Uma plataforma de matriz de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia usando conjuntos cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas

Resumo

Este protocolo visa colocar de forma estável assembleias dorsais-ventrais fundidas em matrizes de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia in vitro.

Resumo

Os organoides do cérebro humano são estruturas tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) que recapitulam aspectos do desenvolvimento do cérebro fetal. A fusão de organoides cerebrais dorsais com ventrais especificados regionalmente in vitro gera assembleides, que possuem microcircuitos funcionalmente integrados com neurônios excitatórios e inibitórios. Devido à sua complexidade estrutural e população diversificada de neurônios, os assemblóides tornaram-se uma ferramenta in vitro útil para estudar a atividade de redes aberrantes. Os registros de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) servem como um método para capturar potenciais de campo elétrico, picos e dinâmica de rede longitudinal de uma população de neurônios sem comprometer a integridade da membrana celular. No entanto, a adesão de assemblóides aos eletrodos para gravações de longo prazo pode ser um desafio devido ao seu grande tamanho e área de superfície de contato limitada com os eletrodos. Aqui, demonstramos um método para colocar assemblóides em placas MEA para registrar a atividade eletrofisiológica durante um período de 2 meses. Embora o protocolo atual utilize organoides corticais humanos, ele pode ser amplamente adaptado a organoides diferenciados para modelar outras regiões do cérebro. Este protocolo estabelece um ensaio eletrofisiológico longitudinal robusto para estudar o desenvolvimento de uma rede neuronal, e esta plataforma tem potencial para ser usada na triagem de drogas para o desenvolvimento terapêutico na epilepsia.

Introdução

Os organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) são estruturas 3D espacialmente auto-organizadas que espelham a arquitetura do tecido e as trajetórias de desenvolvimento in vivo. Eles são compostos por vários tipos de células, incluindo progenitores (células neuroepiteliais, glia radial, progenitores neuronais, progenitores gliais), neurônios (neurônios excitatórios corticais e interneurônios inibitórios) e células gliais (astrócitos e oligodendrócitos)^1,2. Os assemblóides representam a próxima geração de organoides cerebrais, capazes ....

Protocolo

Todos os procedimentos experimentais demonstrados abaixo foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan e do Comitê de Supervisão de Pesquisa com Células-Tronco Pluripotentes Humanas. As linhagens iPSC usadas neste protocolo e os experimentos representativos foram derivados de fibroblastos de prepúcio humano obtidos de uma fonte comercial. Os detalhes das linhagens celulares, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Derivação de organoides cerebr....

Discussão

Métodos baseados em MEA para registros eletrofisiológicos da atividade de rede em assembleias derivadas de iPSC têm sido usados para modelagem in vitro de epilepsia^22,23. Esta plataforma proposta integrando conexões sinápticas excitatórias e inibitórias tem o potencial de abordar mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal e o papel dos interneurônios corticais no processo de epileptogênese. Além disso, esta pla.......

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench