JoVE Logo
АВТОРЫ
СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

Войдите в систему

Для просмотра этого контента требуется подписка на Jove Войдите в систему или начните бесплатную пробную версию.

В этой статье

  • Резюме
  • Аннотация
  • Введение
  • протокол
  • Результаты
  • Обсуждение
  • Раскрытие информации
  • Благодарности
  • Материалы
  • Ссылки
  • Перепечатки и разрешения

Резюме

Этот протокол направлен на стабильное латирование дорсально-вентральных сросшихся ассамблоидов на многоэлектродных решетках для моделирования эпилепсии in vitro.

Аннотация

Органоиды человеческого мозга представляют собой трехмерные (3D) структуры, полученные из плюрипотентных стволовых клеток человека (ПСК), которые повторяют аспекты развития мозга плода. Слияние дорсальных и вентральных регионально специфичных органоидов мозга in vitro приводит к образованию ассамблоидов, которые имеют функционально интегрированные микросхемы с возбуждающими и тормозными нейронами. Благодаря своей структурной сложности и разнообразной популяции нейронов, ассамблоиды стали полезным инструментом in vitro для изучения аберрантной сетевой активности. Записи с помощью многоэлектродной матрицы (MEA) служат методом захвата потенциалов электрического поля, спайков и динамики продольной сети от популяции нейронов без ущерба для целостности клеточной мембраны. Тем не менее, приклеивание сборок к электродам для длительной записи может быть сложной задачей из-за их большого размера и ограниченной площади контактной поверхности с электродами. Здесь мы демонстрируем метод нанесения ассамблоидов на пластины MEA для регистрации электрофизиологической активности в течение 2 месяцев. Хотя в текущем протоколе используются органоиды коры головного мозга человека, он может быть широко адаптирован к дифференцированным органоидам для моделирования других областей мозга. Этот протокол устанавливает надежный, продольный, электрофизиологический анализ для изучения развития нейронной сети, и эта платформа имеет потенциал для использования в скрининге лекарств для терапевтических разработок при эпилепсии.

Введение

Органоиды мозга человека, полученные из плюрипотентных стволовых клеток (hPSC), представляют собой пространственно самоорганизованные 3D-структуры, отражающие архитектуру тканей и траектории развития in vivo. Они состоят из нескольких типов клеток, включая прогениторы (нейроэпителиальные клетки, радиальные глии, нейрональные предшественники, глиальные предшественники), нейроны (корковоподобные возбуждающие нейроны и тормозные интернейроны) и глиальные клетки (астроциты и олигодендроциты)1,2. Ассамблоиды представляют собой следующее поколение органоидов мозга, способных интегрировать несколько областей мозга и/или клеточных линий в 3D-культуре. Они предоставляют полезный инструмент для моделирования связей между различными областями мозга, напоминающих аналоги in vivo, улавливания взаимодействий между нейронами и астроцитами для лучшей имитации зрелых и сложных нейронных сетей, а также для изучения сборки нейронных цепей. Таким образом, ассамблоиды становятся широко используемым инструментом для обобщения отличительных признаков патофизиологии эпилепсии, в которых необходимы функциональные меры для исследования аберрантных нейронных сетей, которые могут лежать в основе причины заболевания 3,4,5,6.

Чтобы смоделировать взаимодействия между корковыми глутаматергическими нейронами и ГАМКергическими интернейронами, несколько групп разработали отдельные органоиды, напоминающие дорсальный и вентральный мозг, а затем объединили их в многозонный ассамблоид 7,8,9,10. Здесь был применен ранее описанный протокол культивирования ассамблоидов с регионально специфичными нейронными подтипами9. Тем не менее, существенным барьером является отсутствие воспроизводимых функциональных анализов для мониторинга активности нейронной сети во время развития нервной системы. Многие функциональные тесты сетей в органоидах дают результаты, которые имеют высокую вариабельность среди партий дифференцировок и клеточных линий. Методы, включающие в себя срезы или диссоциацию органоидов, изменяют присущие им сети, разрывая синаптические связи.

Многоэлектродные матрицы (MEA) обеспечивают крупномасштабное представление активности сети с течением времени с высоким временным разрешением для характеристики электрофизиологических свойств органоидов без нарушения условий культивирования или целостности клеточной мембраны11. По сравнению с электрофизиологией пластыря, MEA обеспечивает высокопроизводительный сбор данных на основе больших популяций нейронов, а не отдельных клеток. Платформы MEA различаются по плотности электродов, удовлетворяя различные потребности в исследованиях органоидов мозга12. Широко используемые системы, как показано в этом протоколе, регистрируют от 8 до 64 электродов на лунку 13,14,15. МЭА высокой плотности с количеством электродов до 26 400 на скважину обеспечивают повышенное пространственное и временное разрешение, количественную оценку скорости распространения потенциала действия, а также комбинацию с оптогенетической стимуляцией 14,16,17. Таким образом, MEA служит мощным инструментом для моделирования эпилепсии in vitro и трансляционной парадигмой для скрининга противосудорожных препаратов.

Одной из основных проблем является стабилизация ассамблоидов большого размера на гидрофобной металлической поверхности для длительной записи. В этом протоколе изложена подробная методология нанесения интактных ассамблоидов на пластины MEA для долгосрочной продольной регистрации вместе с фармакологическими анализами. К уникальным преимуществам протокола относятся стабильное прикрепление ассамблоидов к поверхности электрода без потери электрической активности, использование коммерчески доступных нейрофизиологических базальных сред для ускорения созревания функциональной сети после нанесения покрытия, возможность проведения последующих функциональных анализов, таких как медикаментозное лечение, и широкое применение к органоидам, полученным с помощью других региони-специфичных протоколов.

Цель состоит в том, чтобы обеспечить функциональный анализ с высоким временным разрешением для исследования сетевой активности, изучения специфических для заболевания изменений и тестирования препаратов с терапевтическим потенциалом при эпилепсии. Приведены видеоинструкции по наиболее сложным этапам этого протокола, показывающие методы нанесения ассамблоидов на пластины MEA, а также репрезентативные записи из этих культур.

протокол

Все экспериментальные процедуры, представленные ниже, были проведены в соответствии с этическими рекомендациями Наблюдательного совета Медицинской школы Мичиганского университета и Комитета по надзору за исследованиями плюрипотентных стволовых клеток человека. Линии iPSC, использованные в этом протоколе и репрезентативных экспериментах, были получены из фибробластов крайней плоти человека, полученных из коммерческого источника. Подробная информация о клеточных линиях, реагентах и оборудовании, использованных в этом исследовании, приведена в Таблице материалов.

1. Получение органоидов мозга, специфичных для судьбы, из ИПСК

ПРИМЕЧАНИЕ: Данный протокол содержит информацию для подготовки 3 лунок в микролуночном планшете из 5 сливающихся (~85%) лунок 6-луночного планшета. Протокол обслуживания iPSC варьируется в зависимости от клеточных линий.

  1. Приготовьте отдельные среды для культивирования клеток с использованием состава, подробно описанного в таблице 1. Хранить в защищенном от света месте при температуре 4 °C до 2 недель.
  2. Промойте все лунки, которые будут использоваться в планшете для микролунок, 1 мл DMEM/F-12 один раз. Добавьте 1 мл/лунку mTeSR plus + 50 μM Y-27632 и вращайте пластину при 2000 x g в течение 5 минут при комнатной температуре, чтобы удалить пузырьки воздуха из микролунок. Храните планшет в инкубаторе с 5% CO2 при температуре 37 °C.
  3. Очистите участки дифференцированных иПСК стерильным наконечником для пипетки P10 под микроскопом в ламинарном проточном чистом стенде. Остатки клеток смыть с монослоя с помощью PBS 1 мл/лунка без кальция или магния.
  4. Диссоциируйте монослой на отдельные клетки, добавив 1 мл/лунку предварительно нагретого реагента для диссоциации клеток, и поместите планшет в инкубатор с 5% CO2 при температуре 37 °C на 4-7 минут (в зависимости от характеристик и слияния клеточных линий) до тех пор, пока большинство клеток не оторвется, с легким перемешиванием каждые 2-3 минуты.
  5. Добавьте по 4 мл DMEM/F-12 в каждую лунку, чтобы разбавить реагент для диссоциации клеток, и умеренно растирайте с помощью серологической пипетки объемом 10 мл. Соберите клеточную суспензию из всех лунок одной линии в коническую пробирку объемом 50 мл.
  6. Вращайте при 200 x g в течение 4 минут при комнатной температуре, отсасывайте надосадочную жидкость с помощью серологической пипетки объемом 10 мл и ресуспендируйте клетки в 2 мл mTeSR плюс + 50 μM Y-27632. Извлеките суспензию клеток объемом 10 мкл, смешайте 1:1 (v/v) с трипановым синим и подсчитайте клетки с помощью автоматического счетчика клеток.
  7. Пластина 3 х 10по 6 живых клеток в лунку, по 3 лунки на линию. Добавьте дополнительно mTeSR plus + 50 μM Y-27632 по мере необходимости, чтобы довести общий объем до 2 мл/лунку. Закрутите тарелку при 100 х г в течение 3 минут при комнатной температуре и поставьте обратно в инкубатор.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Используемый здесь планшет для микролунок содержит 300 микролунок на лунку, поэтому покрытие 3 x 106 клеток дает 10 000 клеток на микролунку.
  8. На следующий день выполните половинную замену среды, аккуратно удалив 1 мл среды и медленно добавив 1 мл среды mTeSR plus (без Y-27632) с помощью наконечника для дозатора P1000. Держите кончик у поверхности среды и аспирируйте как можно медленнее, чтобы не нарушить агрегирующие клетки на дне.
  9. Проверьте под перевернутым микроскопом через день после смены среды, и вы сможете увидеть четкие контуры каждого агрегата. Удалите исходный носитель из каждой лунки с помощью наконечников для дозатора P1000.
  10. Умеренно распылите 0,5 мл нейроиндукционной среды (NIM) с дорсоморфином (DM) и SB-4321542 (SB) в каждую лунку стерильными, отрезанными наконечниками P1000. Сразу же аккуратно отпижьте взвешенные в среде агрегаты и перенесите их в стерильную 10-сантиметровую чашку для взвеси для культуры. Повторяйте до тех пор, пока не будут перенесены все агрегаты. НЕ растирать.
  11. При необходимости добавляйте дополнительные NIM + SB/DM, чтобы довести общий объем до 10 мл на чашку. Поместите чашку на орбитальный шейкер в инкубатор с 5%CO2 при температуре 37 °C, чтобы предотвратить самопроизвольное слияние агрегатов. Отметьте дату переноса как День 0 культивирования органоидов.
  12. С первого дня и до конца следуйте рецепту мультимедиа, приведенному в таблице 1 , и временной шкале изменения мультимедиа9 на рисунке 1. Примечательно, что органоиды разделены на две чашки для суспензии, обозначенные как «дорсальные» и «брюшные» на 4-й день.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Несколько ключевых временных точек, которые следует иметь в виду: экспансия органоидов начинается на 6-й день, когда среда переключается на среду нейронной дифференцировки (NDM) с EGF/FGF. Дифференцировка нейронов поддерживается, начиная с 25-го дня, с помощью NDM + BDNF/NT3, а органоиды поддерживаются в NDM без факторов роста, начиная с 46-го дня.

2. Вирусное мечение и генерация ассамблоидов

Вирусное мечение 7,9 рекомендуется для распознавания идентичности каждого регионально-специфичного органоида в ассамблоиде и распределения электрофизиологической активности от специфических электродов к ассамблоидным областям. Оптимально, если для каждой скважины MEA будет нанесено покрытие только по одному органоиду. Этот протокол также может применяться к одиночной органоидной оболочке.

  1. Рассчитайте объемы используемого вирусного сырья и разбавляющих сред: для каждого маркируемого органоида требуется 200 мкл среды с вирусом. Дорсальные органоиды мечаются pAAV1-CAG-tdTomato, как правило, в соотношении разведения 1:1000 (v/v), или примерно 2 x10 vg /мл. Для вентральных органоидов используется вирус 1:300 (v/v) или 2 x 1011 vg/мл pAAV1-mDLX-GFP.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Разведения должны быть титрованы до желаемого эффекта и подвержены влиянию титра вируса.
  2. Прогрейте соответствующее количество среды до 37 °C. Разморозьте вирусный запас, хранящийся при -80 °C на льду. Маркируйте достаточное количество 48-луночных планшетов, чтобы вместить все помеченные органоиды.
  3. Положите в капюшон стакан, содержащий 10% отбеливателя. Изгоняйте в стакан любые материалы, контактирующие с вирусами. Полностью размороженные вирусы развести в питательных средах в отдельных конических пробирках объемом 15 мл, помеченных как «дорсальные» и «вентральные».
  4. Переместите органоиды 56-го дня из тарелок для культур в 48-луночные тарелки. Рекомендуется использовать один органоид на лунку для предотвращения спонтанного слияния в статической культуре. Удалите как можно больше остаточных питательных сред.
  5. Добавьте по 200 мкл вирусно-медиа смеси в каждую лунку соответственно. Поместите планшеты обратно в инкубатор с температурой 37 °C 5%CO2 . Наклоните планшеты на стерильной пустой пластине, чтобы сконцентрировать вирусные частицы на дне лунки и оптимизировать эффективность трансдукции.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Вирусные частицы имеют тенденцию опускаться на дно конической пробирки объемом 15 мл, поэтому частое переворачивание трубки для смешивания вирусов с средой перед добавлением их в каждую лунку очень важно для обеспечения равномерной эффективности трансдукции для всех органоидов.
  6. На следующий день (день 57) добавьте еще 800 мкл питательной среды в каждую лунку, чтобы довести общий объем до 1 мл/лунку.
  7. Через три дня (день 60) проведите полную смену среды для помеченных органоидов. Отбеливайте любые материалы, контактирующие с вирусными частицами.
  8. Через три дня (день 63) проверьте экспрессию флуоресценции под эпифлуоресцентным инвертированным микроскопом. Если сигнал сильный, начните генерацию ассамблоидов (см. шаг 2.9).
  9. Промойте все меченые органоиды с помощью PBS 1 мл/лунка дважды, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение оставшимися вирусными частицами во время слияния органоидов. С помощью отрезанного наконечника пипетки P1000 перенесите по одному вентральному органоиду в каждую дорсальную лунку (или наоборот) и соответствующим образом перемаркируйте пластину сборки. Наклоните пластины, как в шаге 2.5 для лучшего сплавления.
  10. Осторожно выполнить половинную смену среды через 3 дня после процедуры сращивания (66-й день), не прерывая сборки. Обычно для формирования стабильных ассамблоидов требуется около недели (70-й день).

3. Размещение ассамблоидов на предварительно обработанных пластинах MEA

ПРИМЕЧАНИЕ: Для завершения процедур подготовки поверхности пластин MEA перед нанесением покрытий на сборки требуется не менее 4 дней. Для экономии времени слияние дорсальных и вентральных органоидов (т.е. шаг 2.9) и предварительная обработка МЭА могут выполняться параллельно.

  1. Подготовьте реагенты для предварительной обработки поверхности и нанесения покрытия.
    1. Для приготовления 1% раствора моющего/энзимного средства растворите 0,5 г порошка фермента/моющего средства в 50 мл деионизированной воды. Тщательно перемешайте до полного растворения порошка. Стерилизуйте раствор с помощью стерильного вакуумного фильтра с верхней трубкой в шкафу биобезопасности перед добавлением его в лунки MEA. Готовьте свежий перед каждым использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Моющее средство/фермент стерилизует поверхность MEA, удаляет любые остатки масел из производственного процесса MEA и гарантирует, что поверхность достаточно гидрофильна, чтобы способствовать взаимодействию с гидрофильным соединением полиэтиленимином (PEI)18.
    2. Чтобы приготовить 0,07% раствор PEI19, начните с приготовления бульона 7% раствора PEI путем смешивания 1 мл 50% раствора PEI в конической пробирке объемом 15 мл с 6 мл 1x боратного буфера. Разведите 1 мл стокового 7% раствора PEI в 99 мл 1x боратного буфера до достижения конечной рабочей концентрации. Для стерилизации перед использованием профильтруйте через фильтрующий блок 0,22 μм в шкафу биобезопасности.
      ПРИМЕЧАНИЕ: PEI, положительно заряженный полимер, используется в процессе нанесения первичного покрытия для облегчения присоединения отрицательно заряженного вторичного покрытия к матрице базальной мембраны (BMM) и ассамблоидам20. Выньте 1 мл 50% PEI, налив вместо пипетирования в коническую трубку, так как исходный раствор очень вязкий. Необходимое количество можно легче измерить, взвесив его в коническую пробирку, а 50% раствор PEI имеет плотность 1,08 г/мл. 7% исходный раствор PEI можно хранить в 1 мл аликвот при температуре -20 °C до месяца. Все последующие действия проведите в шкафу биобезопасности.
  2. Учитывая размер каждого сбора, для размещения одного ассамблоида на лунку используются 6-луночные пластины MEA с 64 электродами на лунку. Рассчитайте количество планшетов MEA, необходимых для проведения экспериментов, чтобы обеспечить достаточное количество биологических реплик.
  3. Добавьте 1 мл 1% раствора моющего/ферментного средства в каждую лунку стерильной пластины MEA. Будьте осторожны, чтобы не повредить электроды наконечником пипетки. При использовании вакуумного аспиратора для промывки не допускайте соприкосновения наконечника с электродной решеткой. Инкубировать в инкубаторе при температуре 37 °C в течение 2 ч.
  4. Удалите моющее средство/фермент и промойте каждую лунку пять раз 1,5 мл стерильной деионизированной воды. Поскольку моющее средство/фермент не является биосовместимым, важно убедиться, что оставшиеся химикаты полностью смыты.
  5. Заполните каждую лунку 1 мл питательной среды для предварительного кондиционирования. Поставьте пластины обратно на 37 °C 5%CO2 в инкубатор на 2 дня. Воздействие на поверхность МЭА условий клеточной культуры способствует прикреплению клеток.
  6. Удалите питательную среду и нанесите на электроды MEA в каждой лунке 50 мкл 0,07% раствора PEI для первичного покрытия. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
  7. Полностью аспирировать раствор PEI. Промойте каждую лунку 1 мл стерильной деионизированной воды. Всего выполните 3 быстрых стирки. Высушите пластины при комнатной температуре в течение 15 минут в шкафу биобезопасности с закрытой крышкой.
  8. Покройте область электрода в каждой лунке 50 мкл 1:20 (v/v) BMM, разведенным в питательных средах для вторичного покрытия. Поместите планшеты MEA обратно в инкубатор с температурой 37 °C на ночь. Добавьте стерильную воду в отсеки вокруг лунок, чтобы обеспечить достаточную влажность на протяжении всего процесса покрытия.
  9. На следующий день аспират разбавляют BMM вакуумом, оставляя тонкий слой на поверхности. Если образовался толстый слой, с усилием распылите питательную среду на контактную зону электрода с помощью наконечника для пипетки P1000. Мойте столько раз, сколько необходимо, чтобы удалить толстые куски.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Остаточный толстый BMM может препятствовать контакту электродов с элементами.
  10. Соберите ассамблоид с широко разрезанным наконечником P1000 и поместите его поверх электродов в лунку, перенося при этом как можно меньше среды.
  11. В ламинарном проточном колпаке под зондом для вскрытия осторожно протолкните ассамблоид стерильной иглой для рассечения или наконечником Р20 в нужное место, где как дорсальные, так и вентральные органоиды могут быть в основном покрыты электродами. Используйте наконечник P20 для удаления жидкости вокруг сборки. Повторите это для всех ассамблоидов или подмножества, что можно сделать в течение нескольких минут.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Старайтесь НЕ прикасаться и не царапать поверхность MEA наконечником и/или иглой пипетки. Старайтесь НЕ тыкать и не рвать ассамблоид наконечниками пипетки. Закончите нанесение покрытия как можно быстрее, чтобы избежать полного высыхания органоида.
  12. Инкубировать ассамблоиды при температуре 37 °C в течение 10 мин (без среды). Переложите планшеты из инкубатора в ламинарный проточный колпак и нанесите 2-3 небольшие капли 1:50 BMM, разведенные в питательных средах, поверх ассамблоидов под зоной диссекции. Выдерживать при температуре 37 °C еще 30 минут.
  13. Осторожно добавьте 3 капли питательных сред близко к ассамблоидам под зоной диссекции. Это сохраняет органоиды увлажненными. Выдерживать при 37 °C в течение 1 ч.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если сборка перемещается или плавает на любых последующих этапах, покрытие следует начать заново с шага 3.11.
  14. Каждый час осторожно добавляйте 20-50 мкл среды для клеточных культур в каждую лунку под зондоскопом для вскрытия. Это можно сделать в течение дня. Цель состоит в том, чтобы достичь общего объема не менее 250 μL в конце дня.
  15. На следующий день проверьте, все ли ассамблоиды осели и стабилизировались ли они под областью вскрытия. Добавьте дополнительно 750 мкл питательной среды, чтобы получить общий объем 1 мл на лунку. Оставьте тарелки в покое не менее чем на 2 дня.
  16. Осторожно проводите еженедельную смену среды, вынимая 500 мкл питательных сред и добавляя 700 мкл нейрофизиологической базальной среды. Дополнительный объем добавляемого фильтрующего материала учитывает испарение и может быть отрегулирован в зависимости от того, насколько сильно испаряется используемая пластина MEA. При необходимости добавляйте стерильную воду вокруг лунок, чтобы свести к минимуму испарение из лунок MEA.

4. Регистрация и анализ данных MEA

  1. Начните запись МЭА примерно через неделю после перехода на нейрофизиологические базальные среды (обычно примерно на 78-й день).
  2. Подождите, пока записывающая камера достигнет заданной температуры (обычно 37 °C). Перенесите пластину на устройство и дайте ей уравновеситься не менее 5 минут до начала записи.
  3. Настройки оборудования в реальном времени
    1. Установите частоту дискретизации, т. е. скорость, с которой записываются исходные данные о напряжении. Рекомендуется использовать настройку по умолчанию (12,5 кГц).
    2. Укажите аналоговый режим (обычно Neural Spikes, как в данном случае) для настройки аппаратной пропускной способности и усиления для конкретных приложений. Для визуального контроля активности во время записи используйте модули Spike Detector и Burst Detector .
      ПРИМЕЧАНИЕ: Аналоговые настройки влияют на то, как записываются исходные данные о напряжении, и не могут быть изменены после записи данных.
    3. (Дополнительный) Примените аппаратный цифровой фильтр к данным записи. Варианты фильтра нижних частот включают окно Кайзера 2 кГц или 3 кГц. Настройки по умолчанию можно изменить после выбора Аналоговых настроек.
    4. Установите значение Ссылка по медиане (по умолчанию), что настоятельно рекомендуется для нейронной записи, как в данном случае. Система сравнения улучшает качество сигналов с низкой амплитудой за счет уменьшения шумовых помех, характерных для групп каналов.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Вышеуказанные параметры могут быть скорректированы по мере необходимости в зависимости от активности, наблюдаемой в ассамблоидах, но должны оставаться неизменными для всех записей в данном эксперименте.
  4. Добавьте карты табличек и описания (при необходимости). Импортируйте карту номерных знаков из предыдущей записи для той же пластины, чтобы обеспечить согласованность и упростить пакетную обработку данных. Убедитесь, что файлы названы правильно.
  5. Если сигналы выглядят хорошо (минимальный шум и артефакты), запишите необработанные данные. Как правило, для репрезентативной выборки достаточно 2-5 минут записи.
  6. Продольно регистрируйте электрическую активность один или два раза в неделю, в течение 5-15 минут, в зависимости от плана эксперимента. Подождите не менее 24 часов после каждой смены носителя, прежде чем начинать следующий раунд записи, так как электрическая активность падает сразу после каждой смены носителя.
  7. (Дополнительный) Если необходимо локализовать электрическую активность и различить дорсальные и вентральные органоиды, или если необходимо проанализировать активность каждого электрода отдельно, после каждой записи получите изображение каждого ассамблоида в условиях яркого поля и эпифлуоресценции (рис. 2B).
  8. При анализе данных примените конфигурацию анализа, включающую детектор пиков/всплесков и компилятор статистики. Используйте адаптивный порог, установленный на 5,5–6 стандартных отклонений от базового уровня для обнаружения пиков. Определите всплески как активность с пиками ≥5 за 100 мс13. Определение сетевой активности, когда более 25% от общего числа активных электродов сгорает в течение 100 мс с минимум 50 пиками на сетевой всплеск13,14.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Эти параметры модулируются в зависимости от характеристик срабатывания конкретного эксперимента. Чтобы повысить чувствительность к пикам низкой амплитуды, адаптивный порог обнаружения спайков может быть снижен. Для обнаружения всплесков могут быть использованы различные методы, а параметры могут быть адаптированы для обнаружения всплесков всплесков, которые существенно отличаются от фоновой активности. Параметры активности сети могут быть модулированы в сторону меньшего процента электродов, особенно когда ассамблоиды не покрывают все поле электродов. Все параметры должны оставаться неизменными на протяжении всего эксперимента, чтобы можно было проводить продольные сравнения.
  9. Запустите модуль Компилятор статистики для пакетной обработки во время воспроизведения записанных данных. Экспортируйте расширенные метрики и/или выходные файлы пиков для расширенного анализа.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Выходные данные расширенных метрик содержат файл с .csv электродами, средними значениями скважин и групп для средних значений срабатывания, разрыва и синхронности. Вывод спайков (файл .spk) включает в себя кривые осциллограмм для всех спайков, которые можно импортировать на другие платформы для расширенного анализа, например, сортировки спайков.

5. Фармакологический анализ конечной точки и переработка планшетов

ПРИМЕЧАНИЕ: Анализы лечения лекарственными препаратами могут быть проведены после того, как ассамблоиды достаточно созреют и электрическая активность достигнет пика. Запись исходного уровня/активности до обработки и активности после обработки должна проводиться в один и тот же день.

  1. Добавьте 1-10 μL раствора препарата прямо поверх ассамблоида и аккуратно покрутите пластину, чтобы обеспечить однородную смесь. В некоторых случаях рекомендуется более длительное время инкубации в лекарственных средах, содержащих наркотики, например, при анализах лечения препаратами, связанными с синапсами, агонистами/антагонистами глутамата/рецепторов ГАМК (рис. 2E) (подробнее см. раздел «Результаты»).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Добавление небольшого количества раствора препарата в каждую лунку рекомендуется для достижения окончательной рабочей концентрации, поскольку большое изменение объема временно снижает электрическую активность в целом. Важно следить за тем, чтобы добавление носителя, в котором растворяются интересующие препараты, не провоцировало существенных изменений электрофизиологических параметров.
  2. Проведите достаточное количество промываний PBS (обычно 3) и вымывайте лекарства после записи после лечения. Проведите дополнительную запись на следующий день после вымывания препарата, чтобы увидеть, возвращается ли электрическая активность к исходному уровню.
  3. Необязательно, принудительно пипетируйте среды для отделения ассамблоидов от пластины MEA в конце записи для проведения дальнейших экспериментов, например, визуализации в реальном времени, фиксации 4% параформальдегидом для иммуноокрашивания всего массива или лизиса для экстракции РНК или белка.
  4. Для целей анализа используйте не менее трех технических и биологических репликатов для каждого состояния. Экспрессируйте электрофизиологические данные в виде среднего значения n ≥ 3 репликации.
  5. Чтобы утилизировать пластину в конце экспериментов, отсасывайте оставшиеся среды после удаления прикрепленных сборок. Один раз постирайте стерильным PBS. Полностью покройте металлическую область 200 μл/лунка 0,25% трипсин-ЭДТА и поместите планшет обратно в инкубатор с температурой 37 °C на ночь.
  6. На следующий день аспирировать трипсин, промыться дважды 70% стерильным этанолом и трижды стерильной деионизированной водой.
  7. Высушите тарелку на воздухе в шкафу биобезопасности в течение 15 минут при снятой крышке или до полного высыхания. Запечатайте очищенную тарелку в полиэтиленовый пакет и храните его при комнатной температуре до дальнейшего использования.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Хорошо очищенную пластину MEA можно использовать повторно три раза без существенной потери качества записи.

Результаты

Дорсально-вентральные ассамблоиды человека были нанесены на 6-луночную пластину MEA (n = 6 на дифференцировку, 3 дифференцировки), причем каждая лунка содержала 64 электрода (рис. 2A). Девять из десяти ассамблоидов, запланированных для продо...

Обсуждение

Методы на основе MEA для электрофизиологической регистрации сетевой активности в ассамблоидах, полученных из iPSC, были использованы для моделирования эпилепсии in vitro 22,23. Эта предложенная платформа, объединяющая возбуждающие и торм?...

Раскрытие информации

Авторы не раскрывают соответствующую информацию.

Благодарности

Эта рукопись была подготовлена при поддержке R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). Рисунок 1 был сгенерирован с использованием biorender.com.

Материалы

NameCompanyCatalog NumberComments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishesCorning08-772-32For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker Fisher ScientificFB100100
100% EthanolFisher ScientificBP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)Thermo Fisher21985023Working concentration 100 μM
48-well cell culture plateFisher Scientific50-202-140
6-well cell culture plateFisher Scientific07-200-83
Aggrewell 800Fisher Scientific501974754
Allegra X-14R Refrigerated CentrifugeBeckman Coulter BE-AX14R
AllopregnanoloneCayman16930Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counterThermo FisherAMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates Axion BiosystemsM384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platformAxion BiosystemsMaestroWith temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)Thermo Fisher21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)Thermo Fisher12587010
Basement membrane matrix- GeltrexThermo FisherA1569601
Bead bathFisher Scientific10-876-001Isotemp
Benchtop inverted microscopeOlympusCKX53Kept in laminar flow clean bench
BicucullineSigma-Aldrich14340Working concentration 10 μM
BleachCLOROX67619-26
Borate buffer 20xThermo Fisher28341Working concentration at 1x
BrainPhys mediaStemCell Technologies5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)Thermo FisherA1110501
Celltron orbital shakerHT-Infors I69222 
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)Sigma-AldrichZ273287Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-GlutamineThermo Fisher113300
DMSOSigma-Aldrich67685
DorsomorphinSigma-AldrichP5499Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesiumThermo Fisher14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)Peprotech450-10Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplementThermo Fisher35050061
HemacytometerElection Microscopy Sciences63510-20
HEPESThermo Fisher15630080
Heraguard ECO Clean BenchThermo Fisher51029692
Humidity controlled cell culture incubatorThermo Fisher370set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2SelleckchemS7085Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)Thermo Fisher10828010
mTeSRplus (medium + supplements)StemCell Technologies100-0276cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplementThermo Fisher17502048
Neurobasal AThermo Fisher21103049
Non-essential amino acids (NEAA)Thermo Fisher11140050
NT3Peprotech450-03Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblastsMTI-GlobalStemGSC-3002
ParafilmPARAFILMP7793
Penicilin/StreptomycinThermo Fisher15140122
Pipette (P10, P200, P1000)EppendorfEP4926000034Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)Sigma-AldrichP3143Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)R&D Systems236-EG-200Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic Peprotech100-18BSuspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)Peprotech450-02Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)Sigma-AldrichR2625Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632Tocris12541:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)SelleckchemS7779Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542Tocris1614Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette fillerFisher Scientific14-387-166
Steriflip vacuum tube top filterSigma-AldrichSE1M179M6
Sterile cell culture hoodsBaker CompanySG-600
Trypan blue solution (0.4%)Thermo Fisher15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)Thermo Fisher25200056
Zoom stereomicroscopeOlympusSZ61/SZ51Kept in laminar flow clean bench

Ссылки

  1. Lancaster, M. A., Knoblich, J. A. Organogenesis in a dish: Modeling development and disease using organoid technologies. Science. 345 (6194), 1247125 (2014).
  2. Tanaka, Y., et al. Synthetic analyses of single-cell transcriptomes from multiple brain organoids and fetal brain. Cell Rep. 30 (6), 1682-1689.e3 (2020).
  3. Meng, X., et al. Assembloid CRISPR screens reveal impact of disease genes in human neurodevelopment. Nature. 622 (7982), 359-366 (2023).
  4. Samarasinghe, R. A., et al. Identification of neural oscillations and epileptiform changes in human brain organoids. Nat Neurosci. 24 (10), 1488-1500 (2021).
  5. Saleem, A., et al. Modelling hyperexcitability in human cerebral cortical organoids: Oxygen/glucose deprivation most effective stimulant. Heliyon. 9 (4), e14999 (2023).
  6. Saberi, A., et al. In-vitro engineered human cerebral tissues mimic pathological circuit disturbances in 3D. Commun Biol. 5 (1), 1-9 (2022).
  7. Bagley, J. A., et al. Fused dorsal-ventral cerebral organoids model complex interactions between diverse brain regions. Nat Methods. 14 (7), 743-751 (2017).
  8. Birey, F., et al. Assembly of functionally integrated human forebrain spheroids. Nature. 545 (7652), 54-59 (2017).
  9. Sloan, S. A., et al. Generation and assembly of human brain region-specific three-dimensional cultures. Nat Protoc. 13 (9), 2062-2085 (2018).
  10. Xiang, Y., et al. Fusion of regionally-specified hPSC-derived organoids models human brain development and interneuron migration. Cell Stem Cell. 21 (3), 383-398.e7 (2017).
  11. VanDersarl, J. J., Renaud, P. Biomimetic surface patterning for long-term transmembrane access. Sci Rep. 6 (1), 32485 (2016).
  12. Sandoval, S. O., et al. Rigor and reproducibility in human brain organoid research: Where we are and where we need to go. Stem Cell Rep. 19 (6), 796-816 (2024).
  13. Hartmann, J., et al. Molecular and functional characterization of different brainsphere models for use in neurotoxicity testing on microelectrode arrays. Cells. 12 (9), 1270 (2023).
  14. Chen, Y., et al. Generation of advanced cerebellar organoids for neurogenesis and neuronal network development. Hum Mol Genet. 32 (18), 2832-2841 (2023).
  15. Fair, S. R., et al. Electrophysiological maturation of cerebral organoids correlates with dynamic morphological and cellular development. Stem Cell Rep. 15 (4), 855-868 (2020).
  16. Muzzi, L., et al. Human-derived cortical neurospheroids coupled to passive, high-density and 3D MEAs: A valid platform for functional tests. Bioeng. (Basel). 10 (4), 449 (2023).
  17. Hruska-Plochan, M., et al. A model of human neural networks reveals NPTX2 pathology in ALS and FTLD. Nature. 626 (8001), 1073-1083 (2024).
  18. Reumann, D., et al. In vitro modeling of the human dopaminergic system using spatially arranged ventral midbrain-striatum-cortex assembloids. Nat Methods. 20 (12), 2034-2047 (2023).
  19. Fenton, T. A., et al. Hyperexcitability and translational phenotypes in a preclinical model of SYNGAP1 mutations. bioRxiv. , (2023).
  20. Huang, Q., et al. Shell microelectrode arrays (MEAs) for brain organoids. Sci Adv. 8 (33), eabq5031 (2022).
  21. Dong, X., et al. Human cerebral organoids establish subcortical projections in the mouse brain after transplantation. Mol Psychiatry. 26 (7), 2964-2976 (2021).
  22. Patton, M. H., et al. Synaptic plasticity in human thalamocortical assembloids. bioRxiv. , (2024).
  23. Osaki, T., et al. Complex activity and short-term plasticity of human cerebral organoids reciprocally connected with axons. Nat Commun. 15 (1), 2945 (2024).
  24. Trujillo, C. A., et al. Complex oscillatory waves emerging from cortical organoids model early human brain network development. Cell Stem Cell. 25 (4), 558-569.e7 (2019).
  25. Schröter, M., et al. Functional imaging of brain organoids using high-density microelectrode arrays. MRS Bull. 47 (6), 530-544 (2022).
  26. Nieto-Estevez, V., et al. Dual effects of ARX poly-alanine mutations in human cortical and interneuron development. bioRxiv. , (2024).
  27. Ciarpella, F., et al. Murine cerebral organoids develop network of functional neurons and hippocampal brain region identity. iScience. 24 (12), 103438 (2021).
  28. Zhang, Z., et al. Development and application of brain region-specific organoids for investigating psychiatric disorders. Biol Psychiatry. 93 (7), 594-605 (2023).
  29. Andersen, J., et al. Generation of functional human 3D cortico-motor assembloids. Cell. 183 (7), 1913-1929.e26 (2020).
  30. Atamian, A., et al. Human cerebellar organoids with functional Purkinje cells. Cell Stem Cell. 31 (1), 39-51.e6 (2024).

Перепечатки и разрешения

Запросить разрешение на использование текста или рисунков этого JoVE статьи

Запросить разрешение

Смотреть дополнительные статьи

211

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Конфиденциальность

Условия эксплуатации

Политика

СВЯЖИТЕСЬ С НАМИ

РЕКОМЕНДОВАТЬ БИБЛИОТЕКЕ

НОВОСТИ JoVE

Исследования

Образование

АВТОРЫ

Библиотекарь

О JoVE

Авторские права © 2025 MyJoVE Corporation. Все права защищены