Analyse par microscopie confocale du tri des protéines vers les plasmodesmes chez Nicotiana benthamiana

Résumé

Ce protocole décrit la sélection de marqueurs plasmodesmaux optimaux pour les analyses basées sur la microscopie confocale du ciblage des protéines sur les plasmodesmes lors d’interactions virus-plasmodesmes ou de transport plasmodesmal.

Résumé

Les plasmodesmes sont des nanopores membraneux qui relient le cytoplasme des cellules végétales adjacentes et permettent le trafic de cellules à cellules de nutriments, de macromolécules, ainsi que de virus envahisseurs. Les plasmodesmes jouent un rôle fondamental dans la régulation de la communication intercellulaire, contribuant au développement des plantes, aux réponses environnementales et aux interactions avec les agents pathogènes viraux. La découverte de la localisation plasmodesmale des protéines végétales ou virales pourrait fournir des informations fonctionnelles utiles sur la protéine et est importante pour comprendre les mécanismes des interactions plantes-virus. Pour faciliter ces études, nous décrivons un protocole d’analyse par microscopie confocale de différentes protéines de ciblage plasmodesmal afin de sélectionner le meilleur marqueur plasmodesmal pour l’étude des interactions virus-plasmodesmes ou du transport plasmodesmal. Plus précisément, les analyses de ces événements sont illustrées à l’aide de la protéine de mouvement de cellule à cellule (MP) du virus de clarification des veines de navet (TVCV), de la protéine 5 localisée d’Arabidopsis Plasmodesmata (PDLP5) et de la protéine de liaison 1 de Plasmodesmata Callose (PDCB1). Les données de localisation plasmodesmale des protéines sont analysées en parallèle avec la visualisation globale des plasmodesmes à l’aide de la coloration au bleu d’aniline des tissus échantillonnés. Ces approches peuvent être facilement adaptées pour analyser la localisation plasmodesmale de toute protéine cellulaire ou pathogène dans le planta.

Introduction

Les plasmodesmes jouent un rôle fondamental dans le contrôle du développement des plantes, des réponses environnementales et des interactions avec les agents pathogènes viraux grâce à la régulation de la communication intercellulaire ^1,2. La MP se forme initialement au cours de la cytokinèse, avec des centaines de DP insérées dans la nouvelle cellule entre les deux cellules filles, fournissant ainsi les canaux de communication de cellule à cellule ^3,4. La MP est une structure riche en membrane, contenant la membrane dé....

Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Croissance des plantes

1. Cultivez les graines de Nicotiana benthamiana dans un sol humide dans une chambre à environnement contrôlé à 23 °C sous 16 h de lumière et 8 h d’obscurité.
2. Après environ 2 semaines, transférez soigneusement les plants avec les granulés de tourbe autour de leurs racines dans des pots plus grands et continuez la croissance dans les mêmes conditions pendant 4-5 semaines pour les expériences d’agro-infiltration.<....

Discussion

Toute étude de biologie cellulaire de la communication intercellulaire végétale et du transport de cellule à cellule au cours du développement et de la morphogenèse normaux des plantes, ainsi que lors des interactions plantes-pathogènes, nécessite la détection et la surveillance du tri des protéines, à la fois endogènes et codées par des agents pathogènes, aux connexions intercellulaires des plantes, les plasmodesmes (). Ces expériences seraient considérablement facilité.......

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
ABT AC 1 phase motor	BRANDTECH	ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control	CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mix	Invitrogen	#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.	GraphPad Software Inc.
Image J	National Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscope	Zeiss	LSM 900
Nicotiana benthamiana	Plant species
pDONR207	Invitrogen	#12213013
Q5 High-Fidelity DNA Polymerase	NEB	#M0491S