Una piattaforma di array multi-elettrodo per la modellazione dell'epilessia utilizzando assembloidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane

Riepilogo

Questo protocollo mira a placcare stabilmente assembloidi fusi dorsale-ventrale su array multi-elettrodi per modellare l'epilessia in vitro.

Abstract

Gli organoidi cerebrali umani sono strutture tridimensionali (3D) derivate da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) che ricapitolano aspetti dello sviluppo cerebrale fetale. La fusione in vitro di organoidi cerebrali dorsali e ventrali specificati a livello regionale genera assembloidi, che hanno microcircuiti funzionalmente integrati con neuroni eccitatori e inibitori. A causa della loro complessità strutturale e della diversa popolazione di neuroni, gli assembloidi sono diventati un utile strumento in vitro per studiare l'attività aberrante della rete. Le registrazioni MEA (Multi-Electrode Array) servono come metodo per catturare i potenziali del campo elettrico, i picchi e la dinamica della rete longitudinale da una popolazione di neuroni senza compromettere l'integrità della membrana cellulare. Tuttavia, l'adesione degli assembloidi agli elettrodi per registrazioni a lungo termine può essere difficile a causa delle loro grandi dimensioni e della limitata superficie di contatto con gli elettrodi. Qui, dimostriamo un metodo per placcare gli assembloidi su piastre MEA per registrare l'attività elettrofisiologica in un arco di 2 mesi. Sebbene l'attuale protocollo utilizzi organoidi corticali umani, può essere ampiamente adattato agli organoidi differenziati per modellare altre regioni del cervello. Questo protocollo stabilisce un robusto test elettrofisiologico longitudinale per lo studio dello sviluppo di una rete neuronale e questa piattaforma ha il potenziale per essere utilizzata nello screening farmacologico per lo sviluppo terapeutico nell'epilessia.

Introduzione

Gli organoidi cerebrali derivati da cellule staminali pluripotenti umane (hPSC) sono strutture 3D spazialmente auto-organizzate che rispecchiano l'architettura dei tessuti e le traiettorie di sviluppo in vivo. Sono composti da più tipi di cellule, tra cui progenitori (cellule neuroepiteliali, glia radiale, progenitori neuronali, progenitori gliali), neuroni (neuroni eccitatori corticali e interneuroni inibitori) e cellule gliali (astrociti e oligodendrociti)^1,2. Gli assembloidi rappresentano la prossima generazione di organoidi cerebrali, in grado di integrare più regioni cerebrali e/o linee cellulari all'interno di una coltura 3D. Forniscono uno strumento utile per modellare le connessioni tra varie regioni del cervello che assomigliano alle controparti in vivo, catturando le interazioni tra neuroni e astrociti per imitare meglio le reti neurali mature e complesse e per studiare l'assemblaggio dei circuiti neurali. Pertanto, gli assembloidi stanno diventando uno strumento ampiamente utilizzato per ricapitolare i segni distintivi della fisiopatologia dell'epilessia, in cui sono necessarie misure funzionali per interrogare le reti neurali aberranti che possono essere alla base della causa della malattia 3,4,5,6.

Per modellare le interazioni tra i neuroni glutammatergici corticali e gli interneuroni GABAergici, diversi gruppi hanno sviluppato organoidi separati simili al cervello dorsale e ventrale e poi li hanno fusi insieme in un assembloide multi-regione 7,8,9,10. Qui, è stato applicato un protocollo di coltura assembloide precedentemente descritto con sottotipi neurali specifici a livello regionale⁹. Tuttavia, un ostacolo significativo è la mancanza di saggi funzionali riproducibili per monitorare l'attività della rete neurale durante il neurosviluppo. Molti test funzionali delle reti negli organoidi producono risultati che hanno un'elevata variabilità tra lotti di differenziazioni e linee cellulari. Le tecniche che comportano l'affettatura o la dissociazione degli organoidi alterano le loro reti intrinseche recidendo la connettività sinaptica⁸.

Gli array multi-elettrodo (MEA) forniscono una visione su larga scala dell'attività della rete nel tempo con un'elevata risoluzione temporale per caratterizzare le proprietà elettrofisiologiche degli organoidi senza alterare le condizioni di coltura o l'integrità della membrana cellulare¹¹. Rispetto all'elettrofisiologia patch clamp, la MEA consente l'acquisizione di dati ad alto rendimento basata su grandi popolazioni di neuroni piuttosto che su singole cellule. Le piattaforme MEA variano nella densità degli elettrodi, soddisfacendo le diverse esigenze nella ricerca sugli organoidi cerebrali¹². I sistemi ampiamente utilizzati, come mostrato in questo protocollo, registrano da 8 a 64 elettrodi per pozzetto 13,14,15. I MEA ad alta densità con un massimo di 26.400 elettrodi per pozzetto consentono una maggiore risoluzione spaziale e temporale, la quantificazione della velocità di propagazione del potenziale d'azione e la combinazione con la stimolazione optogenetica 14,16,17. Pertanto, la MEA funge da potente strumento per modellare l'epilessia in vitro e da paradigma traslazionale per lo screening dei farmaci antiepilettici.

Una delle sfide principali consiste nel stabilizzare gli assembloidi di grandi dimensioni su una superficie metallica idrofobica per registrazioni a lungo termine. Questo protocollo delinea una metodologia dettagliata per la placcatura di assembloidi intatti su piastre MEA per la registrazione longitudinale a lungo termine insieme a saggi farmacologici. I vantaggi unici del protocollo includono l'adesione stabile degli assembloidi alla superficie dell'elettrodo senza perdere l'attività elettrica, l'uso di terreni basali neurofisiologici disponibili in commercio per accelerare la maturazione della rete funzionale dopo la piastra, la fattibilità di condurre saggi funzionali a valle come il trattamento farmacologico e l'ampia applicazione agli organoidi generati con altri protocolli specifici per regione.

L'obiettivo è quello di fornire un test funzionale con un'elevata risoluzione temporale per studiare l'attività della rete, esaminare i cambiamenti specifici della malattia e testare farmaci con potenziale terapeutico nell'epilessia. Vengono fornite istruzioni video per le fasi più impegnative di questo protocollo, che mostrano le tecniche per la placcatura degli assembloidi su piastre MEA, nonché registrazioni rappresentative di queste colture.

Protocollo

Tutte le procedure sperimentali dimostrate di seguito sono state condotte in conformità con le linee guida etiche del Comitato di revisione istituzionale della University of Michigan Medical School e del Comitato di supervisione della ricerca sulle cellule staminali pluripotenti umane. Le linee iPSC utilizzate in questo protocollo e gli esperimenti rappresentativi sono stati derivati da fibroblasti del prepuzio umano ottenuti da una fonte commerciale. I dettagli delle linee cellulari, dei reagenti e delle apparecchiature utilizzate in questo studio sono elencati nella Tabella dei materiali.

1. Derivazione di organoidi cerebrali fate-specifici da iPSCs

NOTA: Questo protocollo contiene informazioni per la preparazione di 3 pozzetti nella piastra di coltura a micropozzetti da 5 pozzetti confluenti (~85%) di una piastra a 6 pozzetti. Il protocollo di manutenzione dell'iPSC varia a seconda delle linee cellulari.

1. Preparare i singoli terreni di coltura cellulare utilizzando la composizione descritta nella Tabella 1. Conservare al riparo dalla luce a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
2. Sciacquare una volta tutti i pozzetti da utilizzare nella piastra di coltura per micropozzetti con 1 mL di DMEM/F-12. Aggiungere 1 mL/pozzetto di mTeSR plus + 50 μM di Y-27632 e ruotare la piastra a 2000 x g per 5 minuti a temperatura ambiente per rimuovere le bolle d'aria dai micropozzetti. Conservare la piastra in un incubatore a 37 °C 5% CO₂ .
3. Pulire le regioni di iPSC differenziate con una punta di pipetta P10 sterile al microscopio in un banco pulito a flusso laminare. Lavare via i detriti cellulari dal monostrato con 1 mL/pozzetto di PBS senza calcio o magnesio.
4. Dissociare il monostrato in singole cellule aggiungendo 1 mL/pozzetto di reagente di dissociazione cellulare preriscaldato e posizionando la piastra in un incubatore a 37 °C al 5% di CO₂ per 4-7 minuti (a seconda delle caratteristiche e della confluenza delle linee cellulari) fino al distacco della maggior parte delle cellule, con una leggera agitazione ogni 2-3 minuti.
5. Aggiungere 4 mL di DMEM/F-12 a ciascun pozzetto per diluire il reagente di dissociazione cellulare e triturare moderatamente con una pipetta sierologica da 10 mL. Raccogliere la sospensione cellulare da tutti i pozzetti della stessa linea in una provetta conica da 50 mL.
6. Centrifugare a 200 x g per 4 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante utilizzando una pipetta sierologica da 10 mL e risospendere le cellule in 2 mL di mTeSR più + 50 μM di Y-27632. Estrarre 10 μL di sospensione cellulare, miscelare 1:1 (v/v) con blu di tripano e contare le cellule con un contatore di cellule automatizzato.
7. Piastra 3 x 10⁶ cellule vive per pozzetto, 3 pozzetti per linea. Aggiungere ulteriore mTeSR plus + 50 μM di Y-27632 secondo necessità per portare il volume totale a 2 mL/pozzetto. Girare il piatto a 100 x g per 3 minuti a temperatura ambiente e rimetterlo nell'incubatrice.
   NOTA: La piastra di coltura per micropozzetti utilizzata qui contiene 300 micropozzetti per pozzetto, quindi la placcatura di 3 x 10⁶ celle produce 10.000 cellule/micropozzetto.
8. Il giorno successivo, eseguire una sostituzione del terreno a mezzo volume rimuovendo delicatamente 1 mL di terreno e aggiungendo lentamente 1 mL di mTeSR più terreno (senza Y-27632) con un puntale per pipetta P1000. Tenere la punta vicino alla superficie del terreno e aspirare il più lentamente possibile, in modo da non disturbare le cellule aggreganti nella parte inferiore.
9. Controllando al microscopio invertito un giorno dopo il cambio del supporto, si può vedere un chiaro contorno di ciascun aggregato. Rimuovere il terreno originale da ciascun pozzetto con i puntali per pipette P1000.
10. Spruzzare moderatamente 0,5 mL di terreno di induzione neurale (NIM) con dorsomorfina (DM) e SB-4321542 (SB) in ciascun pozzetto con puntali P1000 sterili e tagliati. Immediatamente, pipettare delicatamente gli aggregati sospesi in un terreno di coltura e trasferirli in una piastra di coltura sterile in sospensione da 10 cm. Ripetere l'operazione fino a quando tutti gli aggregati non sono stati trasferiti. NON triturare.
11. Aggiungere ulteriore NIM + SB/DM secondo necessità per portare il volume totale a 10 mL/piatto. Porre la capsula su un agitatore orbitale in un incubatore a 37 °C al 5% di CO₂ per evitare la fusione spontanea degli aggregati. Contrassegnare la data di trasferimento come Giorno 0 della coltura di organoidi.
12. Dal giorno 1 alla fine, seguire la ricetta multimediale nella Tabella 1 e la sequenza temporale di modifica dei media⁹ nella Figura 1. In particolare, gli organoidi sono divisi in due piastre di coltura in sospensione designate come "dorsale" e "ventrale" il giorno 4.
    NOTA: Diversi punti temporali chiave da tenere a mente: l'espansione degli organoidi inizia il giorno 6, quando il terreno viene passato al mezzo di differenziazione neurale (NDM) con EGF/FGF. La differenziazione neuronale è supportata a partire dal giorno 25 da NDM + BDNF/NT3 e gli organoidi vengono mantenuti in NDM senza fattori di crescita a partire dal giorno 46.

2. Marcatura virale e generazione di assembloidi

NOTA: La marcatura virale ^7,9 è raccomandata per riconoscere l'identità di ciascun organoide specifico della regione in un assembloide e assegnare l'attività elettrofisiologica da elettrodi specifici alle regioni assembloidi. È ottimale se viene impiattato un solo organoide per ogni pozzetto MEA. Questo protocollo può essere applicato anche alla placcatura di singoli organoidi.

1. Calcolare i volumi di stock di virus e i terreni di diluizione da utilizzare: sono necessari 200 μL di terreno con virus per ogni organoide da etichettare. Gli organoidi dorsali sono marcati con pAAV1-CAG-tdTomato, tipicamente con un rapporto di diluizione di 1:1000 (v/v), o circa 2 x 10¹⁰ vg/mL. Per gli organoidi ventrali, viene utilizzato il virus pAAV1-mDLX-GFP 1:300 (v/v) o 2 x^{10 11} vg/mL.
   NOTA: Le diluizioni devono essere titolate all'effetto desiderato e sono influenzate dal titolo virale.
2. Riscaldare la quantità appropriata di fluido a 37 °C. Scongelare le scorte di virus conservate a -80 °C su ghiaccio. Etichettare un numero sufficiente di piastre a 48 pozzetti per ospitare tutti gli organoidi etichettati.
3. Metti un bicchiere contenente il 10% di candeggina nel cappuccio. Espellere tutti i materiali a contatto con i virus nel becher. Diluire i virus completamente scongelati in terreni di coltura in provette coniche separate da 15 mL, etichettate come "dorsale" e "ventrale".
4. Spostare gli organoidi del giorno 56 dalle piastre di coltura alle piastre da 48 pozzetti. Si raccomanda un organoide per pozzetto per evitare la fusione spontanea in coltura statica. Rimuovere il più possibile il maggior numero possibile di terreni di coltura residui.
5. Aggiungere rispettivamente 200 μl di miscela virus-terreno in ciascun pozzetto. Rimettere le piastre nell'incubatore a 37 °C 5% CO₂ . Inclinare le piastre su una piastra sterile vuota per concentrare le particelle virali sul fondo del pozzetto e ottimizzare l'efficienza di trasduzione.
   NOTA: Le particelle virali tendono ad affondare sul fondo della provetta conica da 15 mL, quindi capovolgere frequentemente la provetta per mescolare i virus con i terreni prima di aggiungerli a ciascun pozzetto è molto importante per garantire un'efficienza di trasduzione uniforme per tutti gli organoidi.
6. Il giorno successivo (giorno 57), aggiungere altri 800 μL di terreno di coltura a ciascun pozzetto per portare il volume totale a 1 mL/pozzetto.
7. Tre giorni dopo (giorno 60), eseguire un cambio completo del terreno sugli organoidi etichettati. Candeggiare tutti i materiali a contatto con particelle virali.
8. Tre giorni dopo (giorno 63), controllare l'espressione della fluorescenza al microscopio invertito a epifluorescenza. Se il segnale è forte, iniziare a generare assembloidi (vedere il passaggio 2.9).
9. Sciacquare due volte tutti gli organoidi marcati con 1 mL/pozzetto di PBS per evitare la contaminazione incrociata da parte delle particelle virali residue durante la fusione degli organoidi. Utilizzare un puntale per pipetta P1000 tagliato per trasferire un organoide ventrale in ciascun pozzetto dorsale (o viceversa) e rietichettare la piastra assembloide di conseguenza. Inclinare le piastre come al punto 2.5 per una migliore fusione.
10. Eseguire con cautela un cambio del mezzo di volume 3 giorni dopo la procedura di fusione (giorno 66) senza interrompere gli assembloidi. Di solito ci vuole circa una settimana per formare assembloidi stabili (giorno 70).

3. Posizionamento di assembloidi su piastre MEA pretrattate

NOTA: Sono necessari almeno 4 giorni per completare le procedure di preparazione della superficie delle lastre MEA prima di placcare gli assembloidi. Per risparmiare tempo, la fusione degli organoidi dorsali e ventrali (passaggio 2.9) e il pretrattamento MEA possono essere eseguiti in parallelo.

1. Preparare i reagenti per il pretrattamento superficiale e il rivestimento.
   1. Per preparare una soluzione detergente/enzimatica all'1%, sciogliere 0,5 g di enzima/detersivo in polvere in 50 ml di acqua deionizzata. Agitare accuratamente fino a quando la polvere non è completamente sciolta. Sterilizzare la soluzione con un filtro sterile per vuoto nella cabina di biosicurezza prima di aggiungerla ai pozzetti MEA. Preparare fresco prima di ogni utilizzo.
      NOTA: Il detergente/enzima sterilizza la superficie MEA, rimuove eventuali oli residui dal processo di produzione MEA e garantisce che la superficie sia sufficientemente idrofila da promuovere le interazioni con il composto idrofilo polietilenimmina (PEI)¹⁸.
   2. Per preparare una soluzione di PEI allo 0,07%¹⁹, iniziare con la preparazione di una soluzione stock di PEI al 7% mescolando 1 mL di soluzione di PEI al 50% in una provetta conica da 15 mL con 6 mL di tampone borato 1x. Diluire 1 mL di soluzione madre di PEI al 7% in 99 mL di tampone borato 1x per ottenere la concentrazione di lavoro finale. Per la sterilizzazione, filtrare attraverso un'unità filtrante da 0,22 μm nella cabina di biosicurezza prima dell'uso.
      NOTA: Il PEI, un polimero caricato positivamente, viene utilizzato nel processo di rivestimento primario per facilitare l'adesione di un rivestimento secondario caricato negativamente con la matrice della membrana basale (BMM) e gli assembloidi²⁰. Prelevare 1 mL di PEI al 50% versandolo invece di pipettarlo nella provetta conica, poiché la soluzione madre è molto viscosa. La quantità necessaria può essere misurata più facilmente pesandola in una provetta conica e la soluzione di PEI al 50% ha una densità di 1,08 g/mL. La soluzione madre di PEI al 7% può essere conservata in aliquote da 1 mL a -20 °C per un massimo di un mese. Eseguire tutti i passaggi successivi nella cabina di biosicurezza.
2. In considerazione delle dimensioni di ciascun assembloide, vengono utilizzate piastre MEA a 6 pozzetti con 64 elettrodi per pozzetto per ospitare un assembloide per pozzetto. Calcolare il numero di piastre MEA necessarie per gli esperimenti per garantire un numero sufficiente di repliche biologiche.
3. Aggiungere 1 mL di soluzione detergente/enzimatica all'1% in ciascun pozzetto di una piastra MEA sterile. Fare attenzione a non danneggiare gli elettrodi con la punta della pipetta. Se si utilizza un aspiratore a vuoto per i lavaggi, evitare che la punta tocchi l'array di elettrodi. Incubare in un'incubatrice a 37 °C per 2 ore.
4. Rimuovere il detersivo/enzima e lavare ogni pozzetto cinque volte con 1,5 ml di acqua deionizzata sterile. Poiché il detergente/enzima non è biocompatibile, è importante assicurarsi che le sostanze chimiche rimanenti vengano completamente lavate via.
5. Riempire ogni pozzetto con 1 mL di terreno di coltura per il precondizionamento. Rimettere le piastre a 37 °C 5% CO₂ incubatore per 2 giorni. L'esposizione della superficie MEA alle condizioni di coltura cellulare favorisce l'adesione cellulare.
6. Rimuovere il terreno di coltura e coprire gli elettrodi MEA in ciascun pozzetto con 50 μl di soluzione di PEI allo 0,07% per il rivestimento primario. Incubare a 37 °C per 1 ora.
7. Aspirare completamente la soluzione di PEI. Lavare ogni pozzetto con 1 ml di acqua deionizzata sterile. Eseguire 3 lavaggi rapidi in totale. Asciugare le piastre a temperatura ambiente per 15 minuti nella camera di biosicurezza senza coperchio.
8. Coprire l'area dell'elettrodo in ciascun pozzetto con 50 μl di BMM 1:20 (v/v) diluito in terreno di coltura per il rivestimento secondario. Rimettere le piastre MEA nell'incubatore a 37 °C per una notte. Aggiungere acqua sterile negli scomparti che circondano i pozzetti per garantire un'umidità sufficiente durante tutto il corso del rivestimento.
9. Il giorno successivo, aspirare il BMM diluito con il vuoto, lasciando uno strato sottile sulla superficie. Se si è formato uno strato spesso, spruzzare con forza l'area di contatto dell'elettrodo con il terreno di coltura utilizzando un puntale per pipetta P1000. Lavare tutte le volte necessarie per eliminare eventuali pezzi spessi.
   NOTA: Il BMM denso residuo può interferire con il contatto dell'elettrodo con le celle.
10. Raccogliere un assembloide con una punta P1000 ampiamente tagliata e posizionarlo sopra gli elettrodi in un pozzetto, trasferendo il minor numero possibile di terreno.
11. In una cappa a flusso laminare sotto un endoscopio di dissezione, spingere con cautela l'assembloide con un ago di dissezione sterile o una punta P20 nella posizione desiderata, dove sia gli organoidi dorsali che quelli ventrali possono essere per lo più coperti da elettrodi. Utilizzare una punta P20 per rimuovere il liquido attorno all'assembloide. Ripeti l'operazione per tutti gli assembloidi o per un sottoinsieme, operazione che può essere eseguita in pochi minuti.
    NOTA: Cercare di NON toccare o graffiare la superficie MEA con la punta della pipetta e/o l'ago. Cerca di NON colpire o strappare l'assembloide con i puntali delle pipette. Terminare la placcatura il più rapidamente possibile per evitare che l'organoide si secchi completamente.
12. Incubare gli assembloidi a 37 °C per 10 minuti (senza terreno). Trasferire le piastre dall'incubatore a una cappa a flusso laminare e applicare 2-3 piccole gocce di BMM 1:50 diluite in terreno di coltura sopra gli assembloidi in un endoscopio di dissezione. Incubare a 37 °C per altri 30 minuti.
13. Aggiungere con cautela 3 gocce di terreno di coltura vicino agli assembloidi sotto un cannocchiale di dissezione. Questo mantiene gli organoidi idratati. Incubare a 37 °C per 1 ora.
    NOTA: Se l'assembloide si muove o galleggia in qualsiasi passaggio successivo, la placcatura deve essere riavviata dal passaggio 3.11.
14. Ogni ora, aggiungere con cura 20-50 μL di terreno di coltura cellulare a ciascun pozzetto sotto un endoscopio di dissezione. Questo può essere fatto nel corso di una giornata. L'obiettivo è raggiungere almeno 250 μL di volume totale alla fine della giornata.
15. Il giorno successivo, controllare se tutti gli assembloidi si sono stabilizzati e stabilizzati sotto l'ambito di dissezione. Aggiungere altri 750 μL di terreno di coltura per raggiungere un volume totale di 1 mL/pozzetto. Lasciare le piastre indisturbate per almeno 2 giorni.
16. Eseguire con attenzione i cambi di terreno settimanali prelevando 500 μL di terreno di coltura e aggiungendo 700 μL di terreno basale neurofisiologico. Il volume aggiuntivo di terreno aggiunto tiene conto dell'evaporazione e può essere regolato in base alla quantità di evaporazione della piastra MEA utilizzata. Aggiungere acqua sterile intorno ai pozzetti, se necessario, per ridurre al minimo l'evaporazione dai pozzi MEA.

4. Registrazione MEA e analisi dei dati

1. Iniziare la registrazione MEA circa una settimana dopo il passaggio ai mezzi basali neurofisiologici (di solito intorno al giorno 78).
2. Attendere che la camera di registrazione raggiunga la temperatura impostata (di solito 37 °C). Trasferire una piastra sul dispositivo e lasciarla equilibrare per almeno 5 minuti prima della registrazione.
3. Impostazioni hardware in tempo reale
   1. Impostare la frequenza di campionamento, ovvero la velocità con cui vengono registrati i dati di tensione grezza. Si consiglia l'impostazione predefinita (12,5 kHz).
   2. Specificare la modalità analogica (in genere Neural Spikes, come in questo caso) per configurare la larghezza di banda e il guadagno dell'hardware per applicazioni specifiche. Per il monitoraggio visivo dell'attività durante la registrazione, utilizzare i moduli Spike Detector e Burst Detector .
      NOTA: Le impostazioni analogiche influiscono sul modo in cui vengono registrati i dati di tensione grezza e non possono essere modificate dopo la registrazione dei dati.
   3. (Facoltativo) Applicare un filtro digitale hardware ai dati di registrazione. Le opzioni di filtro passa-basso includono una finestra Kaiser a 2 kHz o 3 kHz. Le impostazioni predefinite possono essere modificate dopo aver selezionato le impostazioni analogiche.
   4. Impostare il riferimento in base alla mediana (impostazione predefinita), che è altamente consigliato per la registrazione neurale, come in questo caso. Il riferimento migliora la qualità dei segnali a bassa ampiezza riducendo l'interferenza di rumore comune ai gruppi di canali.
      NOTA: I parametri di cui sopra possono essere regolati secondo necessità a seconda dell'attività osservata negli assembloidi, ma devono essere mantenuti coerenti per tutte le registrazioni in un determinato esperimento.
4. Aggiungere mappe e descrizioni delle placche (se necessario). Importare la mappa della lastra dalla registrazione precedente per la stessa lastra per garantire la coerenza e facilitare l'elaborazione dei dati in batch. Assicurati che i file abbiano un nome corretto.
5. Se i segnali sono buoni (rumore e artefatti minimi), registrare i dati grezzi. Generalmente 2-5 minuti di registrazione sono sufficienti per un campione rappresentativo.
6. Registrare longitudinalmente l'attività elettrica una o due volte alla settimana, per 5-15 minuti, a seconda del disegno sperimentale. Attendere almeno 24 ore dopo ogni cambio di supporto prima di iniziare il ciclo di registrazione successivo, poiché l'attività elettrica diminuisce immediatamente dopo ogni cambio di supporto.
7. (Facoltativo) Se l'attività elettrica deve essere localizzata e distinta tra organoidi dorsali e ventrali, o se l'attività di ciascun elettrodo deve essere analizzata separatamente, ottenere un'immagine di ciascun assembloide in campo chiaro ed epifluorescenza (Figura 2B) dopo ogni registrazione.
8. Quando si analizzano i dati, applicare una configurazione di analisi, che includa un rilevatore di picchi/burst e un compilatore di statistiche. Utilizzare una soglia adattiva impostata su 5,5-6 deviazioni standard dal basale per il rilevamento dei picchi. Identifica i burst come attività con picchi di ≥5 in 100 ms¹³. Definisci l'attività di rete quando oltre il 25% del totale degli elettrodi attivi si accende entro 100 ms con un minimo di 50 picchi per burst di rete^13,14.
   NOTA: Questi parametri sono modulati in base alle caratteristiche di cottura di uno specifico esperimento. Per aumentare la sensibilità per i picchi di bassa ampiezza, la soglia adattiva per il rilevamento dei picchi può essere abbassata. Per il rilevamento dei burst, è possibile utilizzare vari metodi e i parametri possono essere adattati per rilevare picchi di picchi che differiscono in modo significativo dall'attività di fondo. I parametri dell'attività della rete possono essere modulati a una percentuale inferiore di elettrodi, soprattutto quando gli assembloidi non coprono l'intero campo degli elettrodi. Tutti i parametri devono rimanere coerenti per tutta la durata di un esperimento per consentire confronti longitudinali.
9. Eseguire il modulo Statistics Compiler per l'elaborazione batch durante la riproduzione dei dati registrati. Esporta metriche avanzate e/o file di output spike per analisi avanzate.
   NOTA: L'output delle metriche avanzate contiene .csv file con le medie degli elettrodi, dei pozzetti e dei gruppi per l'attivazione media, lo scoppio e la sincronia. L'output dei picchi (file .spk) include tracce di forme d'onda per tutti i picchi, che possono essere importate su altre piattaforme per l'analisi avanzata, ad esempio l'ordinamento dei picchi.

5. Saggio farmacologico end-point e riciclo su piastra

NOTA: I saggi di trattamento farmacologico possono essere eseguiti dopo che gli assembloidi sono sufficientemente maturi e l'attività elettrica raggiunge i picchi. La registrazione dell'attività basale/pre-trattamento e dell'attività post-trattamento deve essere effettuata lo stesso giorno.

1. Aggiungere 1-10 μL di soluzione farmacologica proprio sopra l'assembloide e agitare delicatamente la piastra per garantire una miscela uniforme. In alcuni casi si raccomanda un tempo di incubazione più lungo in terreni contenenti farmaci, ad esempio saggi di trattamento farmacologico correlati alle sinapsi con agonisti/antagonisti del recettore glutammato/GABA (Figura 2E) (vedere la sezione Risultati per i dettagli).
   NOTA: Si consiglia di aggiungere una piccola quantità di soluzione farmacologica a ciascun pozzetto per ottenere una concentrazione di lavoro finale poiché una grande variazione di volume ridurrà temporaneamente l'attività elettrica in generale. È importante assicurarsi che l'aggiunta di un veicolo in cui sono disciolti i farmaci di interesse non provochi cambiamenti significativi nei parametri elettrofisiologici.
2. Eseguire un numero sufficiente di lavaggi PBS (in genere 3) e lavare via i farmaci dopo la registrazione post-trattamento. Effettuare un'ulteriore registrazione il giorno successivo al wash-out del farmaco per vedere se l'attività elettrica ritorna al livello basale.
3. Facoltativamente, pipettare con forza i terreni per separare gli assembloidi dalla piastra MEA alla fine delle registrazioni per eseguire ulteriori esperimenti, ad esempio imaging dal vivo, fissazione con paraformaldeide al 4% per l'immunocolorazione a montaggio intero o lisi per l'estrazione di RNA o proteine.
4. Ai fini dell'analisi, utilizzare almeno tre repliche tecniche e biologiche per ciascuna condizione. Esprimere i dati elettrofisiologici come media di n ≥ 3 repliche.
5. Per riciclare la lastra al termine degli esperimenti, aspirare il terreno rimanente dopo aver rimosso gli assembloidi attaccati. Lavare una volta con PBS sterile. Coprire completamente l'area metallica con 200 μL/pozzetto di tripsina-EDTA allo 0,25% e rimettere la piastra in un incubatore a 37 °C per una notte.
6. Il giorno successivo, aspirare la tripsina, lavare due volte con etanolo sterile al 70% e tre volte con acqua deionizzata sterile.
7. Asciugare la piastra nella camera di biosicurezza all'aria per 15 minuti senza il coperchio o fino a quando non è completamente asciutta. Sigillare la piastra pulita in un sacchetto di plastica e conservarla a temperatura ambiente fino al futuro utilizzo.
   NOTA: Una lastra MEA ben pulita può essere riutilizzata tre volte senza compromettere in modo significativo la qualità della registrazione.

Risultati

Gli assembloidi dorsali-ventrali umani sono stati placcati su una piastra MEA a 6 pozzetti (n = 6 per differenziazione, 3 differenziazioni), con ogni pozzetto contenente 64 elettrodi (Figura 2A). Nove degli assembloidi su dieci previsti per la registrazione longitudinale sono stati saldamente attaccati agli elettrodi per oltre 50 giorni in vitro (Figura 2D). 6 degli 8 assembloidi designa...

Discussione

Metodi basati su MEA per registrazioni elettrofisiologiche dell'attività di rete in assembloidi derivati da iPSC sono stati utilizzati per la modellazione in vitro dell'epilessia^22,23. Questa piattaforma proposta che integra connessioni sinaptiche eccitatorie e inibitorie ha il potenziale per affrontare i meccanismi di ipereccitabilità neuronale e il ruolo degli interneuroni corticali nel processo di epilettogenesi. In...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench