منصة مصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية لنمذجة الصرع باستخدام تجمعات الدماغ المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات

Summary

يهدف هذا البروتوكول إلى صفيحة التجميعات المنصهرة الظهرية البطنية بثبات على مصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية لنمذجة الصرع في المختبر.

Abstract

عضيات الدماغ البشري هي هياكل ثلاثية الأبعاد (3D) مشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSCs) التي تلخص جوانب نمو دماغ الجنين. يولد اندماج الظهرية مع عضيات الدماغ البطنية المحددة إقليميا في المختبر تجمعات ، والتي تحتوي على دوائر دقيقة متكاملة وظيفيا مع الخلايا العصبية المثيرة والمثبطة. نظرا لتعقيدها الهيكلي وتنوع عدد الخلايا العصبية ، أصبحت التجميعات أداة مفيدة في المختبر لدراسة نشاط الشبكة الشاذ. تعمل تسجيلات المصفوفة متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA) كطريقة لالتقاط إمكانات المجال الكهربائي والمسامير وديناميكيات الشبكة الطولية من مجموعة من الخلايا العصبية دون المساس بسلامة غشاء الخلية. ومع ذلك ، فإن التصاق التجميعات على الأقطاب الكهربائية للتسجيلات طويلة المدى قد يكون أمرا صعبا نظرا لحجمها الكبير ومساحة سطح التلامس المحدودة مع الأقطاب الكهربائية. هنا ، نوضح طريقة للوحة التجميعات على ألواح MEA لتسجيل النشاط الفيزيولوجي الكهربي على مدى شهرين. على الرغم من أن البروتوكول الحالي يستخدم العضيات القشرية البشرية ، إلا أنه يمكن تكييفه على نطاق واسع مع العضيات المتمايزة لنمذجة مناطق الدماغ الأخرى. ينشئ هذا البروتوكول اختبارا قويا وطوليا للفيزيولوجيا الكهربية لدراسة تطوير شبكة عصبية ، وهذه المنصة لديها القدرة على استخدامها في فحص الأدوية للتطور العلاجي في الصرع.

Introduction

عضيات الدماغ المشتقة من الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات (hPSC) هي هياكل ثلاثية الأبعاد ذاتية التنظيم مكانيا تعكس بنية الأنسجة ومسارات النمو في الجسم الحي. وهي تتكون من أنواع متعددة من الخلايا ، بما في ذلك الأسلاف (الخلايا الظهارية العصبية ، الخلايا الدبقية الشعاعية ، الأسلاف العصبية ، الأسلاف الدبقية) ، الخلايا العصبية (الخلايا العصبية المثيرة الشبيهة بالقشرة والخلايا العصبية الداخلية المثبطة) ، والخلايا الدبقية (الخلايا النجمية والخلايا الدبقية قليلة التغصن) ^1،2. تمثل التجميعات الجيل التالي من عضيات الدماغ ، القادرة على دمج مناطق دماغية متعددة و / أو سلالات الخلايا في ثقافة ثلاثية الأبعاد. إنها توفر أداة مفيدة لنمذجة الروابط بين مناطق الدماغ المختلفة التي تشبه نظيراتها في الجسم الحي ، والتقاط التفاعلات بين الخلايا العصبية والخلايا النجمية لتقليد الشبكات العصبية الناضجة والمعقدة بشكل أفضل ، ودراسة تجميع الدوائر العصبية. لذلك ، أصبحت التجميعات أداة مستخدمة على نطاق واسع لتلخيص السمات المميزة للفيزيولوجيا المرضية للصرع ، حيث تكون التدابير الوظيفية ضرورية لاستجواب الشبكات العصبية الشاذة التي قد تكمن وراء سبب^{المرض 3،4،5،6}.

لنمذجة التفاعلات بين الخلايا العصبية الجلوتامية القشرية والخلايا العصبية الداخلية GABAergic ، طورت عدة مجموعات عضيات منفصلة تشبه الدماغ الظهري والبطني ثم دمجتها معا في مجموعة متعددة المناطق^7،8،9،10. هنا ، تم تطبيق بروتوكول ثقافة التجميع الموصوف سابقا مع أنواع فرعية عصبية محددة^{إقليميا 9}. ومع ذلك ، فإن الحاجز المهم هو عدم وجود فحوصات وظيفية قابلة للتكرار لمراقبة نشاط الشبكة العصبية أثناء النمو العصبي. تسفر العديد من الاختبارات الوظيفية للشبكات في العضيات عن نتائج ذات تباين كبير بين دفعات التمايز وخطوط الخلايا. تعمل التقنيات التي تنطوي على تقطيع أو تفكيك العضيات على تغيير شبكاتها المتأصلة عن طريق قطع الاتصال المشبكي⁸.

توفر المصفوفات متعددة الأقطاب الكهربائية (MEA) عرضا واسع النطاق لنشاط الشبكة بمرور الوقت بدقة زمنية عالية لتوصيف الخصائص الفيزيولوجية الكهربية للعضيات دون تعطيل ظروف الثقافة أو سلامة غشاء^{الخلية 11}. بالمقارنة مع الفيزيولوجيا الكهربية لمشبك التصحيح ، تتيح MEA الحصول على بيانات عالية الإنتاجية بناء على مجموعات كبيرة من الخلايا العصبية بدلا من الخلايا المفردة. تختلف منصات MEA في كثافة أقطاب كهربائية ، مما يلبي الاحتياجات المختلفة في أبحاث العضوية في^{الدماغ 12}. تسجل الأنظمة المستخدمة على نطاق واسع ، كما هو موضح في هذا البروتوكول ، من 8 إلى 64 قطبا كهربائيا لكل بئر^13،14،15. تتيح الاتفاقات البيئية المتعددة الأطراف عالية الكثافة التي تصل إلى 26,400 قطب كهربائي لكل بئر زيادة الدقة المكانية والزمانية ، والقياس الكمي لسرعة انتشار جهد الفعل ، والجمع بين التحفيز البصري^{الوراثي 14 ، 16 ، 17}. لذلك ، تعمل MEA كأداة قوية لنمذجة الصرع في المختبر ونموذج انتقالي لفحص الأدوية المضادة للنوبات.

يتمثل أحد التحديات الرئيسية في تثبيت التجميعات كبيرة الحجم على سطح معدني كاره للماء للتسجيلات طويلة المدى. يحدد هذا البروتوكول منهجية مفصلة لطلاء التجميعات السليمة على ألواح MEA للتسجيل الطولي طويل المدى جنبا إلى جنب مع المقايسات الدوائية. تشمل المزايا الفريدة للبروتوكول الارتباط المستقر للتجميعات بسطح القطب الكهربائي دون فقدان النشاط الكهربائي ، واستخدام الوسائط القاعدية الفيزيولوجية العصبية المتاحة تجاريا لتسريع نضج الشبكة الوظيفية بعد الطلاء ، وجدوى إجراء فحوصات وظيفية نهائية مثل العلاج بالعقاقير ، والتطبيق الواسع على العضيات التي تم إنشاؤها باستخدام بروتوكولات أخرى خاصة بالمنطقة.

الهدف هو توفير اختبار وظيفي بدقة زمنية عالية للتحقيق في نشاط الشبكة ، وفحص التغييرات الخاصة بالمرض ، واختبار الأدوية ذات الإمكانات العلاجية في الصرع. يتم توفير تعليمات الفيديو لأكثر الخطوات تحديا لهذا البروتوكول ، حيث توضح تقنيات تجميعات الطلاء على ألواح MEA ، بالإضافة إلى التسجيلات التمثيلية من هذه الثقافات.

Protocol

تم إجراء جميع الإجراءات التجريبية الموضحة أدناه وفقا للمبادئ التوجيهية الأخلاقية لمجلس المراجعة المؤسسية لكلية الطب بجامعة ميشيغان ولجنة الإشراف على أبحاث الخلايا الجذعية البشرية متعددة القدرات. تم اشتقاق خطوط iPSC المستخدمة في هذا البروتوكول والتجارب التمثيلية من الخلايا الليفية القلفة البشرية التي تم الحصول عليها من مصدر تجاري. يتم سرد تفاصيل خطوط الخلايا والكواشف والمعدات المستخدمة في هذه الدراسة في جدول المواد.

1. اشتقاق عضيات الدماغ الخاصة بالمصير من iPSCs

ملاحظة: يحتوي هذا البروتوكول على معلومات لإعداد 3 آبار في لوحة زراعة الآبار الصغيرة من 5 آبار ملتقية (~ 85٪) من صفيحة مكونة من 6 آبار. يختلف بروتوكول صيانة iPSC وفقا لخطوط الخلايا.

1. قم بإعداد وسائط زراعة الخلايا الفردية باستخدام التركيبة المفصلة في الجدول 1. يحفظ محميا من الضوء عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى أسبوعين.
2. اشطف جميع الآبار المراد استخدامها في لوح زراعة الميكروويل ب 1 مل من DMEM / F-12 مرة واحدة. أضف 1 مل / بئر mTeSR plus + 50 ميكرومتر Y-27632 وقم بتدوير اللوحة عند 2000 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لإزالة فقاعات الهواء من الآبار الصغيرة. قم بتخزين الطبق في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO₂ .
3. نظف مناطق iPSCs المتمايزة بطرف ماصة P10 معقمة تحت المجهر في مقعد نظيف للتدفق الرقائقي. اغسل بقايا الخلية من الطبقة الأحادية باستخدام 1 مل / بئر PBS بدون الكالسيوم أو المغنيسيوم.
4. قم بفصل الطبقة الأحادية إلى خلايا مفردة عن طريق إضافة 1 مل / بئر من كاشف تفكك الخلايا الدافئ مسبقا ووضع اللوحة في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO₂ لمدة 4-7 دقائق (اعتمادا على خصائص وملتقى خطوط الخلايا) حتى ترفع معظم الخلايا ، مع تحريك لطيف كل 2-3 دقائق.
5. أضف 4 مل من DMEM/F-12 إلى كل بئر لتخفيف كاشف تفكك الخلية، وقم بترتيورها بشكل معتدل باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل. اجمع تعليق الخلية من جميع آبار نفس الخط في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.
6. قم بالدوران عند 200 × جم لمدة 4 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، وشفط المادة الطافية باستخدام ماصة مصلية سعة 10 مل ، وأعد تعليق الخلايا في 2 مل من mTeSR plus + 50 ميكرومتر Y-27632. أخرج معلق خلوي سعة 10 ميكرولتر ، واخلطه 1: 1 (حجم / حجم) مع تريبان الأزرق ، وعد الخلايا بعداد الخلايا باستخدام عداد الخلايا الآلي.
7. لوحة 3 × 10⁶ خلايا حية لكل بئر ، 3 آبار لكل سطر. أضف mTeSR إضافيا + 50 ميكرومتر Y-27632 حسب الحاجة ليصل الحجم الإجمالي إلى 2 مل / بئر. قم بتدوير الطبق على حرارة 100 × جم لمدة 3 دقائق في درجة حرارة الغرفة ثم ضعه مرة أخرى في الحاضنة.
   ملاحظة: تحتوي لوحة زراعة الميكروويل المستخدمة هنا على 300 بئر صغير لكل بئر ، لذا فإن الطلاء 3 × 10⁶ خلايا ينتج عنه 10,000 خلية / ميكروبئر.
8. في اليوم التالي، قم بإجراء تغيير في الوسائط بنصف الحجم عن طريق إزالة 1 مل من الوسائط برفق وإضافة 1 مل ببطء من وسائط mTeSR plus (بدون Y-27632) باستخدام طرف ماصة P1000. احتفظ بالطرف بالقرب من سطح الوسائط والشفق ببطء قدر الإمكان ، حتى لا تزعج الخلايا المتراكمة في الأسفل.
9. تحقق تحت المجهر المقلوب بعد يوم واحد من تغيير الوسائط ، ويمكن رؤية مخطط واضح لكل مجموعة. قم بإزالة الوسائط الأصلية من كل بئر باستخدام أطراف ماصة P1000.
10. رش 0.5 مل من وسائط الحث العصبي (NIM) بشكل معتدل مع دورسومورفين (DM) و SB-4321542 (SB) في كل بئر بأطراف معقمة مقطوعة P1000. على الفور ، قم بسحب الركام المعلق في الوسائط برفق وانقلها إلى طبق ثقافة معلق معقم مقاس 10 سم. كرر حتى يتم نقل جميع الركام. لا تتريتورت.
11. أضف NIM + SB / DM إضافيا حسب الحاجة ليصل الحجم الإجمالي إلى 10 مل / طبق. ضع الطبق على شاكر مداري في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمنع الاندماج التلقائي للركام. ضع علامة على تاريخ النقل باعتباره اليوم 0 من الثقافة العضوية.
12. من اليوم 1 حتى النهاية ، اتبع وصفة الوسائط في الجدول 1 والجدول الزمني لتغيير الوسائط⁹ في الشكل 1. والجدير بالذكر أن العضيات مقسمة إلى طبقين معلقين للثقافة تم تعيينهما على أنهما "ظهري" و "بطني" في اليوم 4.
    ملاحظة: عدة نقاط زمنية رئيسية يجب وضعها في الاعتبار: يبدأ التمدد العضوي في اليوم 6 ، عندما يتم تحويل الوسائط إلى وسيط التمايز العصبي (NDM) باستخدام EGF / FGF. يتم دعم التمايز العصبي بدءا من اليوم 25 بواسطة NDM + BDNF / NT3 ، ويتم الحفاظ على العضيات في NDM بدون عوامل نمو تبدأ في اليوم 46.

2. وضع العلامات الفيروسية وتوليد التجمعات

ملاحظة: يوصى باستخدام الملصقات الفيروسية^7،9للتعرف على هوية كل عضو خاص بالمنطقة في مجموعة وتعيين نشاط الفيزيولوجيا الكهربية من أقطاب كهربائية محددة إلى مناطق التجميع. من الأفضل أن يتم طلاء عضو واحد فقط لكل بئر MEA. يمكن أن ينطبق هذا البروتوكول أيضا على الطلاء العضوي الفردي.

1. احسب أحجام مخزون الفيروسات ووسائط التخفيف التي سيتم استخدامها: هناك حاجة إلى 200 ميكرولتر من الوسائط التي تحتوي على فيروس لكل عضوية ليتم تسميتها يتم تصنيف العضيات الظهرية ب pAAV1-CAG-tdTomato، عادة بنسبة تخفيف تبلغ 1: 1000 (حجم / حجم)، أو حوالي 2 × 10¹⁰ vg / مل. بالنسبة للعضيات البطنية ، يتم استخدام فيروس 1: 300 (حجم / حجم) ، أو 2 × 10¹¹ vg / مل pAAV1-mDLX-GFP.
   ملاحظة: يجب معايرة التخفيفات إلى التأثير المطلوب وتتأثر بالعيار الفيروسي.
2. قم بتسخين الكمية المناسبة من الوسائط إلى 37 درجة مئوية. قم بإذابة مخزون الفيروسات المخزن عند -80 درجة مئوية على الجليد. قم بتسمية ما يكفي من الألواح المكونة من 48 بئرا لاستيعاب جميع العضويات المصنفة.
3. ضع دورق يحتوي على 10٪ مبيض في الغطاء. طرد أي مواد ملامسة للفيروسات في الدورق قم بتخفيف الفيروسات المذابة بالكامل في وسط الاستزراع في أنابيب مخروطية منفصلة سعة 15 مل ، تسمى "ظهرية" و "بطنية".
4. انقل اليوم 56 من أطباق الاستزراع إلى 48 طبقا بئرا. يوصى باستخدام عضوية واحدة لكل بئر لمنع الاندماج التلقائي في الثقافة الساكنة. قم بإزالة أكبر قدر ممكن من وسائط الثقافة المتبقية.
5. أضف 200 ميكرولتر من خليط وسائط الفيروسات إلى كل بئر ، على التوالي. ضع الألواح مرة أخرى في حاضنة 37 درجة مئوية 5٪ CO₂ . قم بإمالة الألواح على صفيحة فارغة معقمة للمساعدة في تركيز الجزيئات الفيروسية في قاع البئر وتحسين كفاءة النقل.
   ملاحظة: تميل الجسيمات الفيروسية إلى الغرق في قاع الأنبوب المخروطي سعة 15 مل ، لذا فإن عكس الأنبوب بشكل متكرر لخلط الفيروسات مع الوسائط قبل إضافتها إلى كل بئر مهم جدا لضمان كفاءة نقل موحدة لجميع العضيات.
6. في اليوم التالي (اليوم 57) ، أضف 800 ميكرولتر إضافية من وسائط الاستزراع إلى كل بئر ليصل الحجم الإجمالي إلى 1 مل / بئر.
7. بعد ثلاثة أيام (اليوم 60) ، قم بإجراء تغيير كامل للوسائط على العضيات المسماة. تبييض أي مواد ملامسة للجزيئات الفيروسية.
8. بعد ثلاثة أيام (اليوم 63) ، تحقق من التعبير الفلوري تحت المجهر المقلوب epifluorescence. إذا كانت الإشارة قوية ، فابدأ في توليد التجميعات (انظر الخطوة 2.9).
9. اشطف جميع العضيات المصنفة ب 1 مل / بئر PBS مرتين لمنع التلوث المتبادل عن طريق الجزيئات الفيروسية المتبقية أثناء الاندماج العضوي. استخدم طرف ماصة P1000 مقطوع لنقل عضو عضوي بطني واحد إلى كل بئر ظهري (أو العكس) وإعادة تسمية لوحة التجميع وفقا لذلك. قم بإمالة الألواح كما في الخطوة 2.5 للحصول على اندماج أفضل.
10. قم بإجراء تغيير وسائط بنصف الحجم بعناية بعد 3 أيام من إجراء الاندماج (اليوم 66) دون مقاطعة التجميعات. عادة ما يستغرق الأمر حوالي أسبوع لتشكيل تجمعات مستقرة (اليوم 70).

3. وضع التجميعات على ألواح MEA المعالجة مسبقا

ملاحظة: يستغرق الأمر 4 أيام على الأقل لإكمال إجراءات تحضير السطح لألواح MEA قبل تجميعات الطلاء. لتوفير الوقت ، يمكن إجراء دمج العضيات الظهرية والبطنية (أي الخطوة 2.9) والمعالجة المسبقة ل MEA بالتوازي.

1. تحضير الكواشف للمعالجة المسبقة للسطح والطلاء.
   1. لتحضير محلول منظف / إنزيم بنسبة 1٪ ، قم بإذابة 0.5 جم من مسحوق الإنزيم / المنظف في 50 مل من الماء منزوع الأيونات. دوامة جيدا حتى يذوب المسحوق تماما. عقم المحلول باستخدام فلتر فراغ علوي أنبوبي معقم في خزانة السلامة الحيوية قبل إضافته إلى آبار الشرق الأوسط وأفريقيا. اصنعها طازجة قبل كل استخدام.
      ملاحظة: يقوم المنظف/الإنزيم بتعقيم سطح الشرق الأوسط وأفريقيا، ويزيل أي زيوت متبقية من عملية التصنيع في منطقة الشرق الأوسط وأفريقيا، ويضمن أن السطح محب للماء بدرجة كافية لتعزيز التفاعلات مع مركب البولي إيثيلين المحب للماء (PEI)¹⁸.
   2. لتحضير محلول PEI بنسبة 0.07٪¹⁹ ، ابدأ بصنع محلول PEI بنسبة 7٪ عن طريق خلط 1 مل من محلول PEI بنسبة 50٪ في أنبوب مخروطي سعة 15 مل مع 6 مل من محلول بورات 1x. قم بتخفيف 1 مل من محلول PEI 7٪ في 99 مل من عازلة البورات 1x لتحقيق تركيز العمل النهائي. للتعقيم ، قم بالتصفية من خلال وحدة فلتر 0.22 ميكرومتر في خزانة السلامة الحيوية قبل الاستخدام.
      ملاحظة: يستخدم PEI ، وهو بوليمر موجب الشحنة ، في عملية الطلاء الأولية لتسهيل ربط طلاء ثانوي سالب الشحنة مع مصفوفة الغشاء القاعدي (BMM) والتجميعات²⁰. أخرج 1 مل من 50٪ من جزيرة الأمير إدوارد عن طريق الصب بدلا من سحب العينات في الأنبوب المخروطي ، لأن محلول المخزون شديد اللزجة. يمكن قياس الكمية المطلوبة بسهولة أكبر عن طريق وزنها في أنبوب مخروطي الشكل ، ويبلغ كثافة محلول PEI بنسبة 50٪ 1.08 جم / مل. يمكن تخزين محلول PEI بنسبة 7٪ في حصص 1 مل عند -20 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر. قم بتنفيذ جميع الخطوات اللاحقة في خزانة السلامة البيولوجية.
2. بالنظر إلى حجم كل مجموعة ، يتم استخدام ألواح MEA المكونة من 6 آبار مع 64 قطبا كهربائيا لكل بئر لاستيعاب مجموعة واحدة لكل بئر. احسب عدد لوحات MEA اللازمة للتجارب لضمان تكرارات بيولوجية كافية.
3. أضف 1 مل من محلول المنظفات / الإنزيم بنسبة 1٪ إلى كل بئر من صفيحة MEA المعقمة. احرص على عدم إتلاف الأقطاب الكهربائية بطرف الماصة. إذا كنت تستخدم شفاط فراغ للغسيل ، فلا تسمح للطرف بلمس مجموعة القطب. احتضان في حاضنة 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة.
4. قم بإزالة المنظفات / الإنزيم وغسل كل بئر خمس مرات ب 1.5 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات. نظرا لأن المنظفات / الإنزيم غير متوافقة حيويا ، فمن المهم التأكد من غسل المواد الكيميائية المتبقية تماما.
5. املأ كل بئر ب 1 مل من وسائط الثقافة للتكييف المسبق. أعد الألواح إلى 37 درجة مئوية 5٪ حاضنة ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة يومين. يؤدي تعريض سطح الشرق الأوسط وأفريقيا لظروف زراعة الخلايا إلى تعزيز ارتباط الخلية.
6. قم بإزالة وسائط الاستزراع وقم بتغطية أقطاب MEA في كل بئر ب 50 ميكرولتر من محلول PEI بنسبة 0.07٪ للطلاء الأولي. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
7. شفط محلول PEI بالكامل. اغسل كل بئر ب 1 مل من الماء المعقم منزوع الأيونات. قم بإجراء 3 غسلات سريعة في المجموع. جفف الأطباق في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة في خزانة السلامة الحيوية مع إغلاق الغطاء.
8. قم بتغطية منطقة القطب الكهربائي في كل بئر ب 50 ميكرولتر من 1:20 (حجم / حجم) BMM مخفف في وسائط الاستزراع للطلاء الثانوي. ضع ألواح MEA مرة أخرى في الحاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل. أضف الماء المعقم إلى المقصورات المحيطة بالآبار لضمان الرطوبة الكافية طوال فترة الطلاء.
9. في اليوم التالي ، قم بسحب BMM المخفف بفراغ ، تاركا طبقة رقيقة على السطح. إذا تشكلت طبقة سميكة، فقم برش منطقة ملامسة القطب بقوة بوسائط الاستزراع باستخدام طرف ماصة P1000. اغسل عدة مرات حسب الحاجة لإزالة أي قطع سميكة.
   ملاحظة: يمكن أن تتداخل BMM السميكة المتبقية مع ملامسة القطب الكهربائي للخلايا.
10. اجمع مجموعة بطرف P1000 مقطوع على نطاق واسع وضعها فوق الأقطاب الكهربائية في بئر مع نقل أقل قدر ممكن من الوسائط.
11. في غطاء التدفق الصفحي تحت نطاق التشريح ، ادفع التجميع بعناية بإبرة تشريح معقمة أو طرف P20 إلى الموقع المطلوب ، حيث يمكن تغطية كل من العضيات الظهرية والبطنية في الغالب بواسطة أقطاب كهربائية. استخدم طرف P20 لإزالة السائل حول التجميع. كرر هذا لجميع التجميعات أو مجموعة فرعية ، والتي يمكن القيام بها في غضون بضع دقائق.
    ملاحظة: حاول ألا تلمس أو تخدش سطح MEA بطرف الماصة و/أو الإبرة. حاول ألا تمزق أو تمزق التجميع بأطراف الماصة. قم بإنهاء الطلاء في أسرع وقت ممكن لتجنب جفاف العضوية تماما.
12. احتضان التجميعات عند 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق (بدون وسائط). انقل الألواح من الحاضنة إلى غطاء التدفق الرقائقي وقم بتطبيق 2-3 قطرات صغيرة من 1:50 BMM مخففة في وسط الاستزراع أعلى التجميعات تحت نطاق التشريح. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أخرى.
13. أضف بعناية 3 قطرات من وسائط الثقافة بالقرب من التجميعات تحت نطاق التشريح. هذا يحافظ على رطوبة العضيات. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 1 ساعة.
    ملاحظة: إذا تحرك التجميع أو طفو في أي خطوات لاحقة ، فيجب إعادة تشغيل الطلاء من الخطوة 3.11.
14. كل ساعة ، أضف بعناية 20-50 ميكرولتر من وسائط زراعة الخلايا إلى كل بئر تحت نطاق التشريح. يمكن القيام بذلك على مدار اليوم. الهدف هو الوصول إلى 250 ميكرولتر على الأقل من الحجم الإجمالي في نهاية اليوم.
15. في اليوم التالي ، تحقق مما إذا كانت جميع التجميعات قد استقرت واستقرت تحت نطاق التشريح. أضف 750 ميكرولتر إضافيا من وسائط الاستزراع للوصول إلى الحجم الإجمالي 1 مل / بئر. اترك الأطباق دون إزعاج لمدة يومين على الأقل.
16. قم بإجراء تغييرات أسبوعية في الوسائط بعناية عن طريق إخراج 500 ميكرولتر من وسائط الاستزراع وإضافة 700 ميكرولتر من الوسائط القاعدية الفيزيولوجية العصبية. يمثل الحجم الإضافي للوسائط المضافة التبخر ويمكن تعديله اعتمادا على مقدار التبخر الذي تستخدمه لوحة MEA. أضف الماء المعقم حول الآبار حسب الحاجة لتقليل التبخر من آبار الشرق الأوسط وأفريقيا.

4. تسجيل MEA وتحليل البيانات

1. ابدأ تسجيل MEA بعد حوالي أسبوع من التحول إلى الوسائط القاعدية الفيزيولوجية العصبية (عادة حوالي اليوم 78).
2. انتظر حتى تصل غرفة التسجيل إلى درجة الحرارة المحددة (عادة 37 درجة مئوية). انقل لوحة إلى الجهاز واتركها تتوازن لمدة 5 دقائق على الأقل قبل التسجيل.
3. الإعدادات المباشرة للأجهزة
   1. اضبط تردد أخذ العينات ، أي معدل تسجيل بيانات الجهد الخام. يوصى بالإعداد الافتراضي (12.5 كيلو هرتز).
   2. حدد الوضع التناظري (عادة المسامير العصبية، كما في هذه الحالة) لتكوين عرض النطاق الترددي للأجهزة والكسب لتطبيقات معينة. للمراقبة المرئية للنشاط أثناء التسجيل ، استخدم وحدات Spike Detector و Burst Detector.
      ملاحظة: تؤثر الإعدادات التناظرية على كيفية تسجيل بيانات الجهد الخام ولا يمكن تغييرها بعد تسجيل البيانات.
   3. (اختياري) قم بتطبيق عامل تصفية رقمي للأجهزة على بيانات التسجيل. تتضمن خيارات مرشح التمرير المنخفض نافذة كايزر 2 كيلو هرتز أو 3 كيلو هرتز. يمكن تعديل الإعدادات الافتراضية بعد تحديد الإعدادات التناظرية.
   4. اضبط على المرجع حسب الوسيط (افتراضي)، وهو أمر موصى به بشدة للتسجيل العصبي، كما في هذه الحالة. تعمل الإشارة على تحسين جودة الإشارات ذات السعة المنخفضة عن طريق تقليل تداخل الضوضاء المشترك بين مجموعات القنوات.
      ملاحظة: يمكن ضبط المعلمات المذكورة أعلاه حسب الحاجة اعتمادا على النشاط الذي يظهر في التجميعات، ولكن يجب أن تظل متسقة لجميع التسجيلات في تجربة معينة.
4. أضف خرائط وأوصاف اللوحة (إذا لزم الأمر). قم باستيراد خريطة اللوحة من التسجيل السابق لنفس اللوحة لضمان الاتساق وتسهيل معالجة بيانات الدفعات. تأكد من تسمية الملفات بشكل صحيح.
5. إذا كانت الإشارات تبدو جيدة (الحد الأدنى من الضوضاء والقطع الأثرية)، فقم بتسجيل البيانات الأولية. بشكل عام ، يكفي 2-5 دقائق من التسجيل لعينة تمثيلية.
6. سجل النشاط الكهربائي طوليا مرة أو مرتين في الأسبوع ، أكثر من 5-15 دقيقة ، اعتمادا على التصميم التجريبي. انتظر لمدة 24 ساعة على الأقل بعد كل تغيير للوسائط قبل بدء الجولة التالية من التسجيل ، حيث ينخفض النشاط الكهربائي مباشرة بعد كل تغيير للوسائط.
7. (اختياري) إذا كان النشاط الكهربائي بحاجة إلى توطين وتمييز بين العضيات الظهرية والبطنية ، أو إذا كان نشاط كل قطب يحتاج إلى تحليل منفصل ، فاحصل على صورة لكل مجموعة تحت مجال ساطع وتألق (الشكل 2 ب) بعد كل تسجيل.
8. عند تحليل البيانات ، قم بتطبيق تكوين التحليل ، بما في ذلك كاشف الارتفاع / الاندفاع ومترجم الإحصائيات. استخدم عتبة تكيفية معينة إلى 5.5-6 انحرافات معيارية عن خط الأساس لاكتشاف الارتفاع. حدد الرشقات النارية كنشاط مع ≥5 طفرات في 100 مللي ثانية¹³. حدد نشاط الشبكة عندما يتم إطلاق أكثر من 25٪ من إجمالي الأقطاب الكهربائية النشطة في غضون 100 مللي ثانية بحد أدنى 50 طفرة لكل انفجار للشبكة^13,14.
   ملاحظة: يتم تعديل هذه المعلمات اعتمادا على خصائص إطلاق النار لتجربة معينة. لزيادة الحساسية لارتفاعات السعة المنخفضة ، يمكن خفض العتبة التكيفية لاكتشاف السنبلة. للكشف عن الاندفاع ، يمكن استخدام طرق مختلفة ، ويمكن تكييف المعلمات للكشف عن رشقات نارية من المسامير التي تختلف اختلافا كبيرا عن نشاط الخلفية. يمكن تعديل معلمات نشاط الشبكة إلى نسبة أقل من الأقطاب الكهربائية ، خاصة عندما لا تغطي التجميعات مجال الأقطاب الكهربائية بالكامل. يجب أن تظل جميع المعلمات متسقة طوال مدة التجربة للسماح بإجراء مقارنات طولية.
9. قم بتشغيل الوحدة النمطية لمترجم الإحصائيات لمعالجة الدفعات أثناء إعادة تشغيل البيانات المسجلة. قم بتصدير المقاييس المتقدمة و / أو ملفات الإخراج المتقدمة للتحليل المتقدم.
   ملاحظة: يحتوي إخراج المقاييس المتقدمة على ملف .csv يحتوي على متوسط قطب كهربائي وبئر ومجموعة لمتوسط الإطلاق والانفجار والمزامنة. يتضمن إخراج Spike (ملف .spk) تتبعات شكل موجي لجميع الارتفاعات ، والتي يمكن استيرادها إلى منصات أخرى للتحليل المتقدم ، على سبيل المثال ، فرز السنبلة.

5. الفحص الدوائي النهائي وإعادة تدوير الألواح

ملاحظة: يمكن إجراء فحوصات العلاج بالعقاقير بعد أن تنضج التجميعات بدرجة كافية ويصل النشاط الكهربائي إلى ذروته. يجب إجراء تسجيل نشاط خط الأساس / ما قبل العلاج ونشاط ما بعد العلاج في نفس اليوم.

1. أضف 1-10 ميكرولتر من محلول الدواء فوق التجميع مباشرة وقم بتدوير اللوحة برفق لضمان خليط موحد. يوصى بوقت حضانة أطول في الوسائط المحتوية على المخدرات في بعض الحالات ، على سبيل المثال ، فحوصات العلاج بالعقاقير المرتبطة بالمشبك مع ناهضات / مضادات مستقبلات الغلوتامات / GABA (الشكل 2 ه) (انظر قسم النتائج للحصول على التفاصيل).
   ملاحظة: يوصى بإضافة كمية صغيرة من محلول الدواء إلى كل بئر لتحقيق تركيز العمل النهائي لأن التغيير الكبير في الحجم سيقلل مؤقتا من النشاط الكهربائي بشكل عام. من المهم التأكد من أن إضافة مركبة يتم فيها إذابة الأدوية ذات الأهمية لا تثير تغييرات كبيرة في المعلمات الفيزيولوجية الكهربية.
2. قم بإجراء ما يكفي من غسالات PBS (عادة 3) وغسل الأدوية بعد تسجيل ما بعد العلاج. قم بإجراء تسجيل إضافي في اليوم التالي بعد غسل الدواء لمعرفة ما إذا كان النشاط الكهربائي سيعود إلى المستوى الأساسي.
3. اختياريا ، قم بسحب الوسائط بقوة لفصل التجميعات عن لوحة MEA في نهاية التسجيلات لإجراء المزيد من التجارب ، على سبيل المثال ، التصوير المباشر ، أو التثبيت باستخدام 4٪ بارافورمالدهيد للتلوين المناعي بالكامل ، أو التحلل لاستخراج الحمض النووي الريبي أو البروتين.
4. لأغراض التحليل ، استخدم ما لا يقل عن ثلاثة تكرارات فنية وبيولوجية لكل حالة. عبر عن البيانات الفيزيولوجية الكهربية كمتوسط n ≥ 3 يتكرر.
5. لإعادة تدوير اللوحة في نهاية التجارب ، قم بشفط الوسائط المتبقية بعد إزالة التجميعات المرفقة. يغسل مرة واحدة باستخدام PBS المعقم. قم بتغطية المنطقة المعدنية بالكامل ب 200 ميكرولتر / بئر 0.25٪ تريبسين-EDTA وأعد اللوحة إلى حاضنة 37 درجة مئوية طوال الليل.
6. في اليوم التالي ، استنشق التربسين ، واغسلها مرتين ب 70٪ من الإيثانول المعقم وثلاث مرات بالماء المعقم منزوع الأيونات.
7. جفف اللوحة بالهواء في خزانة السلامة الحيوية لمدة 15 دقيقة مع إغلاق الغطاء أو حتى يجف تماما. أغلق الطبق النظيف في كيس بلاستيكي واحفظه في درجة حرارة الغرفة حتى الاستخدام المستقبلي.
   ملاحظة: يمكن إعادة استخدام لوحة MEA التي تم تنظيفها جيدا ثلاث مرات دون فقدان جودة التسجيل بشكل كبير.

النتائج

تم طلاء التجمعات الظهرية البطنية البشرية على صفيحة MEA مكونة من 6 آبار (ن = 6 لكل تمايز ، 3 تمايز) ، مع احتواء كل بئر على 64 قطبا كهربائيا (الشكل 2 أ). تم توصيل تسعة من أصل عشرة مجموعات مخططة للتسجيل الطولي بإحكام بالأقطاب الكهربائية لأكثر من 50 ي?...

Discussion

تم استخدام الطرق المستندة إلى MEA للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربية لنشاط الشبكة في التجمعات المشتقة من iPSC للنمذجة المختبرية للصرع^22،23. هذه المنصة المقترحة التي تدمج الوصلات المشبكية المثيرة والمثبطة لديها القدرة على معالجة آليات فرط ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench