İnsan Pluripotent Kök Hücre Kaynaklı Beyin Topluluklarını Kullanarak Epilepsiyi Modellemek için Çok Elektrotlu Bir Dizi Platformu

Özet

Bu protokol, in vitro epilepsiyi modellemek için dorsal-ventral kaynaşmış asembloidleri çoklu elektrot dizileri üzerinde stabil bir şekilde plakalamayı amaçlamaktadır.

Özet

İnsan beyni organoidleri, fetal beyin gelişiminin yönlerini özetleyen insan pluripotent kök hücrelerinden (hPSC'ler) türetilen üç boyutlu (3D) yapılardır. Dorsalın in vitro olarak ventral bölgesel olarak belirlenmiş beyin organoidleri ile füzyonu, uyarıcı ve inhibitör nöronlarla fonksiyonel olarak entegre mikro devrelere sahip assembloidler oluşturur. Yapısal karmaşıklıkları ve çeşitli nöron popülasyonları nedeniyle, assembloidler, anormal ağ aktivitesini incelemek için yararlı bir in vitro araç haline gelmiştir. Çok elektrotlu dizi (MEA) kayıtları, hücre zarı bütünlüğünden ödün vermeden bir nöron popülasyonundan elektriksel alan potansiyellerini, ani yükselmeleri ve uzunlamasına ağ dinamiklerini yakalamak için bir yöntem olarak hizmet eder. Bununla birlikte, uzun süreli kayıtlar için asambleleri elektrotlara yapıştırmak, büyük boyutları ve elektrotlarla sınırlı temas yüzeyi alanı nedeniyle zor olabilir. Burada, 2 aylık bir süre boyunca elektrofizyolojik aktiviteyi kaydetmek için asambleleri MEA plakalarına plakalamak için bir yöntem gösteriyoruz. Mevcut protokol insan kortikal organoidlerini kullanmasına rağmen, diğer beyin bölgelerini modellemek için farklılaşmış organoidlere geniş ölçüde uyarlanabilir. Bu protokol, bir nöronal ağın gelişimini incelemek için sağlam, uzunlamasına, elektrofizyolojik bir test oluşturur ve bu platform, epilepside terapötik gelişim için ilaç taramasında kullanılma potansiyeline sahiptir.

Giriş

İnsan pluripotent kök hücre (hPSC) türevi beyin organoidleri, doku mimarisini ve gelişimsel yörüngeleri in vivo olarak yansıtan, uzamsal olarak kendi kendini organize eden 3D yapılardır. Progenitörler (nöroepitel hücreleri, radyal glia, nöronal progenitörler, glial progenitörler), nöronlar (kortikal benzeri uyarıcı nöronlar ve inhibitör internöronlar) ve glial hücreler (astrositler ve oligodendrositler) dahil olmak üzere çoklu hücre tiplerinden ^{oluşurlar1,2}. Assembloidler, bir 3D kültür içinde birden fazla beyin bölgesini ve/veya hücre soylarını entegre edebilen yeni nesil beyin organoidlerini temsil eder. İn vivo muadillerine benzeyen çeşitli beyin bölgeleri arasındaki bağlantıları modellemek, olgun ve karmaşık sinir ağlarını daha iyi taklit etmek için nöronlar ve astrositler arasındaki etkileşimleri yakalamak ve nöral devrelerin montajını incelemek için yararlı bir araç sağlarlar. Bu nedenle, assembloidler, hastalığın nedeninin altında yatabilecek anormal sinir ağlarını sorgulamak için fonksiyonel önlemlerin gerekli olduğu epilepsi patofizyolojisinin ayırt edici özelliklerini özetlemek için yaygın olarak kullanılan bir araç haline gelmektedir 3,4,5,6.

Kortikal glutamaterjik nöronlar ve GABAerjik internöronlar arasındaki etkileşimleri modellemek için, birkaç grup dorsal ve ventral beyne benzeyen ayrı organoidler geliştirdi ve daha sonra bunları çok bölgeli bir toplulukta bir araya getirdi 7,8,9,10. Burada, bölgesel olarak spesifik nöral alt tiplere sahip daha önce tanımlanmış bir assembloid kültür protokolü uygulanmıştır⁹. Bununla birlikte, önemli bir engel, nörogelişim sırasında sinir ağı aktivitesini izlemek için tekrarlanabilir fonksiyonel tahlillerin olmamasıdır. Organoidlerdeki ağların birçok fonksiyonel testi, farklılaşma grupları ve hücre hatları arasında yüksek değişkenliğe sahip sonuçlar verir. Organoidlerin dilimlenmesini veya ayrıştırılmasını içeren teknikler, sinaptik bağlantıyı keserek doğal ağlarını değiştirir⁸.

Çok elektrotlu diziler (MEA), kültür koşullarını veya hücre zarı bütünlüğünü bozmadan organoidlerin elektrofizyolojik özelliklerini karakterize etmek için yüksek zamansal çözünürlükle zaman içindeki ağ aktivitesinin büyük ölçekli bir görünümünü sağlar¹¹. Yama kelepçe elektrofizyolojisi ile karşılaştırıldığında, MEA, tek hücreler yerine büyük nöron popülasyonlarına dayalı yüksek verimli veri toplamayı mümkün kılar. MEA platformları, elektrot yoğunluklarına göre değişir ve beyin organoid araştırmalarında farklı ihtiyaçları karşılar¹². Yaygın olarak kullanılan sistemler, bu protokolde gösterildiği gibi, kuyu başına 8 ila 64 elektrot kaydeder 13,14,15. Kuyu başına 26.400'e kadar elektrot içeren yüksek yoğunluklu MEA'lar, artan uzamsal ve zamansal çözünürlük, aksiyon potansiyeli yayılma hızının ölçülmesi ve optogenetik stimülasyon 14,16,17 ile kombinasyon sağlar. Bu nedenle, MEA, in vitro epilepsiyi modellemek için güçlü bir araç ve nöbet önleyici ilaç taraması için translasyonel bir paradigma olarak hizmet eder.

En büyük zorluklardan biri, uzun süreli kayıtlar için büyük boyutlu asambleleri hidrofobik bir metal yüzey üzerinde stabilize etmektir. Bu protokol, farmakolojik tahlillerle birlikte uzun süreli uzunlamasına kayıt için sağlam assembloidlerin MEA plakaları üzerine kaplanması için ayrıntılı bir metodolojinin ana hatlarını çizmektedir. Protokolün benzersiz avantajları arasında, elektriksel aktiviteyi kaybetmeden asembloidlerin elektrot yüzeyine stabil bir şekilde bağlanması, kaplamadan sonra fonksiyonel ağ olgunlaşmasını hızlandırmak için ticari olarak temin edilebilen nörofizyolojik bazal ortamın kullanılması, ilaç tedavisi gibi aşağı akış fonksiyonel tahlilleri yürütmek için fizibilite ve diğer bölgeye özgü protokollerle üretilen organoidlere geniş uygulama yer alır.

Amaç, ağ aktivitesini araştırmak, hastalığa özgü değişiklikleri incelemek ve epilepside terapötik potansiyele sahip ilaçları test etmek için yüksek zamansal çözünürlüğe sahip fonksiyonel bir test sağlamaktır. Bu protokolün en zorlu adımları için, MEA plakaları üzerine asambleleri kaplama tekniklerinin yanı sıra bu kültürlerden temsili kayıtları gösteren video talimatları sağlanmıştır.

Protokol

Aşağıda gösterilen tüm deneysel prosedürler, Michigan Üniversitesi Tıp Fakültesi Kurumsal İnceleme Kurulu ve İnsan Pluripotent Kök Hücre Araştırma Gözetim Komitesi'nin etik yönergelerine uygun olarak yürütülmüştür. Bu protokolde kullanılan iPSC hatları ve temsili deneyler, ticari bir kaynaktan elde edilen insan sünnet derisi fibroblastlarından türetilmiştir. Bu çalışmada kullanılan hücre hatlarının, reaktiflerin ve ekipmanın ayrıntıları Malzeme Tablosunda listelenmiştir.

1. iPSC'lerden kadere özgü beyin organoidlerinin türetilmesi

NOT: Bu protokol, 6 oyuklu bir plakanın 5 birleşik (~%85) kuyusundan mikrokuyu kültür plakasında 3 kuyu hazırlamak için bilgi içerir. iPSC bakım protokolü, hücre hatlarına bağlı olarak değişir.

1. Tablo 1'de ayrıntıları verilen bileşimi kullanarak tek tek hücre kültürü ortamını hazırlayın. 4 °C'de 2 haftaya kadar ışıktan korunarak saklayın.
2. Mikrokuyu kültür plakasında kullanılacak tüm kuyucukları 1 mL DMEM/F-12 ile bir kez durulayın. 1 mL / kuyu mTeSR plus + 50 μM Y-27632 ekleyin ve mikro kuyulardan hava kabarcıklarını çıkarmak için plakayı oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 2000 x g'da döndürün. Plakayı 37 °C% 5 CO₂ inkübatörde saklayın.
3. Steril bir P10 pipet ucu ile steril bir P10 pipet ucu ile laminer akışlı temiz bir tezgahta farklılaştırılmış iPSC'lerin bölgelerini temizleyin. Tek tabakadaki hücre kalıntılarını kalsiyum veya magnezyum içermeyen 1 mL / kuyu PBS ile yıkayın.
4. 1 mL / kuyucuk önceden ısıtılmış hücre ayrışma reaktifi ekleyerek ve plakayı 37 ° C% 5 CO₂ inkübatöre 4-7 dakika boyunca (hücre hatlarının özelliklerine ve birleşmesine bağlı olarak) yerleştirerek tek tabakayı tek hücrelere ayırın çoğu hücre kalkana kadar, her 2-3 dakikada bir hafif çalkalama ile.
5. Hücre ayrışma reaktifini seyreltmek için her oyuğa 4 mL DMEM / F-12 ekleyin ve 10 mL'lik bir serolojik pipet ile orta derecede ezin. Aynı hattın tüm kuyucuklarından hücre süspansiyonunu 50 mL'lik konik bir tüpte toplayın.
6. Oda sıcaklığında 4 dakika boyunca 200 x g'da döndürün, süpernatanı 10 mL serolojik pipet kullanarak aspire edin ve hücreleri 2 mL mTeSR artı + 50 μM Y-27632 içinde yeniden süspanse edin. 10 μL hücre süspansiyonunu çıkarın, tripan mavisi ile 1: 1 (h/v) karıştırın ve otomatik bir hücre sayacı ile hücreleri sayın.
7. Plaka 3 x 10^{Kuyucuk başına 6} canlı hücre, hat başına 3 kuyu. Toplam hacmi 2 mL / kuyuya getirmek için gerektiği gibi ek mTeSR plus + 50 μM Y-27632 ekleyin. Plakayı oda sıcaklığında 3 dakika boyunca 100 x g'da döndürün ve inkübatöre geri koyun.
   NOT: Burada kullanılan mikrokuyu kültür plakası, oyuk başına 300 mikrokuyu içerir, bu nedenle 3 x 10⁶ hücreli kaplama, 10.000 hücre/mikrokuyu ile sonuçlanır.
8. Ertesi gün, 1 mL medyayı nazikçe çıkararak ve P1000 pipet ucuyla yavaşça 1 mL mTeSR artı medya (Y-27632 olmadan) ekleyerek yarım hacimli bir medya değişikliği yapın. Ucu ortam yüzeyine yakın tutun ve alttaki toplayıcı hücreleri rahatsız etmemek için mümkün olduğunca yavaş aspire edin.
9. Ortam değişikliğinden bir gün sonra ters çevrilmiş bir mikroskop altında kontrol edin ve her bir agreganın net bir taslağı görülebilir. P1000 pipet uçlarıyla orijinal ortamı her kuyucuktan çıkarın.
10. Dorsomorfin (DM) ve SB-4321542 (SB) ile 0.5 mL nöral indüksiyon ortamı (NIM) steril, kesilmiş P1000 uçları ile her bir oyuğa orta derecede püskürtün. Hemen, ortamda asılı duran agregaları nazikçe pipetleyin ve bunları 10 cm'lik steril bir süspansiyon kültür kabına aktarın. Tüm agregalar aktarılana kadar tekrarlayın. Tritürasyon yapmayın.
11. Toplam hacmi 10 mL/tabağa getirmek için gerektiği kadar ilave NIM + SB/DM ekleyin. Agregaların kendiliğinden füzyonunu önlemek için çanağı 37 °C% 5 CO₂ inkübatörde bir orbital çalkalayıcı üzerine koyun. Aktarım tarihini organoid kültürün 0. günü olarak işaretleyin.
12. 1. Günden sonuna kadar, Tablo 1'deki medya tarifini ve Şekil 9'deki medya değiştirme zaman çizelgesi^1'u takip edin. Özellikle, organoidler 4. günde "dorsal" ve "ventral" olarak adlandırılan iki süspansiyon kültürü kabına ayrılır.
    NOT: Akılda tutulması gereken birkaç önemli zaman noktası: organoid genişlemesi, ortamın EGF/FGF ile Nöral Farklılaşma Ortamına (NDM) geçirildiği 6. günde başlar. Nöronal farklılaşma, 25. günden itibaren NDM + BDNF/NT3 ile desteklenir ve organoidler, 46. günden itibaren büyüme faktörleri olmadan NDM'de tutulur.

2. Viral etiketleme ve asambloidlerin üretilmesi

NOT: Viral etiketleme ^7,9, bir asembloiddeki her bölgeye özgü organoidin kimliğini tanımak ve belirli elektrotlardan assembloid bölgelerine elektrofizyolojik aktivite atamak için önerilir. Her bir MEA kuyusu için yalnızca tek bir organoidin kaplanması en uygunudur. Bu protokol aynı zamanda tek organoid kaplama için de geçerli olabilir.

1. Kullanılacak virüs stoğu ve seyreltme ortamının hacimlerini hesaplayın: Etiketlenecek her organoid için virüslü 200 μL ortam gereklidir. Dorsal organoidler, tipik olarak 1:1000 (v/v) veya yaklaşık 2 x 10¹⁰ vg/mL'lik bir seyreltme oranında pAAV1-CAG-tdTomato ile etiketlenir. Ventral organoidler için 1:300 (h/v) veya 2 x 10¹¹ vg/mL pAAV1-mDLX-GFP virüsü kullanılır.
   NOT: Seyreltmeler istenen etkiye titre edilmelidir ve viral titreden etkilenir.
2. Uygun miktarda ortamı 37 °C'ye ısıtın. Buz üzerinde -80 °C'de saklanan virüs stoğunu çözün. Tüm etiketli organoidleri barındırmak için yeterli sayıda 48 oyuklu plakayı etiketleyin.
3. Kaputuna% 10 çamaşır suyu içeren bir beher koyun. Virüslerle temas eden tüm malzemeleri behere boşaltın. Tamamen çözülmüş virüsleri kültür ortamında "dorsal" ve "ventral" olarak etiketlenmiş ayrı 15 mL konik tüplerde seyreltin.
4. Gün 56 organoidlerini kültür kaplarından 48 oyuklu plakalara taşıyın. Statik kültürde spontan füzyonu önlemek için oyuk başına bir organoid önerilir. Mümkün olduğu kadar çok kalıntı kültür ortamını çıkarın.
5. Her kuyucuğa sırasıyla 200 μL virüs-ortam karışımı ekleyin. Plakaları 37 °C %5 CO₂ inkübatöre geri koyun. Viral partikülleri kuyunun dibine konsantre etmeye ve iletim verimliliğini optimize etmeye yardımcı olmak için plakaları steril boş bir plaka üzerine eğin.
   NOT: Viral partiküller 15 mL'lik konik tüpün dibine batma eğilimindedir, bu nedenle virüsleri her bir oyuğa eklemeden önce ortamla karıştırmak için tüpü sık sık ters çevirmek, tüm organoidler için tek tip transdüksiyon verimliliği sağlamak için çok önemlidir.
6. Ertesi gün (57. Gün), toplam hacmi 1 mL / kuyuya getirmek için her kuyucuğa 800 μL daha kültür ortamı ekleyin.
7. Üç gün sonra (60. gün), etiketli organoidler üzerinde tam bir medya değişikliği yapın. Viral partiküllerle temas eden herhangi bir malzemeyi ağartın.
8. Üç gün sonra (63. gün), epifloresan ters çevrilmiş mikroskop altında floresan ekspresyonunu kontrol edin. Sinyal güçlüyse, asambloidler oluşturmaya başlayın (bkz. adım 2.9).
9. Organoid füzyonu sırasında kalan viral partiküllerin çapraz kontaminasyonunu önlemek için etiketli tüm organoidleri 1 mL / kuyu PBS ile iki kez durulayın. Bir ventral organoidi her bir sırt kuyucuğuna aktarmak için kesilmiş bir P1000 pipet ucu kullanın (veya tam tersi) ve montaj plakasını buna göre yeniden etiketleyin. Daha iyi füzyon için plakaları adım 2.5'teki gibi eğin.
10. Füzyon işleminden 3 gün sonra (66. gün) asambleleri kesintiye uğratmadan yarım hacimli bir ortam değişikliğini dikkatlice gerçekleştirin. Stabil asembloidlerin oluşması genellikle yaklaşık bir hafta sürer (70. gün).

3. Asambloidlerin ön işlem görmüş MEA plakalarına yerleştirilmesi

NOT: Kaplama montajlarından önce MEA plakaların yüzey hazırlama prosedürlerinin tamamlanması en az 4 gün sürer. Zaman kazanmak için, dorsal ve ventral organoidlerin kaynaştırılması (yani, adım 2.9) ve MEA ön tedavisi paralel olarak gerçekleştirilebilir.

1. Yüzey ön işlemi ve kaplama için reaktifler hazırlayın.
   1. % 1 deterjan / enzim çözeltisi hazırlamak için, 0.5 g enzim / deterjan tozunu 50 mL deiyonize suda çözün. Toz tamamen eriyene kadar iyice girdaplayın. Çözeltiyi MEA kuyularına eklemeden önce biyogüvenlik kabininde steril tüp üstü vakum filtresi ile sterilize edin. Her kullanımdan önce taze yapın.
      NOT: Deterjan/enzim, MEA yüzeyini sterilize eder, MEA üretim sürecinden kalan yağları giderir ve yüzeyin hidrofilik bileşik polietilenimin (PEI)¹⁸ ile etkileşimleri teşvik edecek kadar hidrofilik olmasını sağlar.
   2. % 0.07'lik bir PEI çözeltisi¹⁹ hazırlamak için, 1 mL %50 PEI çözeltisini 6 mL 1x borat tamponu ile 15 mL konik bir tüpe karıştırarak bir stok %7 PEI çözeltisi yapmakla başlayın. Nihai çalışma konsantrasyonunu elde etmek için 1 mL stok% 7 PEI çözeltisini 99 mL 1x borat tamponu içinde seyreltin. Sterilizasyon için, kullanmadan önce biyogüvenlik kabinindeki 0,22 μm'lik bir filtre ünitesinden filtreleyin.
      NOT: Pozitif yüklü bir polimer olan PEI, negatif yüklü bir ikincil kaplamanın Bodrum Membran Matrisi (BMM) ve assembloidler²⁰ ile bağlanmasını kolaylaştırmak için birincil kaplama işleminde kullanılır. Stok çözeltisi çok viskoz olduğu için konik tüpe pipetlemek yerine dökerek 1 mL %50 PEI çıkarın. İhtiyaç duyulan miktar, konik bir tüpe tartılarak daha kolay ölçülebilir ve %50 PEI çözeltisinin yoğunluğu 1,08 g/mL'dir. % 7 stok PEI çözeltisi, -20 ° C'de 1 mL alikotlarda bir aya kadar saklanabilir. Sonraki tüm adımları biyogüvenlik kabininde gerçekleştirin.
2. Her bir montajın boyutu göz önüne alındığında, kuyu başına 64 elektrotlu 6 oyuklu MEA plakaları, kuyu başına bir asembloidi barındırmak için kullanılır. Yeterli biyolojik kopyayı sağlamak için deneyler için gereken MEA plakalarının sayısını hesaplayın.
3. Steril bir MEA plakasının her bir oyuğuna 1 mL %1 deterjan/enzim çözeltisi ekleyin. Pipet ucuyla elektrotlara zarar vermemeye dikkat edin. Yıkamalar için vakumlu aspiratör kullanıyorsanız, ucun elektrot dizisine temas etmesine izin vermeyin. 37 °C'lik bir inkübatörde 2 saat inkübe edin.
4. Deterjanı/enzimi çıkarın ve her kuyuyu 1,5 mL steril deiyonize su ile beş kez yıkayın. Deterjan/enzim biyouyumlu olmadığından, kalan kimyasalların tamamen yıkandığından emin olmak önemlidir.
5. Ön koşullandırma için her kuyucuğu 1 mL kültür ortamı ile doldurun. Plakaları 2 gün boyunca 37 °C %5 CO₂ inkübatöre geri koyun. MEA yüzeyinin hücre kültürü koşullarına maruz bırakılması, hücre bağlanmasını teşvik eder.
6. Kültür ortamını çıkarın ve birincil kaplama için her bir oyuktaki MEA elektrotlarını 50 μL% 0.07 PEI çözeltisi ile kaplayın. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
7. PEI çözeltisini tamamen aspire edin. Her kuyuyu 1 mL steril deiyonize su ile yıkayın. Toplamda 3 hızlı yıkama gerçekleştirin. Plakaları oda sıcaklığında kapağı kapalı olarak biyogüvenlik kabininde 15 dakika kurutun.
8. İkincil kaplama için kültür ortamında seyreltilmiş 50 μL 1:20 (h/h) BMM ile her bir oyuktaki elektrot alanını örtün. MEA plakalarını gece boyunca 37 °C inkübatöre geri koyun. Kaplama boyunca yeterli nemi sağlamak için kuyuları çevreleyen bölmelere steril su ekleyin.
9. Ertesi gün, seyreltilmiş BMM'yi bir vakumla aspire edin ve yüzeyde ince bir tabaka bırakın. Kalın bir tabaka oluşmuşsa, bir P1000 pipet ucu kullanarak elektrot temas alanına kültür ortamı ile kuvvetlice püskürtün. Kalın parçaları çıkarmak için gerektiği kadar yıkayın.
   NOT: Artık kalın BMM, hücrelerle elektrot temasını engelleyebilir.
10. Geniş kesilmiş bir P1000 ucu olan bir asambloid toplayın ve mümkün olduğunca az medya aktarırken bir kuyudaki elektrotların üzerine yerleştirin.
11. Bir diseksiyon kapsamı altındaki bir laminer akış başlığında, steril bir diseksiyon iğnesi veya P20 ucu ile assembloid'i hem dorsal hem de ventral organoidlerin çoğunlukla elektrotlarla kaplanabileceği istenen yere dikkatlice itin. Asambloidin etrafındaki sıvıyı çıkarmak için bir P20 ucu kullanın. Bunu tüm asambloidler veya bir alt küme için tekrarlayın, bu birkaç dakika içinde yapılabilir.
    NOT: Pipet ucu ve/veya iğne ile MEA yüzeyine DOKUNMAMAYA veya ÇİZİLMEYEMEYE çalışın. Asembloid'i pipet uçlarıyla dürtmemeye veya yırtmamaya çalışın. Organoidin tamamen kurumasını önlemek için kaplamayı mümkün olduğunca çabuk bitirin.
12. Asambloidleri 37 °C'de 10 dakika inkübe edin (ortam olmadan). Plakaları inkübatörden laminer akış başlığına aktarın ve bir diseksiyon kapsamı altında asambloidlerin üzerine kültür ortamında seyreltilmiş 2-3 küçük damla 1:50 BMM uygulayın. 37 °C'de 30 dakika daha inkübe edin.
13. Bir diseksiyon kapsamı altında asambloidlere yakın 3 damla kültür ortamını dikkatlice ekleyin. Bu, organoidleri nemli tutar. 37 °C'de 1 saat inkübe edin.
    NOT: Montaj sonraki adımlarda hareket eder veya yüzerse, kaplama adım 3.11'den itibaren yeniden başlatılmalıdır.
14. Her saat, bir diseksiyon kapsamı altında her bir oyuğa dikkatlice 20-50 μL hücre kültürü ortamı ekleyin. Bu bir gün boyunca yapılabilir. Hedef, günün sonunda en az 250 μL toplam hacme ulaşmaktır.
15. Ertesi gün, tüm asambleidlerin diseksiyon kapsamı altında yerleşip yerleşmediğini ve stabilize olup olmadığını kontrol edin. Toplam 1 mL/kuyucuk hacmine ulaşmak için fazladan 750 μL kültür ortamı ekleyin. Plakaları en az 2 gün boyunca rahatsız edilmeden bırakın.
16. 500 μL kültür ortamı çıkararak ve 700 μL nörofizyolojik bazal ortam ekleyerek haftalık ortam değişikliklerini dikkatli bir şekilde gerçekleştirin. Eklenen ek ortam hacmi buharlaşmayı hesaba katar ve kullanılan MEA plakasının ne kadar buharlaşmaya sahip olduğuna bağlı olarak ayarlanabilir. MEA kuyularından buharlaşmayı en aza indirmek için kuyuların etrafına gerektiği kadar steril su ekleyin.

4. MEA kaydı ve veri analizi

1. Nörofizyolojik bazal ortama geçtikten yaklaşık bir hafta sonra (genellikle 78. gün civarında) MEA kaydına başlayın.
2. Kayıt odası ayarlanan sıcaklığa (genellikle 37 °C) ulaşana kadar bekleyin. Cihaza bir plaka aktarın ve kayıttan önce en az 5 dakika dengelenmelerine izin verin.
3. Donanım canlı ayarları
   1. Örnekleme frekansını, yani ham voltaj verilerinin kaydedilme hızını ayarlayın. Varsayılan ayar (12,5 kHz) önerilir.
   2. Belirli uygulamalar için donanım bant genişliğini ve kazancını yapılandırmak için analog modu (bu durumda olduğu gibi genellikle Neural Spikes) belirtin. Kayıt sırasında aktivitenin görsel olarak izlenmesi için Spike Detector ve Burst Detector modüllerini kullanın.
      NOT: Analog ayarlar, ham voltaj verilerinin nasıl kaydedildiğini etkiler ve veriler kaydedildikten sonra değiştirilemez.
   3. (İsteğe bağlı) Kayıt verilerine bir donanım dijital filtresi uygulayın. Alçak geçiren filtre seçenekleri arasında 2 kHz veya 3 kHz Kaiser Penceresi bulunur. Varsayılan ayarlar, Analog ayarlar seçildikten sonra değiştirilebilir.
   4. Bu durumda olduğu gibi nöral kayıt için şiddetle tavsiye edilen medyana göre referans vermeye (varsayılan) ayarlayın. Referanslama, kanal gruplarında yaygın olan gürültü girişimini azaltarak düşük genlikli sinyallerin kalitesini artırır.
      NOT: Yukarıdaki parametreler, montajlarda görülen aktiviteye bağlı olarak gerektiği gibi ayarlanabilir, ancak belirli bir deneydeki tüm kayıtlar için tutarlı tutulmalıdır.
4. Plaka haritaları ve açıklamaları ekleyin (gerekirse). Tutarlılığı sağlamak ve toplu veri işlemeyi kolaylaştırmak için aynı plaka için önceki kayıttan plaka haritasını içe aktarın. Dosyaların doğru adlandırıldığından emin olun.
5. Sinyaller iyi görünüyorsa (minimum gürültü ve artefakt), ham verileri kaydedin. Temsili bir örnek için genellikle 2-5 dakikalık kayıt yeterlidir.
6. Deneysel tasarıma bağlı olarak, haftada bir veya iki kez, 5-15 dakika boyunca uzunlamasına elektriksel aktiviteyi kaydedin. Her ortam değişikliğinden hemen sonra elektriksel aktivite düştüğünden, bir sonraki kayıt turuna başlamadan önce her ortam değişikliğinden sonra en az 24 saat bekleyin.
7. (İsteğe bağlı) Elektriksel aktivitenin dorsal ve ventral organoidler arasında lokalize edilmesi ve ayırt edilmesi gerekiyorsa veya her elektrotun aktivitesinin ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyorsa, her kayıttan sonra parlak alan ve epifloresan altında her bir asembloidin bir görüntüsünü elde edin (Şekil 2B).
8. Verileri analiz ederken, ani artış/patlama algılayıcısı ve istatistik derleyicisi dahil olmak üzere bir analiz yapılandırması uygulayın. Ani artış tespiti için taban çizgisinden 5,5-6 standart sapmaya ayarlanmış uyarlanabilir bir eşik kullanın. Ani artışları 100 ms'de ≥5 ani artışla bir etkinlik olarak tanımlayın¹³. Toplam aktif elektrotların %25'inden fazlası 100 ms içinde ateşlendiğinde ve ağ patlaması başına en az 50 ani yükselme olduğunda ağ etkinliğini tanımlayın^13,14.
   NOT: Bu parametreler, belirli bir deneyin ateşleme özelliklerine bağlı olarak modüle edilir. Düşük genlikli ani yükselmeler için hassasiyeti artırmak için, ani yükselme algılaması için uyarlanabilir eşik düşürülebilir. Patlama algılaması için çeşitli yöntemler kullanılabilir ve parametreler, arka plan etkinliğinden önemli ölçüde farklı olan ani artış patlamalarını algılamak için uyarlanabilir. Ağ aktivitesi parametreleri, özellikle montajbloidler tüm elektrot alanını kapsamadığında, daha düşük bir elektrot yüzdesine modüle edilebilir. Boylamsal karşılaştırmalara izin vermek için tüm parametreler bir deney süresince tutarlı kalmalıdır.
9. Kaydedilen verileri yeniden yürütürken toplu işleme için İstatistik Derleyicisi modülünü çalıştırın. Gelişmiş analiz için gelişmiş ölçümleri ve/veya ani artış çıktı dosyalarını dışa aktarın.
   NOT: Gelişmiş ölçüm çıktısı, ortalama ateşleme, patlama ve senkronizasyon için elektrot, kuyu ve grup ortalamalarını içeren .csv dosya içerir. Ani artış çıktısı (.spk dosyası), tüm ani artışlar için dalga biçimi izlerini içerir ve bu izler, ani artış sıralama gibi gelişmiş analiz için diğer platformlara aktarılabilir.

5. Son nokta farmakolojik tahlil ve plaka geri dönüşümü

NOT: İlaç tedavisi tahlilleri, assembloidler yeterince olgunlaştıktan ve elektriksel aktivite zirve yaptıktan sonra yapılabilir. Başlangıç / tedavi öncesi aktivite ve tedavi sonrası aktivitenin kaydedilmesi aynı gün yapılmalıdır.

1. Asamblenin hemen üzerine 1-10 μL ilaç çözeltisi ekleyin ve homojen bir karışım sağlamak için plakayı hafifçe döndürün. Bazı durumlarda ilaç içeren ortamlarda daha uzun inkübasyon süresi önerilir, ör., glutamat / GABA reseptör agonistleri / antagonistleri ile sinaps ile ilişkili ilaç tedavisi testleri (Şekil 2E) (ayrıntılar için Sonuçlar bölümüne bakınız).
   NOT: Nihai bir çalışma konsantrasyonu elde etmek için her bir oyuğa az miktarda ilaç çözeltisi eklenmesi önerilir, çünkü büyük bir hacim değişikliği genel olarak elektriksel aktiviteyi geçici olarak azaltacaktır. İlgilenilen ilaçların çözüldüğü bir aracın eklenmesinin elektrofizyolojik parametrelerde önemli değişikliklere neden olmamasını sağlamak önemlidir.
2. Yeterli PBS yıkaması yapın (tipik olarak 3) ve tedavi sonrası kayıttan sonra ilaçları yıkayın. Elektriksel aktivitenin başlangıç seviyesine dönüp dönmediğini görmek için ilacın yıkanmasından sonraki gün ek bir kayıt yapın.
3. İsteğe bağlı olarak, canlı görüntüleme, tam montajlı immün boyama için %4 paraformaldehit ile fiksasyon veya RNA veya protein ekstraksiyonu için lizis gibi daha fazla deney yapmak için kayıtların sonunda asembloidleri MEA plakasından ayırmak için ortamı kuvvetlice pipetleyin.
4. Analiz amacıyla, her koşul için en az üç teknik ve biyolojik kopya kullanın. Elektrofizyolojik verileri ortalama olarak ifade edin ≥ 3 kopyalar.
5. Deneylerin sonunda plakayı geri dönüştürmek için, ekli asambloidleri çıkardıktan sonra kalan ortamı aspire edin. Steril PBS ile bir kez yıkayın. Metal alanı 200 μL/kuyucuk %0,25 tripsin-EDTA ile tamamen örtün ve plakayı gece boyunca 37 °C'lik bir inkübatöre geri koyun.
6. Ertesi gün, tripsin aspire edin,% 70 steril etanol ile iki kez ve steril deiyonize su ile üç kez yıkayın.
7. Biyogüvenlik kabinindeki plakayı, kapağı kapalıyken veya tamamen kuruyana kadar 15 dakika havayla kurutun. Temizlenmiş plakayı plastik bir torbaya koyun ve ileride kullanana kadar oda sıcaklığında saklayın.
   NOT: İyi temizlenmiş bir MEA plakası, kayıt kalitesini önemli ölçüde kaybetmeden üç kez yeniden kullanılabilir.

Sonuçlar

İnsan dorsal-ventral asambleidleri, her biri 64 elektrot içeren 6 oyuklu bir MEA plakası (diferansiyasyon başına n = 6, 3 diferansiyasyon) üzerine kaplandı (Şekil 2A). Uzunlamasına kayıt için planlanan on assembloidden dokuzu, in vitro olarak 50 günden fazla bir süre boyunca elektrotlara sıkıca bağlandı (Şekil 2D). Farmakolojik tahliller için belirlenen 8 assembloidden...

Tartışmalar

Epilepsinin in vitro modellemesi için iPSC'den türetilmiş assembloidlerde ağ aktivitesinin elektrofizyolojik kayıtları için MEA tabanlı yöntemler kullanılmıştır^22,23. Uyarıcı ve inhibitör sinaptik bağlantıları entegre eden bu önerilen platform, nöronal hipereksitabilitenin mekanizmalarını ve epileptogenez sürecinde kortikal internöronların rolünü ele alma potansiyeline sahiptir. Ek olarak, bu ...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes	Corning	08-772-32	For suspension culture on the shaker
100 mL Beaker	Fisher Scientific	FB100100
100% Ethanol	Fisher Scientific	BP28184-4L
2-Mercaptoethanol (β-ME)	Thermo Fisher	21985023	Working concentration 100 μM
48-well cell culture plate	Fisher Scientific	50-202-140
6-well cell culture plate	Fisher Scientific	07-200-83
Aggrewell 800	Fisher Scientific	501974754
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge	Beckman Coulter	BE-AX14R
Allopregnanolone	Cayman	16930	Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM.
Automated cell counter	Thermo Fisher	AMQAX2000
Axion CytoView MEA 6-well plates	Axion Biosystems	M384-tMEA-6B
Axion Maestro MEA platform	Axion Biosystems	Maestro	With temp environmental control
B-27 supplement (regular, with Vitamin A)	Thermo Fisher	21985023
B-27 supplement (without Vitamin A)	Thermo Fisher	12587010
Basement membrane matrix- Geltrex	Thermo Fisher	A1569601
Bead bath	Fisher Scientific	10-876-001	Isotemp
Benchtop inverted microscope	Olympus	CKX53	Kept in laminar flow clean bench
Bicuculline	Sigma-Aldrich	14340	Working concentration 10 μM
Bleach	CLOROX	67619-26
Borate buffer 20x	Thermo Fisher	28341	Working concentration at 1x
BrainPhys media	StemCell Technologies	5790
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase)	Thermo Fisher	A1110501
Celltron orbital shaker	HT-Infors	I69222
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme)	Sigma-Aldrich	Z273287	Working concentration 1% m/v
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine	Thermo Fisher	113300
DMSO	Sigma-Aldrich	67685
Dorsomorphin	Sigma-Aldrich	P5499	Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM)
D-PBS w/o calcium or magnesium	Thermo Fisher	14190144
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF)	Peprotech	450-10	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
GlutaMAX supplement	Thermo Fisher	35050061
Hemacytometer	Election Microscopy Sciences	63510-20
HEPES	Thermo Fisher	15630080
Heraguard ECO Clean Bench	Thermo Fisher	51029692
Humidity controlled cell culture incubator	Thermo Fisher	370	set to 37 °C, 5% CO2
IWP-2	Selleckchem	S7085	Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use.
Knockout serum replacement (KOSR)	Thermo Fisher	10828010
mTeSRplus (medium + supplements)	StemCell Technologies	100-0276	cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells
N2 supplement	Thermo Fisher	17502048
Neurobasal A	Thermo Fisher	21103049
Non-essential amino acids (NEAA)	Thermo Fisher	11140050
NT3	Peprotech	450-03	Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts	MTI-GlobalStem	GSC-3002
Parafilm	PARAFILM	P7793
Penicilin/Streptomycin	Thermo Fisher	15140122
Pipette (P10, P200, P1000)	Eppendorf	EP4926000034	Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection
Poly (Ethyleneimine) (PEI)	Sigma-Aldrich	P3143	Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript.
Recombinant human epidermal growth factor (EGF)	R&D Systems	236-EG-200	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic	Peprotech	100-18B	Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C.
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02	Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL).
Retinoic acid (RA)	Sigma-Aldrich	R2625	Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM).
ROCK inhibitor Y-27632	Tocris	1254	1:200 from 10 mM stock
SAG (smoothened agonist)	Selleckchem	S7779	Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM).
SB-431542	Tocris	1614	Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM)
Serological pipette filler	Fisher Scientific	14-387-166
Steriflip vacuum tube top filter	Sigma-Aldrich	SE1M179M6
Sterile cell culture hoods	Baker Company	SG-600
Trypan blue solution (0.4%)	Thermo Fisher	15250061
Trypsin-EDTA (0.25%)	Thermo Fisher	25200056
Zoom stereomicroscope	Olympus	SZ61/SZ51	Kept in laminar flow clean bench