인간 만능 줄기 세포 유래 뇌 조립체를 사용하여 간질을 모델링하기 위한 다중 전극 어레이 플랫폼

요약

이 프로토콜은 in vitro에서 간질을 모델링하기 위해 다중 전극 어레이에 dorsal-ventral fused assembloids를 안정적으로 도금하는 것을 목표로 합니다.

초록

인간 뇌 오가노이드는 인간 만능줄기세포(hPSC)에서 파생된 3차원(3D) 구조로, 태아 뇌 발달의 측면을 요약합니다. 시험관 내에서 등쪽과 복부 국소적으로 지정된 뇌 오가노이드의 융합은 흥분성 및 억제성 뉴런과 기능적으로 통합된 미세 회로를 가진 assembloids를 생성합니다. 구조적 복잡성과 다양한 뉴런 개체군으로 인해 assembloids는 비정상적인 네트워크 활동을 연구하는 데 유용한 in vitro 도구가 되었습니다. MEA(Multi-electrode Array) 기록은 세포막 무결성을 손상시키지 않으면서 뉴런 집단에서 전기장 전위, 스파이크 및 종방향 네트워크 역학을 캡처하는 방법 역할을 합니다. 그러나 장기 녹음을 위해 전극에 접합체를 부착하는 것은 크기가 크고 전극과의 접촉 표면적이 제한되어 있기 때문에 어려울 수 있습니다. 여기에서는 2개월 동안 전기생리학적 활성을 기록하기 위해 MEA 플레이트에 어셈블로이드를 도금하는 방법을 보여줍니다. 현재 프로토콜은 인간 대뇌 피질 오가노이드를 활용하지만, 다른 뇌 영역을 모델링하기 위해 분화된 오가노이드에 광범위하게 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 신경 네트워크의 발달을 연구하기 위한 강력하고 종단적인 전기생리학적 분석을 확립하며, 이 플랫폼은 뇌전증 치료 개발을 위한 약물 스크리닝에 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서문

인간 만능줄기세포(hPSC) 유래 뇌 오가노이드는 in vivo에서 조직 구조와 발달 궤적을 반영하는 공간적으로 자체 조직화된 3D 구조입니다. 전구세포(신경상피세포, 요사상아교세포, 신경세포전구세포, 신경교세포), 신경세포(피질유사흥분성 뉴런 및 억제성 중간뉴런), 신경세포(성상교세포 및 희소돌기아교^세포)를 포함한 여러 세포 유형으로 구성됩니다^1,2. 집합체는 차세대 뇌 오가노이드를 대표하며, 3D 배양 내에서 여러 뇌 영역 및/또는 세포 계통을 통합할 수 있습니다. 생체 내 뇌 영역과 유사한 다양한 뇌 영역 간의 연결을 모델링하고, 뉴런과 성상교세포 간의 상호 작용을 캡처하여 성숙하고 복잡한 신경망을 더 잘 모방하고, 신경 회로의 조립을 연구하는 데 유용한 도구를 제공합니다. 따라서 아셈블로이드는 간질 병태생리학의 특징을 요약하는 데 널리 사용되는 도구가 되고 있으며, 질병의 원인에 있을 수 있는 비정상적인 신경망을 조사하기 위해 기능적 조치가 필요합니다 3,4,5,6.....

프로토콜

아래에 제시된 모든 실험 절차는 University of Michigan Medical School Institutional Review Board 및 Human Pluripotent Stem Cell Research Oversight Committee의 윤리 지침에 따라 수행되었습니다. 이 프로토콜과 대표 실험에 사용된 iPSC 라인은 상업적 출처에서 얻은 인간 포피 섬유아세포에서 파생되었습니다. 이 연구에 사용된 세포주, 시약 및 장비의 세부 사항은 재료 표에 나열되어 있습니다.

1. iPSC에서 운명 특이적 뇌 오가노이드 유도

참고: 이 프로토콜에는 6웰 플레이트의 5개 합류(~85%) 웰에서 마이크로웰 배양 플레이트에 3개의 웰을 준비하기 위한 정보가 포함되어 있습니다. iPSC 유지 프로토콜은 세포주에 따라 다릅니다.

1. 표 1에 상세히 기술된 조성물을 사용하여 개별 세포 배양 배지를 준비한다. 최대 2주 동안 4 °C에서 빛으로부터 보호하여 보관하십시오.
2. 마이크로웰 배양 플레이트에 사용할 모든 웰을 1....

결과

인간 배쪽-복부 아셈블로이드는 6-웰 MEA 플레이트(분화당 n = 6, 3개의 분화)에 도말되었으며, 각 웰에는 64개의 전극이 포함되었습니다(그림 2A). 종방향 기록을 위해 계획된 10개의 아셈블로이드 중 9개는 시험관 내에서 50일 이상 전극에 단단히 부착되었습니다(그림 2D). 약리학적 분석을 위해 지정?.......

토론

iPSC 유래 아셈블로이드에서 네트워크 활동의 전기생리학적 기록을 위한 MEA 기반 방법은 간질의 시험관 내 모델링에 사용되어^{왔다 22,23}. 흥분성 및 억제성 시냅스 연결을 통합하는 이 제안된 플랫폼은 신경 세포 과흥분성의 메커니즘과 간질 형성 과정에서 대뇌 피질 인터뉴런의 역할을 해결할 수 있는 잠재력을 가지고 있.......

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench