferentes interfaces celulares¹³. Esses resultados indicam que o PDLP5 pode ter funções não redundantes com outros PDLPs.

Devido à função crítica da DP na comunicação intercelular, desenvolvemos um protocolo para implantar as proteínas PD de plantas PDLP5 e PDCB1 e a proteína de movimento célula a célula viral (MP) do vírus de limpeza de veias de nabo (TVCV) como marcadores de DP simples, convenientes e confiáveis para experimentação de biologia celular. Para verificação posterior, a visualização da DP usando coloração com azul de anilina dos tecidos amostrados ocorreu em paralelo. Os protocolos descritos para localização de PD de PDLP5, PDCB1 e TVCV MP podem ser facilmente adaptados para analisar a localização potencial de PD de qualquer proteína celular ou derivada de patógenos em plantas vivas.

Protocolo

Os detalhes dos reagentes e dos equipamentos utilizados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Crescimento das plantas

1. Cultive sementes de Nicotiana benthamiana em solo úmido em uma câmara de ambiente controlado a 23 ° C sob 16 h de luz e 8 h de escuridão.
2. Após cerca de 2 semanas, transfira cuidadosamente as mudas com os pellets de turfa ao redor de suas raízes para vasos maiores e continue o crescimento nas mesmas condições por 4-5 semanas para os experimentos de agroinfiltração.
   NOTA: Não use as plantas quando elas começarem a florescer, pois o acúmulo de GFP diminuirá no estágio¹⁸ da inflorescência.

2. Construção vetorial

1. Use PCR para amplificar as sequências de codificação de interesse com a DNA polimerase de alta fidelidade Q5 e cloná-las no vetor de entrada pDONR207 pela reação BP¹⁹ usando um kit de clonase BP disponível comercialmente.
2. Transfira os genes-alvo nos plasmídeos de entrada resultantes para o vetor de destino pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 pela reação LR¹⁹ usando um kit de clonase LR disponível comercialmente para produzir plasmídeos com a etiqueta EGFP fundida ao terminal C das proteínas-alvo.
3. Verificar todas as construções por PCR e sequenciamento¹⁹.

3. Agroinfiltração

1. Estrias Agrobacterium tumefaciens EHA105 contendo diferentes vetores em placas de ágar LB e incubadas por 2 dias sob 28 °C.
2. Transfira uma única colônia para 2 mL de caldo LB e incube durante a noite a 28 ° C com agitação (250 rpm).
3. Remover 1 mL da cultura durante a noite, seguido pela adição de 4 mL de caldo fresco LB e recultivar por 1 h nas mesmas condições.
4. Ajustar a suspensão bacteriana para OD₆₀₀ = 0,1 (OD₆₀₀ = 0,2 para a co-expressão de duas proteínas) com tampão de infiltração (MgCl₂, 10 mM; MES, 10 mM, pH 5,6).
5. Misture diferentes suspensões bacterianas na proporção de 1:1 (v/v) para obter uma concentração final de OD₆₀₀ = 0,1. (opcional).
6. Incubar a suspensão bacteriana à temperatura ambiente durante 3 h com agitação suave.
7. Infiltre a superfície abaxial das folhas totalmente expandidas de diferentes plantas com uma seringa descartável sem agulha de 1 mL e marque a área infiltrada (uma cor mais escura do que o tecido circundante não infiltrado) com uma caneta à prova d'água.
8. Prossiga para a seção Microscopia confocal deste protocolo (etapa 5).
   NOTA: Outras cepas de Agrobacterium tumefaciens adequadas para a transformação de espécies vegetais de interesse também podem ser utilizadas.

4. Mancha azul de anilina

1. Adicione uma alíquota de 200 μL de azul de anilina a 1% (em tampão fosfato de potássio 50 mM, pH 8,0) a uma lâmina de microscópio²⁰.
2. Extirpar a área infiltrada de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm, longe da nervura, com uma lâmina, e transferir as amostras de tecido foliar para a solução de azul de anilina (lado abaxial para cima) na lâmina do microscópio, e certifique-se de que as amostras de tecido foliar estejam submersas na solução de azul de anilina e, em seguida, cubra-a com uma lamínula (22 mm x 50 mm).
3. Coloque as lâminas do microscópio com as amostras em um dessecador conectado a uma bomba de vácuo e evacue por 2 min (<0,8 Pa), seguido de uma liberação lenta da pressão e incubação no escuro por 30 min em temperatura ambiente.
4. Visualize o sinal fluorescente do azul de anilina sob um microscópio confocal de varredura a laser com software compatível.
   NOTA: Aqui, foi utilizado o método de coloração com azul de anilina de Huang et ^al.20 . Em uma modificação desta técnica, o mesmo experimento foi realizado sem a etapa de vácuo de 2 min, produzindo resultados semelhantes e sugerindo que a secagem a vácuo não é essencial para a coloração com anilina. Além disso, a concentração da mancha azul de anilina e o tempo de coloração podem variar de acordo com a fonte do tecido foliar, etc.

5. Microscopia confocal

1. Colha duas folhas de duas plantas em momentos diferentes após a infiltração. Corte a zona de infiltração em fatias de aproximadamente 0,5 cm × 0,5 cm de distância da veia com uma lâmina.
   1. Coloque as amostras de tecido em uma gota de água estéril (lado abaxial para cima) na parte central de uma lâmina de microscópio e cubra-as com uma lamínula (22 mm x 50 mm), tomando cuidado para evitar bolhas.
2. Certifique-se de que os comprimentos de onda de excitação para a detecção de sinais CFP, GFP e RFP sejam 405 nm, 488 nm e 561 nm, respectivamente, e os filtros de emissão para detecção sejam 410-602 nm para CFP e 400-602 nm para EGFP e RFP, com o orifício 1 UA e o ganho mestre definido como 769 V.
3. Visualize o sinal fluorescente de etiquetas autofluorescentes na área infiltrada usando um microscópio confocal de varredura a laser com software compatível em 1 dia, 2 dias, 3 dias, 5 dias, 7 dias e 10 dias após a infiltração.
   1. Use uma lente objetiva de 10x e filtros GFP para localizar células com o sinal fluorescente e, em seguida, mude para uma lente objetiva de 40x para visualização da localização subcelular e gravação de imagens.
4. Colete 20 imagens para cada condição, usando pelo menos duas réplicas biológicas independentes.
5. Pontue a localização da PD da proteína testada com base na aparência puntiforme diagnóstica do sinal na periferia da célula^21,22.
   NOTA: Ao detectar a localização subcelular de uma proteína desconhecida, recomenda-se o uso de pelo menos três plantas.

6. Análise dos dados

1. Use o software Fiji para dividir canais e adicionar a barra de escala às imagens para visualização.
2. Use o software Fiji para dividir os canais antes de medir o valor médio da escala de cinza de cada imagem para avaliar a intensidade de fluorescência GFP (para MP, PDCB1 e PDLP5) ou CFP (para coloração com azul de anilina) em diferentes pontos de tempo.
3. Use o software Fiji para dividir os canais antes da normalização das imagens de GFP (para MP, PDCB1 e PDLP5) ou CFP (para coloração com azul de anilina). A área da imagem foi medida e os pontos de PD foram contados manualmente. O número de pontos de DP por 100 μm² foi calculado.
4. Use ANOVA de duas vias com o teste de comparações múltiplas de Tukey²³ para determinar os valores de P entre as diferentes amostras e diferentes pontos de tempo com software estatístico e gráfico.
   NOTA: Para uma imagem de fluorescência de canal único, o valor da escala de cinza de cada pixel representa a intensidade de fluorescência desse ponto²⁴. Aqui, o valor médio da escala de cinza foi usado para avaliar a intensidade de fluorescência de cada amostra em diferentes momentos.

Resultados

Para facilitar os estudos da função da DP na fisiologia vegetal e nas interações com patógenos, três proteínas de referência simples e confiáveis foram desenvolvidas para a localização da DP. Duas proteínas PD celulares e uma proteína MP derivada do patógeno codificada pelo tobamovírus vegetal TVCV foram selecionadas. A localização subcelular dessas proteínas foi visualizada usando um repórter autofluorescente EGFP fundido ao terminal C de cada proteína. Em uma aborda...

Discussão

Quaisquer estudos biológicos celulares de comunicação intercelular de plantas e transporte célula a célula durante o desenvolvimento e morfogênese normais da planta, bem como durante as interações planta-patógeno, requerem a detecção e monitoramento da classificação de proteínas - endógenas e codificadas por patógenos - para conexões intercelulares de plantas, os plasmodesmos (PD). Esses experimentos seriam substancialmente facilitados pelo uso de proteínas de referênc...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S