A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Method Article
פרוטוקול זה נועד להרכיב ביציבות מכלולים מאוחים גביים-גחונים על מערכים מרובי אלקטרודות לצורך מידול אפילפסיה במבחנה.
אורגנואידים של מוח אנושי הם מבנים תלת-ממדיים (תלת-ממדיים) שמקורם בתאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSCs) המשחזרים היבטים של התפתחות המוח העוברי. המיזוג של הגב עם אורגנואידים במוח הגחון באזור מוגדר במבחנה מייצר assembloids, אשר יש משולבים פונקציונלית microcircuits עם נוירונים מעוררים ומעכבים. בשל מורכבותם המבנית ואוכלוסיית תאי העצב המגוונת שלהם, אסמבלואידים הפכו לכלי שימושי במבחנה לחקר פעילות רשת חריגה. רישומי מערך מרובה אלקטרודות (MEA) משמשים כשיטה ללכידת פוטנציאלים של שדות חשמליים, קוצים ודינמיקת רשת אורכית מאוכלוסיית תאי עצב מבלי לפגוע בשלמות קרום התא. עם זאת, הדבקת מכלולים על האלקטרודות לצורך הקלטות ארוכות טווח יכולה להיות מאתגרת בשל גודלן הגדול ושטח הפנים המוגבל שלהן עם האלקטרודות. כאן, אנו מדגימים שיטה להרכבת מכלולים על לוחות MEA לרישום פעילות אלקטרופיזיולוגית על פני טווח של חודשיים. למרות שהפרוטוקול הנוכחי משתמש באורגנואידים קליפת המוח האנושית, ניתן להתאים אותו באופן נרחב לאורגנואידים המובחנים כדי ליצור מודל לאזורי מוח אחרים. פרוטוקול זה קובע בדיקה אלקטרופיזיולוגית חזקה, אורכית, לחקר התפתחותה של רשת עצבית, ולפלטפורמה זו יש פוטנציאל לשמש בבדיקות סקר תרופתיות לפיתוח טיפולי באפילפסיה.
אורגנואידים של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים (hPSC) שמקורם בתאי גזע הם מבנים תלת-ממדיים המאורגנים באופן מרחבי ומשקפים את ארכיטקטורת הרקמה ואת מסלולי ההתפתחות in vivo. הם מורכבים מסוגי תאים מרובים, כולל אבות (תאי נוירואפיתל, גליה רדיאלית, אבות עצביים, אבות גלייה), נוירונים (נוירונים מעוררים דמויי קליפת המוח ונוירונים מעכבים), ותאי גלייה (אסטרוציטים ואוליגודנדרוציטים)1,2. אסמבלואידים מייצגים את הדור הבא של אורגנואידים במוח, המסוגלים לשלב אזורי מוח מרובים ו / או שושלות תאים בתוך תרבית תלת ממדית. הם מספקים כלי שימושי למידול קשרים בין אזורי מוח שונים הדומים למקביליהם in vivo, לכידת אינטראקציות בין נוירונים ואסטרוציטים כדי לחקות טוב יותר רשתות עצביות בוגרות ומורכבות, ולחקור את הרכבת המעגלים העצביים. לכן, מכלולים הופכים לכלי בשימוש נרחב כדי לשחזר סימני היכר של פתופיזיולוגיה אפילפסיה, שבו אמצעים פונקציונליים נחוצים כדי לחקור רשתות עצביות חריגות שעשויות לעמוד בבסיס הגורם למחלה 3,4,5,6.
כדי למדל אינטראקציות בין נוירונים גלוטמטרגיים בקליפת המוח לבין נוירונים בין-עצביים GABAergic, מספר קבוצות פיתחו אורגנואידים נפרדים הדומים למוח הגבי והגחוני ואז התמזגו יחד למכלול רב-אזורי 7,8,9,10. כאן, פרוטוקול תרבית אסמבלואיד שתואר קודם לכן עם תת-סוגים עצביים ספציפיים לאזוריושם 9. עם זאת, מחסום משמעותי הוא היעדר בדיקות תפקודיות הניתנות לשחזור כדי לנטר את פעילות הרשת העצבית במהלך ההתפתחות העצבית. בדיקות תפקודיות רבות של הרשתות באורגנואידים מניבות תוצאות בעלות שונות גבוהה בין קבוצות של התמיינות וקווי תאים. טכניקות הכרוכות בחיתוך או ניתוק אורגנואידים משנות את הרשתות הטבועות בהן על ידי ניתוק קישוריות סינפטית8.
מערכים מרובי אלקטרודות (MEA) מספקים תצוגה בקנה מידה גדול של פעילות הרשת לאורך זמן עם רזולוציה טמפורלית גבוהה כדי לאפיין תכונות אלקטרופיזיולוגיות של אורגנואידים מבלי להפריע לתנאי התרבית או לשלמות קרום התא11. בהשוואה לאלקטרופיזיולוגיה של מהדק טלאי, MEA מאפשר איסוף נתונים בתפוקה גבוהה המבוסס על אוכלוסיות גדולות של נוירונים ולא על תאים בודדים. פלטפורמות MEA משתנות בצפיפות האלקטרודות שלהן, ומספקות צרכים שונים במחקר אורגנואידים במוח12. המערכות שנמצאות בשימוש נרחב, כפי שמוצג בפרוטוקול זה, רושמות בין 8 ל-64 אלקטרודות לבאר 13,14,15. MEAs בצפיפות גבוהה עם עד 26,400 אלקטרודות לכל באר מאפשרים רזולוציה מרחבית וזמנית מוגברת, כימות מהירות התפשטות פוטנציאל פעולה ושילוב עם גירוי אופטוגנטי 14,16,17. לכן, MEA משמש ככלי רב עוצמה למידול אפילפסיה במבחנה ופרדיגמה תרגומית לבדיקת תרופות נגד פרכוסים.
אתגר מרכזי אחד הוא לייצב את המכלולים הגדולים על משטח מתכת הידרופובי להקלטות ארוכות טווח. פרוטוקול זה מתאר מתודולוגיה מפורטת לציפוי מכלולים שלמים על לוחות MEA לרישום אורכי ארוך טווח יחד עם בדיקות פרמקולוגיות. היתרונות הייחודיים של הפרוטוקול כוללים חיבור יציב של מכלולים למשטח האלקטרודה מבלי לאבד את הפעילות החשמלית, שימוש במדיה בזאלית נוירופיזיולוגית זמינה מסחרית כדי להאיץ את הבשלת הרשת התפקודית לאחר הציפוי, היתכנות לביצוע בדיקות פונקציונליות במורד הזרם כמו טיפול תרופתי, ויישום רחב לאורגנואידים שנוצרו עם פרוטוקולים ספציפיים לאזור אחרים.
המטרה היא לספק בדיקה תפקודית ברזולוציית זמן גבוהה כדי לחקור את פעילות הרשת, לבחון שינויים ספציפיים למחלה ולבדוק תרופות עם פוטנציאל טיפולי באפילפסיה. הוראות וידאו מסופקות עבור השלבים המאתגרים ביותר של פרוטוקול זה, המציגות את הטכניקות לציפוי מכלולים על לוחות MEA, כמו גם הקלטות מייצגות מתרבויות אלה.
כל הליכי הניסוי שהודגמו להלן נערכו בהתאם להנחיות האתיות של מועצת הביקורת המוסדית של בית הספר לרפואה של אוניברסיטת מישיגן וועדת הפיקוח על מחקר תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים. קווי iPSC המשמשים בפרוטוקול זה והניסויים המייצגים נגזרו מפיברובלסטים של עורלה אנושית שהתקבלו ממקור מסחרי. הפרטים של קווי התאים, הריאגנטים והציוד ששימשו במחקר זה מפורטים בטבלת החומרים.
1. גזירה של אורגנואידים ספציפיים לגורל במוח מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים
הערה: פרוטוקול זה מכיל מידע להכנת 3 בארות בצלחת תרבית מיקרווול מ-5 בארות מפגש (~85%) של צלחת בעלת 6 בארות. פרוטוקול תחזוקת iPSC משתנה בהתאם לקווי התא.
2. תיוג ויראלי ויצירת מכלולים
הערה: תיוג ויראלי 7,9 מומלץ לזיהוי הזהות של כל אורגנואיד ספציפי לאזור באסמבלואיד ולהקצאת פעילות אלקטרופיזיולוגית מאלקטרודות ספציפיות לאזורי אסמבלואיד. זה אופטימלי אם רק אורגנואיד אחד מצופה עבור כל MEA באר. פרוטוקול זה יכול לחול גם על ציפוי אורגנואיד יחיד.
3. הנחת מכלולים על לוחות MEA שטופלו מראש
הערה: לוקח לפחות 4 ימים להשלים את הליכי הכנת פני השטח של לוחות MEA לפני ציפוי מכלולים. כדי לחסוך זמן, ניתן לבצע במקביל איחוי אורגנואידים גביים וגחונים (כלומר, שלב 2.9) וטיפול מקדים MEA.
4. רישום MEA וניתוח נתונים
5. בדיקה פרמקולוגית בנקודת קצה ומיחזור צלחות
הערה: ניתן לבצע בדיקות טיפול תרופתי לאחר שהמכלולים בוגרים מספיק והפעילות החשמלית מגיעה לשיא. רישום הפעילות הבסיסית/לפני הטיפול והפעילות שלאחר הטיפול צריך להתבצע באותו היום.
מכלולים גביים-גחונים אנושיים צופו על לוח MEA בעל 6 בארות (n = 6 לכל הבחנה, 3 התבדלויות), כאשר כל באר הכילה 64 אלקטרודות (איור 2A). תשעה מתוך עשרה מכלולים שתוכננו לרישום אורכי היו מחוברים היטב לאלקטרודות במשך יותר מ-50 יום במבחנה (אי...
שיטות מבוססות MEA לרישומים אלקטרופיזיולוגיים של פעילות הרשת במכלולים שמקורם ב- iPSC שימשו למידול חוץ גופי של אפילפסיה22,23. לפלטפורמה מוצעת זו המשלבת קשרים סינפטיים מעוררים ומעכבים יש פוטנציאל לטפל במנגנונים של רגישות יתר עצבית ובתפקיד ?...
למחברים אין גילויים רלוונטיים.
כתב יד זה נתמך על ידי R01NS127829 NIH/NINDS (LTD). איור 1 נוצר באמצעות biorender.com.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
10 cm Corning Non TC-treated culture dishes | Corning | 08-772-32 | For suspension culture on the shaker |
100 mL Beaker | Fisher Scientific | FB100100 | |
100% Ethanol | Fisher Scientific | BP28184-4L | |
2-Mercaptoethanol (β-ME) | Thermo Fisher | 21985023 | Working concentration 100 μM |
48-well cell culture plate | Fisher Scientific | 50-202-140 | |
6-well cell culture plate | Fisher Scientific | 07-200-83 | |
Aggrewell 800 | Fisher Scientific | 501974754 | |
Allegra X-14R Refrigerated Centrifuge | Beckman Coulter | BE-AX14R | |
Allopregnanolone | Cayman | 16930 | Suspended 5mg into DMSO to get 1 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:10,000 for use. Working concentration 100 nM. |
Automated cell counter | Thermo Fisher | AMQAX2000 | |
Axion CytoView MEA 6-well plates | Axion Biosystems | M384-tMEA-6B | |
Axion Maestro MEA platform | Axion Biosystems | Maestro | With temp environmental control |
B-27 supplement (regular, with Vitamin A) | Thermo Fisher | 21985023 | |
B-27 supplement (without Vitamin A) | Thermo Fisher | 12587010 | |
Basement membrane matrix- Geltrex | Thermo Fisher | A1569601 | |
Bead bath | Fisher Scientific | 10-876-001 | Isotemp |
Benchtop inverted microscope | Olympus | CKX53 | Kept in laminar flow clean bench |
Bicuculline | Sigma-Aldrich | 14340 | Working concentration 10 μM |
Bleach | CLOROX | 67619-26 | |
Borate buffer 20x | Thermo Fisher | 28341 | Working concentration at 1x |
BrainPhys media | StemCell Technologies | 5790 | |
Cell dissociation reagent (StemPro Accutase) | Thermo Fisher | A1110501 | |
Celltron orbital shaker | HT-Infors | I69222 | |
Detergent/enzyme (Terg-A-Zyme) | Sigma-Aldrich | Z273287 | Working concentration 1% m/v |
DMEM/F12 + HEPES/L-Glutamine | Thermo Fisher | 113300 | |
DMSO | Sigma-Aldrich | 67685 | |
Dorsomorphin | Sigma-Aldrich | P5499 | Dissolve 5mg into DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:2000 for use. (working concentration 5 μM) |
D-PBS w/o calcium or magnesium | Thermo Fisher | 14190144 | |
Glial cell line-derived neurotrophic (GDNF) | Peprotech | 450-10 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
GlutaMAX supplement | Thermo Fisher | 35050061 | |
Hemacytometer | Election Microscopy Sciences | 63510-20 | |
HEPES | Thermo Fisher | 15630080 | |
Heraguard ECO Clean Bench | Thermo Fisher | 51029692 | |
Humidity controlled cell culture incubator | Thermo Fisher | 370 | set to 37 °C, 5% CO2 |
IWP-2 | Selleckchem | S7085 | Aliquot and freeze at −80 °C. It will precipitate if thawed at room temp. Frozen aliquots should be placed directly into 37 °C before use. |
Knockout serum replacement (KOSR) | Thermo Fisher | 10828010 | |
mTeSRplus (medium + supplements) | StemCell Technologies | 100-0276 | cGMP, stabilized feeder-free medium for human iPSC cells |
N2 supplement | Thermo Fisher | 17502048 | |
Neurobasal A | Thermo Fisher | 21103049 | |
Non-essential amino acids (NEAA) | Thermo Fisher | 11140050 | |
NT3 | Peprotech | 450-03 | Dissolve 100 μg in 1mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
NuFF Human neonatal foreskin fibroblasts | MTI-GlobalStem | GSC-3002 | |
Parafilm | PARAFILM | P7793 | |
Penicilin/Streptomycin | Thermo Fisher | 15140122 | |
Pipette (P10, P200, P1000) | Eppendorf | EP4926000034 | Autoclaved cut P1000 tips for organoid collection |
Poly (Ethyleneimine) (PEI) | Sigma-Aldrich | P3143 | Dilute stock in sterile borate buffer. Working concentration 0.07%. See details in manuscript. |
Recombinant human epidermal growth factor (EGF) | R&D Systems | 236-EG-200 | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant Human fibroblast growth factor (FGF)-basic | Peprotech | 100-18B | Suspended in PBS. Aliquot and freeze at -20 °C. |
Recombinant human-brain-derived neurotrophic factor (BDNF) | Peprotech | 450-02 | Centrifuge briefly before reconstitution. Dissolve 100 μg in 1 mL of PBS to 100 μg/mL. Aliquot and freeze at −20 °C. Dilute at 1:5000 for use. (working concentration 20 ng/mL). |
Retinoic acid (RA) | Sigma-Aldrich | R2625 | Dissolve 100 mg into 3.3 mL of DMSO to get 100 mM stock solution. Aliquot the stock 100 μL/tube and freeze at −80 °C. Take 200 μL of 100 mM stock and dilute 10x (add 1.8 mL of DMSO) to make 10 mM stock. Aliquot 50 μL/tube and store at −80 °C. Dilute at 1:100,000 for use. (working concentration 100 nM). |
ROCK inhibitor Y-27632 | Tocris | 1254 | 1:200 from 10 mM stock |
SAG (smoothened agonist) | Selleckchem | S7779 | Aliquot and freeze at −80 °C. Stock concentration 1mM. Use at 1:10,000 dilution (working concentration 100 nM). |
SB-431542 | Tocris | 1614 | Dissolve 5mg into 1.3 mL of DMSO to get 10 mM stock solution. Aliquot and freeze at −80 °C. Dilute at 1:1000 for use. (working concentration 10 μM) |
Serological pipette filler | Fisher Scientific | 14-387-166 | |
Steriflip vacuum tube top filter | Sigma-Aldrich | SE1M179M6 | |
Sterile cell culture hoods | Baker Company | SG-600 | |
Trypan blue solution (0.4%) | Thermo Fisher | 15250061 | |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher | 25200056 | |
Zoom stereomicroscope | Olympus | SZ61/SZ51 | Kept in laminar flow clean bench |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved