ヒト多能性幹細胞由来脳アッセンブロイドを用いたてんかんモデリングのための多電極アレイプラットフォーム

要約

このプロトコルは、 in vitroでてんかんをモデル化するための多電極アレイ上の背腹融合アッサンブロイドを安定してプレートすることを目的としています。

要約

ヒト脳オルガノイドは、ヒト多能性幹細胞(hPSC)に由来する三次元(3D)構造で、胎児の脳の発達の側面を再現しています。 in vitro で背側と腹側領域に特異的な脳オルガノイドを融合させると、興奮性ニューロンと抑制性ニューロンと機能的に統合されたマイクロ回路を持つアセンブロイドが生成されます。アッセンブロイドは、その構造の複雑さと多様なニューロン集団により、異常なネットワーク活動を研究するための有用な in vitro ツールとなっています。マルチ電極アレイ(MEA)記録は、細胞膜の完全性を損なうことなく、ニューロン集団からの電場電位、スパイク、および縦方向のネットワークダイナミクスを捕捉する方法として機能します。しかし、長期間の記録のためにアッセンブロイドを電極に接着することは、サイズが大きく、電極との接触表面積が限られているため、困難な場合があります。ここでは、2ヶ月間にわたる電気生理学的活動を記録するために、MEAプレート上にアッサンブロイドをプレート化する方法を示します。現在のプロトコルはヒト皮質オルガノイドを利用していますが、他の脳領域をモデル化するために分化したオルガノイドに広く適応させることができます。このプロトコルは、ニューロンネットワークの発達を研究するための堅牢で縦断的な電気生理学的アッセイを確立し、このプラットフォームはてんかんの治療開発のための薬物スクリーニングに使用される可能性を秘めています。

概要

ヒト多能性幹細胞(hPSC)由来の脳オルガノイドは、生体内の組織構造と発生過程を反映した空間的に自己組織化された3D構造です。それらは、前駆細胞(神経上皮細胞、放射状グリア、ニューロン前駆細胞、グリア前駆細胞)、ニューロン(皮質様興奮性ニューロンおよび抑制性介在ニューロン)、およびグリア細胞(アストロサイトおよびオリゴデンドロサイト)^1,2を含む複数の細胞タイプで構成されています。アッセンブロイドは、3D培養内で複数の脳領域や細胞系統を統合することができる次世代の脳オルガノイドです。これらは、in vivoの対応する領域に似たさまざまな脳領域間の接続をモデル化し、ニューロンとアストロサイト間の相互作用を捕捉して成熟した複雑な神経ネットワークをよりよく模倣し、神経回路の組み立てを研究するための有用なツールを提供します。したがって、アッセンブロイドは、てんかんの病態生理学の特徴を再現するために広く使用されているツールになりつつあり、疾患の原因の根底にある可能性のある異常な神経ネットワークを調査するために機能的な手段が必要です3,4,5,6。

プロトコル

以下に示すすべての実験手順は、ミシガン大学医学部の治験審査委員会およびヒト多能性幹細胞研究監視委員会の倫理ガイドラインに従って実施されました。このプロトコルおよび代表的な実験で使用されたiPSC系統は、市販の供給源から得られたヒト包皮線維芽細胞に由来しました。この研究で使用した細胞株、試薬、および機器の詳細は、 材料表に記載されています。

1. iPS細胞からの運命特異的脳オルガノイドの作製

注:このプロトコルには、6ウェルプレートの5つのコンフルエント(~85%)ウェルからマイクロウェル培養プレートに3つのウェルを調製するための情報が含まれています。iPSCのメンテナンスプロトコルは細胞株によって異なります。

1. 表1に詳述された組成物を用いて、個々の細胞培養培地を調製します。4°Cの光を避けて最大2週間保管してください。
2. マイクロウェル培養プレートで使用するすべてのウェルを1 mLのDMEM/F-12で1回すすぎます。1 mL/ウェルのmTeSR plus + 50 μM Y-27632を添加し、プレートを2000 x g で室温で5分間回転させ、マイクロウェルから気泡を除去します。プレートを37....

ディスカッション

iPS細胞由来アッサンブロイドにおけるネットワーク活性の電気生理学的記録のためのMEAベースの方法は、てんかんのin vitroモデリングに使用されてきました^22,23。興奮性シナプス結合と抑制性シナプス結合を統合したこの提案されたプラットフォームは、ニューロンの過興奮性のメカニズムと、てんかん発生の過程に.......

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench