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Method Article
Este protocolo visa colocar de forma estável assembleias dorsais-ventrais fundidas em matrizes de múltiplos eletrodos para modelagem de epilepsia in vitro.
Os organoides do cérebro humano são estruturas tridimensionais (3D) derivadas de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) que recapitulam aspectos do desenvolvimento do cérebro fetal. A fusão de organoides cerebrais dorsais com ventrais especificados regionalmente in vitro gera assembleides, que possuem microcircuitos funcionalmente integrados com neurônios excitatórios e inibitórios. Devido à sua complexidade estrutural e população diversificada de neurônios, os assemblóides tornaram-se uma ferramenta in vitro útil para estudar a atividade de redes aberrantes. Os registros de matriz de múltiplos eletrodos (MEA) servem como um método para capturar potenciais de campo elétrico, picos e dinâmica de rede longitudinal de uma população de neurônios sem comprometer a integridade da membrana celular. No entanto, a adesão de assemblóides aos eletrodos para gravações de longo prazo pode ser um desafio devido ao seu grande tamanho e área de superfície de contato limitada com os eletrodos. Aqui, demonstramos um método para colocar assemblóides em placas MEA para registrar a atividade eletrofisiológica durante um período de 2 meses. Embora o protocolo atual utilize organoides corticais humanos, ele pode ser amplamente adaptado a organoides diferenciados para modelar outras regiões do cérebro. Este protocolo estabelece um ensaio eletrofisiológico longitudinal robusto para estudar o desenvolvimento de uma rede neuronal, e esta plataforma tem potencial para ser usada na triagem de drogas para o desenvolvimento terapêutico na epilepsia.
Os organoides cerebrais derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC) são estruturas 3D espacialmente auto-organizadas que espelham a arquitetura do tecido e as trajetórias de desenvolvimento in vivo. Eles são compostos por vários tipos de células, incluindo progenitores (células neuroepiteliais, glia radial, progenitores neuronais, progenitores gliais), neurônios (neurônios excitatórios corticais e interneurônios inibitórios) e células gliais (astrócitos e oligodendrócitos)1,2. Os assemblóides representam a próxima geração de organoides cerebrais, capazes de integrar várias regiões cerebrais e/ou linhagens celulares em uma cultura 3D. Eles fornecem uma ferramenta útil para modelar conexões entre várias regiões do cérebro semelhantes às contrapartes in vivo, capturando interações entre neurônios e astrócitos para melhor imitar redes neurais maduras e complexas e para estudar a montagem de circuitos neurais. Portanto, os assemblóides estão se tornando uma ferramenta amplamente utilizada para recapitular as características da fisiopatologia da epilepsia, na qual medidas funcionais são necessárias para interrogar redes neurais aberrantes que podem estar subjacentes à causa da doença 3,4,5,6.
Para modelar as interações entre neurônios glutamatérgicos corticais e interneurônios GABAérgicos, vários grupos desenvolveram organoides separados semelhantes ao cérebro dorsal e ventral e, em seguida, os fundiram em um assembloide multirregional 7,8,9,10. Aqui, um protocolo de cultura de assembloides descrito anteriormente com subtipos neurais regionalmente específicosfoi aplicado 9. No entanto, uma barreira significativa é a falta de ensaios funcionais reprodutíveis para monitorar a atividade da rede neural durante o neurodesenvolvimento. Muitos testes funcionais das redes em organoides produzem resultados que apresentam alta variabilidade entre lotes de diferenciações e linhagens celulares. Técnicas que envolvem fatiar ou dissociar organoides alteram suas redes inerentes cortando a conectividade sináptica8.
Os arranjos de múltiplos eletrodos (MEA) fornecem uma visão em larga escala da atividade da rede ao longo do tempo com alta resolução temporal para caracterizar as propriedades eletrofisiológicas dos organoides sem interromper as condições de cultura ou a integridade da membrana celular11. Em comparação com a eletrofisiologia do patch clamp, o MEA permite a aquisição de dados de alto rendimento com base em grandes populações de neurônios, em vez de células únicas. As plataformas MEA variam em sua densidade de eletrodos, atendendo a diferentes necessidades na pesquisa de organoides cerebrais12. Os sistemas amplamente utilizados, como mostrado neste protocolo, registram de 8 a 64 eletrodos por poço 13,14,15. MEAs de alta densidade com até 26.400 eletrodos por poço permitem maior resolução espacial e temporal, quantificação da velocidade de propagação do potencial de ação e combinação com estimulação optogenética 14,16,17. Portanto, o MEA serve como uma ferramenta poderosa para modelar a epilepsia in vitro e um paradigma translacional para a triagem de medicamentos anticonvulsivantes.
Um grande desafio é estabilizar os conjuntos de grande porte em uma superfície metálica hidrofóbica para gravações de longo prazo. Este protocolo descreve uma metodologia detalhada para plaquear assénios intactos em placas MEA para registro longitudinal de longo prazo junto com ensaios farmacológicos. As vantagens exclusivas do protocolo incluem a fixação estável de assemblóides à superfície do eletrodo sem perder a atividade elétrica, o uso de meios basais neurofisiológicos disponíveis comercialmente para acelerar a maturação da rede funcional após o plaqueamento, a viabilidade de conduzir ensaios funcionais a jusante, como tratamento medicamentoso, e ampla aplicação a organoides gerados com outros protocolos específicos da região.
O objetivo é fornecer um ensaio funcional com alta resolução temporal para investigar a atividade da rede, examinar alterações específicas da doença e testar drogas com potencial terapêutico na epilepsia. Instruções em vídeo são fornecidas para as etapas mais desafiadoras deste protocolo, mostrando as técnicas de plaqueamento de assembleias em placas MEA, bem como gravações representativas dessas culturas.
Todos os procedimentos experimentais demonstrados abaixo foram conduzidos de acordo com as diretrizes éticas do Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan e do Comitê de Supervisão de Pesquisa com Células-Tronco Pluripotentes Humanas. As linhagens iPSC usadas neste protocolo e os experimentos representativos foram derivados de fibroblastos de prepúcio humano obtidos de uma fonte comercial. Os detalhes das linhagens celulares, reagentes e equipamentos usados neste estudo estão listados na Tabela de Materiais.
1. Derivação de organoides cerebrais específicos do destino de iPSCs
NOTA: Este protocolo contém informações para preparar 3 poços na placa de cultura de micropoços a partir de 5 poços confluentes (~85%) de uma placa de 6 poços. O protocolo de manutenção do iPSC varia de acordo com as linhagens celulares.
2. Rotulagem viral e geração de assemblóides
NOTA: A marcação viral 7,9 é recomendada para reconhecer a identidade de cada organoide específico de cada região em um assembloide e atribuir atividade eletrofisiológica de eletrodos específicos a regiões assembloides. É ideal se apenas um único organoide for revestido para cada poço MEA. Este protocolo também pode ser aplicado ao revestimento de organoide único.
3. Colocação de assemblóides em placas MEA pré-tratadas
NOTA: Leva pelo menos 4 dias para concluir os procedimentos de preparação da superfície das placas MEA antes de revestir os conjuntos. Para economizar tempo, a fusão de organoides dorsais e ventrais (ou seja, etapa 2.9) e o pré-tratamento MEA podem ser realizados em paralelo.
4. Registro e análise de dados do MEA
5. Ensaio farmacológico de ponto final e reciclagem de placas
NOTA: Os ensaios de tratamento medicamentoso podem ser realizados após os assemblóides estarem maduros o suficiente e a atividade elétrica atingir o pico. O registro da atividade basal/pré-tratamento e da atividade pós-tratamento precisa ser realizado no mesmo dia.
Os conjuntos dorsais-ventrais humanos foram plaqueados em uma placa MEA de 6 poços (n = 6 por diferenciação, 3 diferenciações), com cada poço contendo 64 eletrodos (Figura 2A). Nove em cada dez assemblóides planejados para registro longitudinal foram firmemente fixados aos eletrodos por mais de 50 dias in vitro (Figura 2D). 6 dos 8 assemblóides designados para ensaios farmacológ...
Métodos baseados em MEA para registros eletrofisiológicos da atividade de rede em assembleias derivadas de iPSC têm sido usados para modelagem in vitro de epilepsia22,23. Esta plataforma proposta integrando conexões sinápticas excitatórias e inibitórias tem o potencial de abordar mecanismos de hiperexcitabilidade neuronal e o papel dos interneurônios corticais no processo de epileptogênese. Além disso, esta pla...
Os autores não têm divulgações relevantes.
Este manuscrito foi apoiado por R01NS127829 NIH / NINDS (LTD). A Figura 1 foi gerada usando biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes | Corning | 08-772-32 | For suspension culture on the shaker |
100 mL Beaker | Fisher Scientific | FB100100 | |
100% Ethanol | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermo Fisher | 21985023 | Working concentration 100 μM |
48-well cell culture plate | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
6-well cell culture plate | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | BE-AX14R | |
Allopregnanolone | Cayman | 16930 | Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM. |
Automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
Axion CytoView MEA 6-well plates | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
Axion Maestro MEA platform | Axion Biosystems | Maestro | With temp environmental control |
B-27 supplement (regular, with Vitamin A) | Thermo Fisher | 21985023 | |
B-27 supplement (without Vitamin A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
Basement membrane matrix- Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | |
Bead bath | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
Benchtop inverted microscope | Olympus | CKX53 | Kept in laminar flow clean bench |
Bicuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | Working concentration 10 μM |
Bleach | CLOROX | 67619-26 | |
Borate buffer 20x | Thermo Fisher | 28341 | Working concentration at 1x |
BrainPhys media | StemCell Technologies | 5790 | |
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase) | Thermo Fisher | A1110501 | |
Celltron orbital shaker | HT-Infors | I69222 | |
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme) | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine | Thermo Fisher | 113300 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM) |
D-PBS w/o calcium or magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Hemacytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
Heraguard ECO Clean Bench | Thermo Fisher | 51029692 | |
Humidity controlled cell culture incubator | Thermo Fisher | 370 | set to 37 °C, 5% CO2 |
IWP-2 | Selleckchem | S7085 | Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use. |
Knockout serum replacement (KOSR) | Thermo Fisher | 10828010 | |
mTeSRplus (medium + supplements) | StemCell Technologies | 100-0276 | cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells |
N2 supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal A | Thermo Fisher | 21103049 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher | 11140050 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
Penicilin/Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Pipette (P10, P200, P1000) | Eppendorf | EP4926000034 | Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection |
Poly (Ethyleneimine) (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript. |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-200 | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic | Peprotech | 100-18B | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
Retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM). |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | 1:200 from 10 mM stock |
SAG (smoothened agonist) | Selleckchem | S7779 | Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM). |
SB-431542 | Tocris | 1614 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM) |
Serological pipette filler | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
Steriflip vacuum tube top filter | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | |
Zoom stereomicroscope | Olympus | SZ61/SZ51 | Kept in laminar flow clean bench |
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