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  • Résumé
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  • Introduction
  • Protocole
  • Résultats
  • Discussion
  • Déclarations de divulgation
  • Remerciements
  • matériels
  • Références
  • Réimpressions et Autorisations

Résumé

Ce protocole décrit la sélection de marqueurs plasmodesmaux optimaux pour les analyses basées sur la microscopie confocale du ciblage des protéines sur les plasmodesmes lors d’interactions virus-plasmodesmes ou de transport plasmodesmal.

Résumé

Les plasmodesmes sont des nanopores membraneux qui relient le cytoplasme des cellules végétales adjacentes et permettent le trafic de cellules à cellules de nutriments, de macromolécules, ainsi que de virus envahisseurs. Les plasmodesmes jouent un rôle fondamental dans la régulation de la communication intercellulaire, contribuant au développement des plantes, aux réponses environnementales et aux interactions avec les agents pathogènes viraux. La découverte de la localisation plasmodesmale des protéines végétales ou virales pourrait fournir des informations fonctionnelles utiles sur la protéine et est importante pour comprendre les mécanismes des interactions plantes-virus. Pour faciliter ces études, nous décrivons un protocole d’analyse par microscopie confocale de différentes protéines de ciblage plasmodesmal afin de sélectionner le meilleur marqueur plasmodesmal pour l’étude des interactions virus-plasmodesmes ou du transport plasmodesmal. Plus précisément, les analyses de ces événements sont illustrées à l’aide de la protéine de mouvement de cellule à cellule (MP) du virus de clarification des veines de navet (TVCV), de la protéine 5 localisée d’Arabidopsis Plasmodesmata (PDLP5) et de la protéine de liaison 1 de Plasmodesmata Callose (PDCB1). Les données de localisation plasmodesmale des protéines sont analysées en parallèle avec la visualisation globale des plasmodesmes à l’aide de la coloration au bleu d’aniline des tissus échantillonnés. Ces approches peuvent être facilement adaptées pour analyser la localisation plasmodesmale de toute protéine cellulaire ou pathogène dans le planta.

Introduction

Les plasmodesmes jouent un rôle fondamental dans le contrôle du développement des plantes, des réponses environnementales et des interactions avec les agents pathogènes viraux grâce à la régulation de la communication intercellulaire 1,2. La MP se forme initialement au cours de la cytokinèse, avec des centaines de DP insérées dans la nouvelle cellule entre les deux cellules filles, fournissant ainsi les canaux de communication de cellule à cellule 3,4. La MP est une structure riche en membrane, contenant la membrane dérivée du réticulum endoplasmique (RE), un desmotubule trans-, dans la partie centrale des pores qui sont tapissés par la membrane plasmique 3,4. Des approches protéomiques comparatives ont permis d’identifier de nombreuses protéines fonctionnelles de la MP, notamment les β-1,3-glucanases (BG), les callose synthases (CALS), les protéines situées dans les plasmodesmes (PDLP), les protéines de liaison aux callosités (PDCB), les protéines de la région transmembranaire à plusieurs domaines C2 (MCTP)3 et les kinases de type récepteur répété riches en leucine (RLK)5. Récemment, Kirk et al. ont développé un outil appelé plasmodesmata in silico proteome 1 (PIP1), qui a permis de prédire de nouvelles protéines chez 22 espèces végétales6. La perméabilité et la structure de la MP varient au cours du développement de la plante et de la réponse à divers stress. Le dépôt et l’hydrolyse de callose (β-1,3-glucane) dans la région du cou entourant la DP sont l’un des mécanismes largement connus de la régulation de la DP7.

De nombreux microbes pathogènes, notamment les champignons, les bactéries et les virus, peuvent manipuler la dilatation ou la structure de la MP au cours de leurinfection2,8,9. Magnaporthe oryzae, l’agent causal de la pyriculariose du riz, déploie des hyphes envahissants intracellulaires pour se déplacer de cellule en cellule jusqu’à8. Un pathogène bactérien Pseudomonas syringae pv. la tomate a besoin d’une protéine effectrice HopO1-1 pour se déplacer intercellulaire et se propager dans la plante hôte en interagissant avec PDLP7 et en la déstabilisant, augmentant ainsi le flux moléculaire dans les cellules voisines chez Arabidopsis9. Cependant, les virus végétaux sont plus polyvalents dans la régulation de la MP au cours de leur transmission intercellulaire, la protéine de mouvement viral (MP) favorisant le mouvement de cellule à cellule2. En raison de leur rôle important dans la régulation du développement et de la croissance des plantes, ainsi que de leur interaction avec les microbes pathogènes des plantes, les MP ont fait l’objet d’une attention croissante ces dernières années. Chez Arabidopsis thaliana, il existe deux principaux types de protéines fonctionnelles de la, les PDLP (1-8) et les PDCB (1-5), et beaucoup d’entre elles, par exemple, PDLP5 1,10,11, PDLP112, PDLP613, PDLP714 et PDCB115, jouent un rôle dans la manipulation de la perméabilité de la par la régulation du dépôt de callose. Cependant, certains PDLP se sont avérés avoir une redondance fonctionnelle, par exemple, les mutants knock-out de pdlp1 et pdlp1,2 n’ont pas affecté le trafic moléculaire, bien que les mutants doubles knock-out de pdlp1,3 et pdlp2,3 aient montré une perméabilité plasmodesmale accrue16. Il est intéressant de noter que la régulation négative/l’inactivation ou la surexpression de PDLP5 seul entraîne une augmentation ou une diminution de la perméabilité plasmodesmale, respectivement 1,17. Récemment, Li et al. ont découvert que PDLP5 et PDLP6 fonctionnent à différentes interfaces cellulaires13. Ces résultats indiquent que PDLP5 pourrait avoir des fonctions non redondantes avec d’autres PDLP.

En raison de la fonction critique de la MP dans la communication intercellulaire, nous avons développé un protocole pour déployer les protéines PDP PDLP5 et PDCB1 de la plante et la protéine virale de mouvement de cellule à cellule (MP) du virus du nettoyage des veines du navet (TVCV) en tant que marqueurs de DP simples, pratiques et fiables pour l’expérimentation en biologie cellulaire. Pour une vérification plus poussée, la visualisation de la DP à l’aide de la coloration au bleu d’aniline des tissus échantillonnés s’est déroulée en parallèle. Les protocoles décrits pour la localisation de PDLP5, PDCB1 et TVCV MP peuvent être facilement adaptés pour analyser la localisation potentielle de toute protéine cellulaire ou dérivée d’un agent pathogène dans les plantes vivantes.

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Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans cette étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Croissance des plantes

  1. Cultivez les graines de Nicotiana benthamiana dans un sol humide dans une chambre à environnement contrôlé à 23 °C sous 16 h de lumière et 8 h d’obscurité.
  2. Après environ 2 semaines, transférez soigneusement les plants avec les granulés de tourbe autour de leurs racines dans des pots plus grands et continuez la croissance dans les mêmes conditions pendant 4-5 semaines pour les expériences d’agro-infiltration.
    REMARQUE : N’utilisez pas les plantes lorsqu’elles commencent à fleurir, car l’accumulation de GFP diminuera au stade d’inflorescence18.

2. Construction vectorielle

  1. Utilisez la PCR pour amplifier les séquences codantes d’intérêt avec l’ADN polymérase haute fidélité Q5 et clonez-les dans le vecteur d’entrée pDONR207 par la réaction BP19 à l’aide d’un kit BP Clonase disponible dans le commerce.
  2. Transférer les gènes cibles dans les plasmides d’entrée résultants dans le vecteur de destination pPZP-RCS2A-nptII-DEST-EGFP-N1 par la réaction LR19 à l’aide d’un kit de clonase LR disponible dans le commerce pour produire des plasmides avec l’étiquette EGFP fusionnée à l’extrémité C-terminale des protéines cibles.
  3. Vérifier toutes les constructions par PCR et séquençage19.

3. L’agro-infiltration

  1. Cellules striées d’Agrobacterium tumefaciens EHA105 contenant différents vecteurs sur plaques de gélose LB et incubées pendant 2 jours à 28 °C.
  2. Transvaser une seule colonie dans 2 mL de bouillon LB et incuber toute la nuit à 28 °C en agitant (250 tr/min).
  3. Retirer 1 mL de la culture pendant la nuit, puis ajouter 4 mL de bouillon LB frais, et recultiver pendant 1 h dans les mêmes conditions.
  4. Ajuster la suspension bactérienne àOD 600 = 0,1 (OD600 = 0,2 pour la co-expression de deux protéines) avec tampon d’infiltration (MgCl2, 10 mM ; MES, 10 mM, pH 5,6).
  5. Mélanger différentes suspensions bactériennes dans un rapport de 1:1 (v/v) pour obtenir une concentration finale deDO 600 = 0,1. (facultatif).
  6. Incuber la suspension bactérienne à température ambiante pendant 3 h avec une agitation douce.
  7. Infiltrez la surface abaxiale des feuilles complètement déployées de différentes plantes à l’aide d’une seringue jetable sans aiguille de 1 ml et marquez la zone infiltrée (d’une couleur plus foncée que le tissu environnant non infiltré) à l’aide d’un stylo étanche.
  8. Passez à la section Microscopie confocale de ce protocole (étape 5).
    REMARQUE : D’autres souches d’Agrobacterium tumefaciens adaptées à la transformation des espèces végétales d’intérêt peuvent également être utilisées.

4. Teinture bleu aniline

  1. Ajouter une aliquote de 200 μL de bleu d’aniline à 1 % (dans un tampon de phosphate de potassium de 50 mM, pH 8,0) à une lame de microscope20.
  2. Exciser la zone infiltrée d’environ 0,5 cm × 0,5 cm, loin de la veine, à l’aide d’une lame, et transférer les échantillons de tissu foliaire dans la solution de bleu d’aniline (côté abaxial vers le haut) sur la lame de microscope, et s’assurer que les échantillons de tissu foliaire sont immergés dans la solution de bleu d’aniline, puis recouvrir le tout d’un verre de protection (22 mm x 50 mm).
  3. Placez les lames de microscope avec les échantillons dans un dessiccateur fixé à une pompe à vide et évacuez pendant 2 min (<0,8 Pa), puis relâchez lentement la pression et laissez incuber dans l’obscurité pendant 30 min à température ambiante.
  4. Visualisez le signal fluorescent du bleu d’aniline sous un microscope confocal à balayage laser avec un logiciel compatible.
    REMARQUE : Ici, la méthode de coloration au bleu d’aniline de Huang et al.20 a été utilisée. Dans une modification de cette technique, la même expérience a été réalisée sans l’étape de vide de 2 minutes, produisant des résultats similaires et suggérant que le séchage sous vide n’est pas essentiel pour la coloration à l’aniline. De plus, la concentration de la coloration au bleu d’aniline et le temps de coloration peuvent varier en fonction de la source du tissu foliaire, etc.

5. Microscopie confocale

  1. Récoltez deux feuilles de deux plantes à des moments différents après l’infiltration. Coupez la zone d’infiltration en tranches d’environ 0,5 cm × 0,5 cm de la veine à l’aide d’une lame.
    1. Placez les échantillons de tissus dans une goutte d’eau stérile (côté abaxial vers le haut) dans la partie centrale d’une lame de microscope, et couvrez-les d’un verre de protection (22 mm x 50 mm), en prenant soin d’éviter les bulles.
  2. Assurez-vous que les longueurs d’onde d’excitation pour la détection des signaux CFP, GFP et RFP sont respectivement de 405 nm, 488 nm et 561 nm, et que les filtres d’émission pour la détection sont de 410 à 602 nm pour le CFP et de 400 à 602 nm pour l’EGFP et le RFP, avec le sténopé 1 AU et le gain principal réglé sur 769 V.
  3. Visualisez le signal fluorescent des balises autofluorescentes dans la zone infiltrée à l’aide d’un microscope confocal à balayage laser avec un logiciel compatible à 1 jour, 2 jours, 3 jours, 5 jours, 7 jours et 10 jours après l’infiltration.
    1. Utilisez une lentille d’objectif 10x et des filtres GFP pour localiser les cellules avec le signal fluorescent, puis passez à une lentille d’objectif 40x pour la visualisation de la localisation subcellulaire et l’enregistrement d’images.
  4. Collectez 20 images pour chaque condition, en utilisant au moins deux réplicats biologiques indépendants.
  5. Score localisation de la protéine testée basée sur l’apparition diagnostique ponctuée du signal à la périphérie de la cellule21,22.
    REMARQUE : Lors de la détection de la localisation subcellulaire d’une protéine inconnue, il est recommandé d’utiliser au moins trois plantes.

6. Analyse des données

  1. Utilisez le logiciel Fiji pour diviser les canaux et ajouter la barre d’échelle aux images pour la visualisation.
  2. Utilisez le logiciel Fiji pour diviser les canaux avant de mesurer la valeur moyenne en niveaux de gris de chaque image afin d’évaluer l’intensité de fluorescence GFP (pour MP, PDCB1 et PDLP5) ou CFP (pour la coloration au bleu d’aniline) à différents points temporels.
  3. Utilisez le logiciel Fiji pour diviser les canaux avant la normalisation des images de GFP (pour MP, PDCB1 et PDLP5) ou CFP (pour la coloration au bleu d’aniline). La surface de l’image a été mesurée et les points ont été comptés manuellement. Le nombre de points de par 100 μm2 a été calculé.
  4. Utilisez l’ANOVA à deux facteurs avec le test de comparaisons multiples23 de Tukey pour déterminer les valeurs P entre les différents échantillons et les différents points temporels à l’aide d’un logiciel statistique et graphique.
    REMARQUE : Pour une image de fluorescence monocanal, la valeur en niveaux de gris de chaque pixel représente l’intensité de fluorescence de ce point24. Ici, la valeur moyenne en niveaux de gris a été utilisée pour évaluer l’intensité de fluorescence de chaque échantillon à différents points temporels.

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Résultats

Pour faciliter l’étude de la fonction de la DP dans la physiologie végétale et des interactions avec les agents pathogènes, trois protéines de référence simples et fiables ont été développées pour la localisation de la DP. Deux protéines cellulaires et une protéine MP dérivée d’un agent pathogène codées par le TVCV du tobamovirus végétal ont été sélectionnées. La localisation subcellulaire de ces protéines a été visualisée à l’aide d’un rapporteur auto...

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Discussion

Toute étude de biologie cellulaire de la communication intercellulaire végétale et du transport de cellule à cellule au cours du développement et de la morphogenèse normaux des plantes, ainsi que lors des interactions plantes-pathogènes, nécessite la détection et la surveillance du tri des protéines, à la fois endogènes et codées par des agents pathogènes, aux connexions intercellulaires des plantes, les plasmodesmes (). Ces expériences seraient considérablement facilité...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Remerciements

Les travaux dans le laboratoire VC ont été soutenus par des subventions des NIH (R35GM144059), de la NSF (MCB 1913165 et IOS 1758046) et de BARD (IS-5276-20) à VC. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte et l’interprétation des données, ni dans la décision de publication.

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matériels

NameCompanyCatalog NumberComments
ABT AC 1 phase motorBRANDTECH ABF63/4C-7RQ
Agrobacterium tumefaciens EHA105
Contamination control CCI
Gateway BP Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11789020
Gateway LR Clonase II Enzyme mixInvitrogen#11791020
GraphPad Prism 8.0.1.GraphPad Software Inc.
Image JNational Institutes of Health and the Laboratory for Optical and Computational Instrumentation
Laser scanning confocal microscopeZeissLSM 900
Nicotiana benthamianaPlant species
pDONR207Invitrogen#12213013
Q5 High-Fidelity DNA PolymeraseNEB#M0491S

Références

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  2. Benitez-Alfonso, Y., Faulkner, C., Ritzenthaler, C., Maule, A. J. Plasmodesmata gateways to local and systemic virus infection. Mol Plant-Microbe Interact. 23 (11), 1403-1412 (2010).
  3. Bayer, E. M., Benitez-Alfonso, Y. Plasmodesmata: Channels under pressure. Annu Rev Plant Biol. 75, 21(2024).
  4. Maule, A. J. Plasmodesmata: Structure, function and biogenesis. Curr Opin Plant Biol. 11, 680-686 (2008).
  5. Fernandez-Calvino, L., et al. Arabidopsis plasmodesmal proteome. PLoS One. 6 (4), e18880(2011).
  6. Kirk, P., Amsbury, S., German, L., Gaudioso-Pedraza, R., Benitez-Alfonso, Y. A comparative meta-proteomic pipeline for the identification of plasmodesmata proteins and regulatory conditions in diverse plant species. BMC Biol. 20, 128(2022).
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  16. Thomas, C. L., Bayer, E. M., Ritzenthaler, C., Fernandez-Calvino, L., Maule, A. J. Specific targeting of a plasmodesmal protein affecting cell-to-cell communication. PLoS Biol. 6 (1), e7(2008).
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  27. Kumar, G., Dasgupta, I. Variability, functions and interactions of plant virus movement proteins: what do we know so far. Microorganisms. 9 (4), 695(2021).
  28. Waigmann, E., Ueki, S., Trutnyeva, K., Citovsky, V. The ins and outs of nondestructive cell-to-cell and systemic movement of plant viruses. Crit Rev Plant Sci. 23 (3), 195-250 (2004).

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