使用人类多能干细胞来源的脑组件对癫痫进行建模的多电极阵列平台

摘要

该协议旨在将背腹融合组合稳定地接种在多电极阵列上，用于体外模拟癫痫。

摘要

人脑类器官是源自人类多能干细胞 （hPSC） 的三维 （3D） 结构，概括了胎儿大脑发育的各个方面。背侧与腹侧区域指定的脑类器官 在体外融合产生 组合体，这些组合体具有与兴奋性和抑制性神经元的功能集成微回路。由于其结构复杂性和神经元群的多样性，组装体已成为研究异常网络 活动的有用体外 工具。多电极阵列 （MEA） 记录是一种从神经元群中捕获电场电位、尖峰和纵向网络动力学的方法，而不会影响细胞膜的完整性。然而，由于电极尺寸大且与电极的接触表面积有限，因此将组件粘附到电极上以进行长期记录可能具有挑战性。在这里，我们展示了一种将组装体接种到 MEA 板上以记录 2 个月内电生理活性的方法。尽管目前的协议利用人类皮质类器官，但它可以广泛适应分化为模拟其他大脑区域的类器官。该协议建立了一种稳健的纵向电生理测定法，用于研究神经元网络的发展，该平台有可能用于癫痫治疗开发的药物筛选。

引言

人类多能干细胞 （hPSC） 衍生的脑类器官是空间自组织的 3D 结构，反映了体内的组织结构和发育轨迹。它们由多种细胞类型组成，包括祖细胞（神经上皮细胞、放射状神经胶质细胞、神经元祖细胞、神经胶质祖细胞）、神经元（皮质样兴奋性神经元和抑制性中间神经元）和神经胶质细胞（星形胶质细胞和少突胶质细胞）^1,2。组装体代表了下一代脑类器官，能够在 3D 培养物中整合多个大脑区域和/或细胞谱系。它们为模拟类似于体内对应物的各种大脑区域之间的连接、捕获神经元和星形胶质细胞之间的相互作用以更好地模拟成熟和复杂的神经网络以及研究神经回路的组装提供了一个有用的工具。因此，组合体正在成为一种广泛使用的工具，用于概括癫痫病理生理学的特征，其中功能措施是必要的，以询问可能是疾病原因基础的异常神经网络 3,4,5,6。

为了模拟皮质谷氨酸能神经元和 GABA 能中间神经元之间的相互作用，几个小组开发了类似于背侧和腹侧大脑的单独类器官，然后将它们融合在一起形成一个多区域组合体 7,8,9,10。在这里，应用了先前描述的具有区域特异性神经亚型的组装体培养方案⁹。然而，一个重大障碍是缺乏可重复的功能测定来监测神经发育过程中的神经网络活动。类器官中网络的许多功能测试产生的结果在分化批次和细胞系之间具有高度可变性。涉及切片或解离类器官的技术通过切断突触连接来改变其固有网络⁸。

多电极阵列 （MEA） 以高时间分辨率提供网络活动随时间变化的大规模视图，以表征类器官的电生理特性，而不会破坏培养条件或细胞膜完整性¹¹。与膜片钳电生理学相比，MEA 能够基于大量神经元而不是单个细胞进行高通量数据采集。MEA 平台的电极密度各不相同，可满足脑类器官研究的不同需求¹²。如本协议所示，广泛使用的系统记录每孔 8 到 64 个电极 13,14,15。每孔多达 26,400 个电极的高密度 MEA 可以提高空间和时间分辨率，量化动作电位传播速度，并与光遗传学刺激相结合 14,16,17。因此，MEA 是体外模拟癫痫的有力工具和抗癫痫药物筛选的转化范式。

一个主要挑战是将大型组合体稳定在疏水金属表面上以进行长期记录。该协议概述了在 MEA 板上铺板完整组装体以进行长期纵向记录以及药理学测定的详细方法。该方案的独特优势包括将组装体稳定地附着在电极表面而不会失去电活性，使用市售的神经生理学基础培养基来加速电镀后的功能网络成熟，进行下游功能测定（如药物治疗）的可行性，以及广泛应用于使用其他区域特异性方案生成的类器官。

目标是提供一种具有高时间分辨率的功能测定，以研究网络活动、检查疾病特异性变化并测试具有癫痫治疗潜力的药物。为该方案中最具挑战性的步骤提供了视频说明，展示了在 MEA 板上铺板组装体的技术，以及来自这些培养物的代表性记录。

研究方案

下面演示的所有实验程序均根据密歇根大学医学院机构审查委员会和人类多能干细胞研究监督委员会的道德准则进行。该方案和代表性实验中使用的 iPSC 系来源于从商业来源获得的人包皮成纤维细胞。本研究中使用的细胞系、试剂和设备的详细信息列在 材料表中。

1. 从 iPSC 衍生命运特异性脑类器官

注：该方案包含从 6 孔板的 5 个汇合 （~85%） 孔中制备微孔培养板中 3 个孔的信息。iPSC 维持方案因细胞系而异。

1. 使用 表 1 中详述的组合物制备单个细胞培养基。在 4 °C 下避光保存长达 2 周。
2. 用 1 mL DMEM/F-12 冲洗所有用于微孔培养板的孔一次。加入 1 mL/孔 mTeSR plus + 50 μM Y-27632，并在室温下以 2000 x g 旋转板 5 分钟，以去除微孔中的气泡。将板储存在 37 °C 5% CO₂ 培养箱中。
3. 在层流超净工作台的显微镜下，用无菌 P10 移液器吸头清洁分化的 iPSC 区域。用不含钙或镁的 1 mL/孔 PBS 洗去单层细胞碎片。
4. 通过加入 1 mL/孔的预热细胞解离试剂并将板置于 37 °C 5% CO₂ 培养箱中 4-7 分钟（取决于细胞系的特性和汇合度），将单层解离成单细胞，每 2-3 分钟轻轻搅拌一次。
5. 向每个孔中加入 4 mL DMEM/F-12 以稀释细胞解离试剂，并用 10 mL 血清移液管适度研磨。将来自同一行所有孔的细胞悬液收集到 50 mL 锥形管中。
6. 在室温下以 200 x g 旋转 4 分钟，使用 10 mL 血清移液管吸出上清液，并将细胞重悬于 2 mL mTeSR 加 + 50 μM Y-27632 中。取出 10 μL 细胞悬液，与台盼蓝以 1：1 （v/v） 混合，用自动细胞计数仪对细胞进行计数。
7. 板 3 x 10 每孔⁶ 个活细胞，每条线 3 个孔。根据需要添加额外的 mTeSR plus + 50 μM Y-27632，使总体积达到 2 mL/孔。在室温下以 100 x g 旋转板 3 分钟，然后将其放回培养箱中。
   注：此处使用的微孔培养板每孔包含 300 个微孔，因此接种 3 x 10^{个 6} 个细胞可得到 10,000 个细胞/微孔。
8. 第二天，轻轻去除 1 mL 培养基，然后用 P1000 移液器吸头缓慢加入 1 mL mTeSR plus 培养基（不含 Y-27632），进行半体积培养基更换。将尖端保持在培养基表面附近并尽可能缓慢地吸出，以免干扰底部的聚集细胞。
9. 更换培养基后一天在倒置显微镜下检查，可以看到每个聚集体的清晰轮廓。使用 P1000 移液器吸头从每个孔中取出原始培养基。
10. 将 0.5 mL 神经诱导培养基 （NIM） 与背吗啡 （DM） 和 SB-4321542 （SB） 适度喷洒到每个孔中，并带有无菌、切割的 P1000 尖端。立即轻轻吸取悬浮在培养基中的聚集体，并将其转移到无菌的 10 cm 悬浮培养皿中。重复此操作，直到传输完所有聚合。不要研磨。
11. 根据需要添加额外的 NIM + SB/DM，使总体积达到 10 mL/皿。将培养皿放在 37 °C 5% CO₂ 培养箱中的轨道振荡器上，以防止聚集体自发融合。将转移日期标记为类器官培养的第 0 天。
12. 从第 1 天到结束，遵循表 1 中的媒体配方和图 1 中的媒体更改时间线⁹。值得注意的是，类器官在第 4 天被分成两个悬浮培养皿，分别命名为“背侧”和“腹侧”。
    注：要记住几个关键时间点：类器官扩增从第 6 天开始，此时培养基切换到含 EGF/FGF 的神经分化培养基 （NDM）。从第 25 天开始，NDM + BDNF/NT3 支持神经元分化，从第 46 天开始，类器官维持在 NDM 中，没有生长因子。

2. 病毒标记和组装体的生成

注意：建议使用病毒标记 ^7,9 来识别组合体中每个区域特异性类器官的身份，并将来自特定电极的电生理活性分配给组装体区域。如果每个 MEA 孔只接种一个类器官，则这是最佳选择。该协议也适用于单个类器官电镀。

1. 计算要使用的病毒原液和稀释培养基的体积：每个待标记的类器官需要 200 μL 含有病毒的培养基。背侧类器官用 pAAV1-CAG-tdTomato 标记，通常稀释比例为 1：1000 （v/v），或大约 2 x 10¹⁰ vg/mL。对于腹侧类器官，使用 1：300 （v/v） 或 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP 病毒。
   注：稀释液应滴定至所需效果，并受病毒滴度影响。
2. 将适量的培养基加热至 37 °C。 解冻病毒原液，在-80°C下储存在冰上。标记足够的 48 孔板以容纳所有标记的类器官。
3. 将含有 10% 漂白剂的烧杯放入罩中。将任何与病毒接触的材料排出到烧杯中。在单独的 15 mL 锥形管中稀释培养基中完全解冻的病毒，标记为“背侧”和“腹侧”。
4. 将第 56 天的类器官从培养皿移至 48 孔板中。建议每孔一个类器官，以防止静态培养中的自发融合。尽可能多地去除残留的培养基。
5. 分别向每个孔中加入 200 μL 病毒-培养基混合物。将板放回 37 °C 5% CO₂ 培养箱中。将板倾斜在无菌空板上，以帮助将病毒颗粒浓缩到孔底部并优化转导效率。
   注：病毒颗粒往往会沉到 15 mL 锥形管的底部，因此在将病毒添加到每个孔中之前，经常倒置试管以将病毒与培养基混合，这对于确保所有类器官的均一转导效率非常重要。
6. 第二天（第 57 天），向每个孔中额外添加 800 μL 培养基，使总体积达到 1 mL/孔。
7. 三天后（第 60 天），对标记的类器官进行完整的培养基更换。漂白任何与病毒颗粒接触的材料。
8. 三天后（第 63 天），在落射荧光倒置显微镜下检查荧光表达。如果信号很强，则开始生成组合体（请参阅步骤 2.9）。
9. 用 1 mL/孔 PBS 冲洗所有标记的类器官两次，以防止类器官融合过程中残留的病毒颗粒交叉污染。使用切割的 P1000 移液器吸头将一个腹侧类器官转移到每个背孔（反之亦然），并相应地重新标记组装板。按照步骤 2.5 倾斜板以获得更好的融合。
10. 在融合程序后 3 天（第 66 天）小心地进行半体积培养基更换，不要中断组装。通常需要大约一周的时间才能形成稳定的组合体（第 70 天）。

3. 将组件放置在预处理的 MEA 板上

注意：在电镀组件之前，至少需要 4 天才能完成 MEA 板的表面处理程序。为了节省时间，可以同时进行背侧和腹侧类器官（即步骤 2.9）和 MEA 预处理。

1. 准备用于表面预处理和涂层的试剂。
   1. 要制备 1% 去离子剂/酶溶液，请将 0.5 g 酶/去污剂粉末溶解在 50 mL 去离子水中。彻底涡旋，直到粉末完全溶解。在将溶液添加到 MEA 孔中之前，在生物安全柜中用无菌管顶真空过滤器对溶液进行消毒。每次使用前都要新鲜。
      注：洗涤剂/酶对 MEA 表面进行消毒，去除 MEA 制造过程中的任何残留油，并确保表面具有足够的亲水性，以促进与亲水性化合物聚乙烯亚胺 （PEI） 的相互作用¹⁸。
   2. 要制备 0.07% PEI 溶液¹⁹，首先将 1 mL 50% PEI 溶液混合到装有 6 mL 1x 硼酸盐缓冲液的 15 mL 锥形管中，制备 7% PEI 储备液。在 99 mL 1x 硼酸盐缓冲液中稀释 1 mL 7% PEI 原液，以达到最终工作浓度。灭菌时，使用前通过生物安全柜中的 0.22 μm 过滤器单元进行过滤。
      注：PEI 是一种带正电荷的聚合物，用于初级涂层工艺，以促进带负电荷的次涂层与基底膜基质 （BMM） 和组件²⁰ 的结合。通过倒入而不是移液到锥形管中，取出 1 mL 的 50% PEI，因为储备溶液非常粘稠。称量到锥形管中可以更轻松地测量所需量，50% PEI 溶液的密度为 1.08 g/mL。7% PEI 储备液可在 -20 °C 下以 1 mL 等分试样储存长达一个月。在生物安全柜中执行所有后续步骤。
2. 考虑到每个组合体的大小，使用每孔 64 个电极的 6 孔 MEA 板，以容纳每孔一个组合体。计算实验所需的 MEA 板数，以确保足够的生物重复。
3. 向无菌 MEA 板的每个孔中加入 1 mL 1% 去污剂/酶溶液。小心不要用移液器吸头损坏电极。如果使用真空吸液器进行清洗，请勿让吸头接触电极阵列。在 37 °C 培养箱中孵育 2 小时。
4. 去除去污剂/酶，用 1.5 mL 无菌去离子水洗涤每个孔 5 次。由于洗涤剂/酶不具有生物相容性，因此确保完全洗掉剩余的化学物质非常重要。
5. 用 1 mL 培养基填充每个孔以进行预处理。将板放回 37 °C 5% CO₂ 培养箱中 2 天。将 MEA 表面暴露于细胞培养条件会促进细胞粘附。
6. 去除培养基，并用 50 μL 0.07% PEI 溶液覆盖每个孔中的 MEA 电极，用于初级包被。在 37 °C 孵育 1 小时。
7. 完全吸出 PEI 溶液。用 1 mL 无菌去离子水清洗每个孔。总共执行 3 次快速洗涤。在生物安全柜中在室温下干燥板 15 分钟，并盖上盖子。
8. 用 50 μL 在培养基中稀释的 1：20 （v/v） BMM 覆盖每个孔中的电极区域，用于二次包被。将MEA板放回37°C培养箱中过夜。在孔周围的隔间中添加无菌水，以确保在整个涂层过程中有足够的湿度。
9. 第二天，用真空吸出稀释的 BMM，在表面留下一层薄薄的。如果已形成厚层，请使用 P1000 移液器吸头用培养基强行喷洒电极接触区域。根据需要多次洗涤以去除任何厚块。
   注意：残留的厚 BMM 会干扰电极与电池的接触。
10. 收集带有宽切割 P1000 尖端的组件，并将其放在孔中的电极顶部，同时转移尽可能少的介质。
11. 在解剖镜下的层流罩中，用无菌解剖针或 P20 尖端小心地将组件推到所需位置，其中背侧和腹侧类器官大部分可以被电极覆盖。使用 P20 吸头去除组件周围的液体。对所有组合或子集重复此操作，这可以在几分钟内完成。
    注意：尽量不要用移液器吸头和/或针头触摸或刮擦 MEA 表面。尽量不要用移液器吸头戳或撕裂组件。尽快完成电镀，以避免类器官完全干燥。
12. 将组装体在 37 °C 下孵育 10 分钟（无培养基）。将板从培养箱转移到层流罩中，并在解剖镜下将 2-3 小滴 1：50 BMM 稀释在培养基中，滴在组装体的顶部。在 37 °C 下再孵育 30 分钟。
13. 在解剖范围内，小心地在靠近组合体的位置加入 3 滴培养基。这样可以保持类器官的水分。在 37 °C 孵育 1 小时。
    注意：如果组件在任何后续步骤中移动或浮动，则应从步骤 3.11 重新开始电镀。
14. 每小时在解剖范围内小心地向每个孔中加入 20-50 μL 细胞培养基。这可以在一天内完成。目标是在一天结束时达到至少 250 μL 的总体积。
15. 第二天，检查是否所有组合物在解剖范围内沉降并稳定。额外添加 750 μL 培养基，使总体积达到 1 mL/孔。让板保持至少 2 天不受干扰。
16. 小心地进行每周更换培养基，取出 500 μL 培养基并添加 700 μL 神经生理学基础培养基。添加的额外介质体积考虑了蒸发量，可以根据所使用的 MEA 板的蒸发量进行调整。根据需要在孔周围添加无菌水，以尽量减少 MEA 孔的蒸发。

4. MEA 记录和数据分析

1. 在切换到神经生理学基础培养基后约一周（通常在第 78 天左右）开始 MEA 记录。
2. 等待记录室达到其设定温度（通常为 37 °C）。将板转移到设备上，并在记录前让它们平衡至少 5 分钟。
3. 硬件实时设置
   1. 设置采样频率，即记录原始电压数据的速率。建议使用默认设置 （12.5 kHz）。
   2. 指定模拟模式（通常为 Neural Spikes，在本例中）以配置特定应用的硬件带宽和增益。要在录制期间对活动进行可视化监控，请使用 Spike Detector 和 Burst Detector 模块。
      注意： 模拟设置会影响原始电压数据的记录方式，并且在记录数据后无法更改。
   3. （可选）将硬件数字滤波器应用于录制数据。低通滤波器选项包括 2 kHz 或 3 kHz Kaiser 窗口。选择 Analog 设置后，可以修改默认设置。
   4. 设置为 referencing by median （default），强烈建议用于神经录制，在本例中。引用通过减少信道组常见的噪声干扰来提高低幅度信号的质量。
      注：上述参数可以根据组合体中看到的活动根据需要进行调整，但对于给定实验中的所有记录，应保持一致。
4. 添加板图和描述（如果需要）。从同一板的先前记录中导入板图，以确保一致性并促进批量数据处理。确保文件命名正确。
5. 如果信号看起来不错（噪声和伪影最小），请记录原始数据。通常，2-5 分钟的录制就足以获得代表性样本。
6. 每周纵向记录一次或两次电活动，持续 5-15 分钟，具体取决于实验设计。在每次更换介质后至少等待 24 小时，然后再开始下一轮记录，因为每次更换介质后电活动都会立即下降。
7. （可选）如果需要定位和区分背侧和腹侧类器官的电活动，或者需要单独分析每个电极的活动，请在每次记录后在明场和落射荧光下获得每个组合体的图像（图 2B）。
8. 分析数据时，应用分析配置，包括尖峰/突发检测器和统计信息编译器。使用设置为基线 5.5-6 个标准差的自适应阈值进行加标检测。将突发识别为在 100 毫秒内出现 ≥5 个峰值的活动¹³.定义在 100 毫秒内超过 25% 的总有源电极触发时的网络活动，每个网络突发至少有 50 个尖峰^13,14。
   注意：这些参数是根据特定实验的烧制特性进行调制的。为了提高对低幅度尖峰的灵敏度，可以降低尖峰检测的自适应阈值。对于突发检测，可以使用各种方法，并且可以调整参数来检测与后台活动明显不同的峰值突发。网络活性参数可以调制到较低百分比的电极，特别是当组装体不覆盖整个电极区域时。所有参数应在实验期间保持一致，以便进行纵向比较。
9. 运行 Statistics Compiler 模块进行批处理，同时重放记录的数据。导出高级指标和/或峰值输出文件以进行高级分析。
   注：高级指标输出包含 .csv 文件，其中包含平均发射、爆发和同步的电极、阱和组平均值。尖峰输出（.spk 文件）包括所有尖峰的波形轨迹，可以将其导入到其他平台进行高级分析，例如尖峰排序。

5. 终点药理测定和板回收

注：药物治疗测定可以在组装体足够成熟且电活动达到峰值后进行。基线/治疗前活动和治疗后活动的记录需要在同一天进行。

1. 在组装体的顶部加入 1-10 μL 药物溶液，轻轻旋转板以确保混合物均匀。在某些情况下，建议在含药物的培养基中孵育更长的时间，例如，使用谷氨酸/GABA 受体激动剂/拮抗剂进行突触相关药物治疗测定（图 2E）（有关详细信息，请参见结果部分）。
   注：建议向每个孔中加入少量药物溶液以达到最终工作浓度，因为较大的体积变化通常会暂时降低电活性。重要的是要确保添加溶解目标药物的载体不会引起电生理参数的显着变化。
2. 进行足够的 PBS 洗涤（通常为 3 次）并在处理后记录后洗出药物。在药物清除后的第二天进行额外的记录，以查看电活动是否恢复到基线水平。
3. 或者，在记录结束时用力移液介质以将组装体与 MEA 板分离以进行进一步的实验，例如，实时成像、用 4% 多聚甲醛固定以进行整体免疫染色，或裂解用于 RNA 或蛋白质提取。
4. 出于分析目的，针对每种情况至少使用 3 个技术和生物学重复。将电生理数据表示为 n ≥ 3 次重复的平均值。
5. 要在实验结束时回收板，请在去除附着的组合体后吸出剩余的培养基。用无菌 PBS 洗涤一次。用 200 μL/孔的 0.25% 胰蛋白酶-EDTA 完全覆盖金属区域，并将板放回 37 °C 培养箱中过夜。
6. 第二天，吸出胰蛋白酶，用 70% 无菌乙醇洗涤两次，用无菌去离子水洗涤 3 次。
7. 在关闭盖子的情况下，将生物安全柜中的板风干 15 分钟或直到完全干燥。将清洁后的板密封在塑料袋中，并在室温下储存以备将来使用。
   注意：清洁良好的 MEA 板可以重复使用 3 次，而不会显着降低记录质量。

结果

将人背腹组合体接种在 6 孔 MEA 板上（每次分化 n = 6,3 次分化），每个孔包含 64 个电极（图 2A）。计划用于纵向记录的 10 个组装体中有 9 个在体外牢固地附着在电极上超过 50 天（图 2D）。指定用于药理学测定的 8 个组合体中有 6 个在清除阶段以适合开发阶段的网络活性成功沉淀（

讨论

基于 MEA 的 iPSC 衍生组合体中网络活动的电生理记录方法已用于癫痫的体外建模^22,23。这个整合兴奋性和抑制性突触连接的平台有可能解决神经元过度兴奋的机制和皮层中间神经元在癫痫发生过程中的作用。此外，该平台允许在体外稳定组装体和收集纵向电生理数据约 50 天，即使在存在药理学扰动的情况下也是如?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench