في الجسم الحي مراقبة نشاط النسخ أثناء الانتقال الأيضي باستخدام مراسل الإضاءةالأحيا في الخميرة

Summary

يستخدم هذا البروتوكول مراسلا حيويا ، مما يسمح بقياسات نشاط النسخ في خميرة الخميرة eubayanus لمراقبة انتقال الجلوكوز إلى المالتوز ، مما يتيح التحليل في الوقت الفعلي للتكيفات الأيضية ودعم تحسين الإجهاد للتخمير الصناعي في ظل ظروف متنوعة.

Abstract

يمثل الاستهلاك المتسلسل للسكر ، من مصدر السكر المفضل إلى مصدر أقل تفضيلا ، تكيفا استقلابيا حاسما في الخميرة ، وهو أمر مهم بشكل خاص للبقاء على قيد الحياة في البيئات المتقلبة مثل تلك الموجودة في تخمير البيرة. ومع ذلك ، فإن تحولات السكر هي متغير بيئي يصعب التنبؤ به واكتشافه ، مما يؤثر على نتيجة تخمير البيرة. يصف هذا البروتوكول نظاما في الجسم الحي لمراقبة تنشيط النسخ المرتبط بالتحول الأيضي من الجلوكوز إلى المالتوز في خميرة الخميرة eubayanus التي تنطبق على سلالات خميرة الخميرة البرية المختلفة.

يستخدم النظام مراسل نسخ عرضي للضوء الحيوي لعملية التمثيل الغذائي المالتوز ، مع التركيز على MAL32 ، لأنه يوفر قراءة جيدة للتحولات الأيضية ، كما تمت دراستها في S. cerevisiae. لهذا الغرض ، تم تحويل سلالات الخميرة مع البلازميدات التي تحتوي على المنطقة التنظيمية MAL32 من S. eubayanus ، مما يتحكم في التعبير عن ترميز الجين لنسخة غير مستقرة من اليراع لوسيفيراز¹ ، وجين مقاومة للهيجروميسين يستخدم حصريا أثناء التحول لضمان اكتساب البلازميد. بعد الاختيار ، يمكن زراعة خلايا الخميرة المحولة في ظل ظروف غير انتقائية ، حيث يظل البلازميد العرضي مستقرا في ظروف الثقافة لمدة تصل إلى 7 أيام.

تم التحقق من صحة هذا النظام في ظل بيئة سكر معقدة في فحوصات التخمير الدقيق ، مما يؤكد فعالية مراسل لوسيفيراز في إعلام التحولات الأيضية. تم جمع العينات بانتظام وتحليلها باستخدام مقياس الإضاءة ، مما يوفر رؤى مستمرة لاستجابات الخميرة. على الرغم من أن هذا البروتوكول قابل للتطبيق على نطاق واسع ، إلا أنه ذو قيمة خاصة لتقييم أداء الخميرة في ظل ظروف التخمير ، حيث تشكل التغيرات الأيضية تحديا كبيرا. بالإضافة إلى ذلك ، يمكن تكييف هذه المنهجية عن طريق اختيار مروجين بدائل لاستكشاف مجموعة واسعة من الاستجابات للتغيرات البيئية ، مما يسمح بتوصيف سلالات الخميرة البرية وتحسينها للتطبيقات الصناعية المتنوعة.

Introduction

يجب أن تتكيف الكائنات الحية الدقيقة مثل الخمائر باستمرار مع الظروف البيئية الديناميكية للحفاظ على اللياقة البدنية والبقاء^{على قيد الحياة 1}. غالبا ما تتضمن هذه التعديلات دوائر تنظيمية جينية معقدة تدمج إشارات متعددة خارج الخلية لتنسيق الاستجابات الأيضية الدقيقة^2،3. في البيئات الصناعية ، تعد كفاءة هذه التحولات الأيضية أمرا بالغ الأهمية ، لا سيما في عمليات التخمير حيث يمكن أن تؤدي الاضطرابات إلى عوائد دون المستوى الأمثل أو تخمير غير مكتمل³. يتمثل التحدي الأيضي الرئيسي الذي يجب التغلب عليه في عندما تنتقل الخلايا من مصدر الكربون المفضل إلى مصدر الكربون الثانوي ، مثل تحول الجلوكوز إلى المالتوز. تقدم هذه العملية مرحلة تأخر يتم خلالها تقليل الجنات المطلوبة لعملية التمثيل الغذائي لمصادر الكربون الثانوية ، مما يتيح استئناف النمو^4،5.

في التخمير ، يجب أن تنتقل خميرة الخميرة بكفاءة من استقلاب الجلوكوز إلى استقلاب المالتوز. على وجه الخصوص ، S. eubayanus ، الأنواع الأبوية التي تتحمل البرد من خمائر الجعة ، تظهر تباينا ظاهريا كبيرا في قدرتها على التكيف مع مثل هذه التحولات⁶. غالبا ما تظهر العزلات البرية ، مثل تلك الموجودة في باتاغونيا ، مراحل تأخر طويلة واستهلاك أبطأ للمالتوز مقارنة بالسلالات المستأنسة ، والتي تم اختيارها لقدراتها التخميرية المحسنة^7،8. في حين أن السلالات المستأنسة قد تكيفت لتخمير بيئات السكر المختلط بكفاءة ، غالبا ما تظهر السلالات البرية تحولا أيضيا أبطأ ، ربما بسبب قمع أقوى للجلوكوز والتنظيم المتغير لموضع MAL ^6،9.

تستخدم هذه الدراسة التباين الطبيعي ل S. eubayanus كنموذج للتحقيق في التكيفات الأيضية في ظل ظروف الجلوكوز إلى المالتوز ، والاستفادة من مراسل لوسيفيراز غير مستقر لمراقبة التعبير الجيني في الجسم الحي ، من خلال تتبع اللمعان¹. يقوم المراسل المختار MAL32 بتشفير بروتين المالتاز ، وهو إنزيم محوري لتقويض المالتوز أثناء انتقالات الجلوكوز إلى المالتوز^10،11. من اللافت للنظر أن محفز MAL32 يمثل علامة ناجحة لتقييم تحريض استقلاب المالتوز بعد استنفاد الجلوكوز¹². من خلال دمج نظام المراسل هذا ، هدفنا إلى توضيح آليات التكيف الخاصة بالسلالة وتحديد الأهداف المحتملة لتحسين أداء التخمير. علاوة على ذلك ، يمكن توسيع هذا البروتوكول إلى ما هو أبعد من التخمير ، ويقدم تطبيقات في التكنولوجيا الحيوية والدراسات البيئية حيث تلعب بيئات السكر المعقدة دورا مهما. إن فهم المحددات الجينية والتنظيمية للاستجابات البيئية المتقلبة في S. eubayanus يعزز معرفتنا بفسيولوجيا الخميرة ، مما يدعم تطوير سلالات قوية للتطبيقات الصناعية والبحثية المتنوعة.

Protocol

1. بناء المراسلين العرضيين

ملاحظة: اخترنا منطقة تنظيمية للمراسلين بناء على أدبيات الخميرة لبناء البلازميد العرضي لمراقبة استهلاك المالتوز^6،11،12. تم تعريف محفز الجين المراسل المرشح على أنه التسلسل التنظيمي مباشرة من المنبع المرشح إلى النيوكليوتيدات التي تحيط ب ORF المجاور. تم تضخيم هذه المنطقة من الحمض النووي الجيني ل S. eubayanus CBS12357 سلالة^{مرجعية T 10}. يضمن هذا النهج البناء عالي الدقة للبلازميدات العرضية المناسبة للتطبيقات النهائية ، بما في ذلك دراسة الظروف الأخرى المثيرة للاهتمام في الخميرة.

1. صمم شظايا الحمض النووي والبادئات المتداخلة لتشمل 30 تسلسلا من تسلسل إقران النيوكليوتيدات بين الأجزاء لتجميع سلس عبر استنساخ إعادة تركيب الخميرة¹³ (الشكل 1). انظر الجدول التكميلي S1 للحصول على تسلسلات التمهيدي.
2. لتجنب الطفرات ، قم بتضخيم منطقة المروج (انظر أعلاه) ، بالإضافة إلى أشرطة لوسيفيراز غير المستقرة (LUC-PEST) و hphMX ¹ باستخدام بوليميراز الحمض النووي عالي الدقة (راجع الشركة المصنعة للبوليميراز للحصول على تفاصيل البروتوكول). اضبط جهاز التدوير الحراري على 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق للتمسخ الأولي ، متبوعا ب 30 دورة من التمسخ 98 درجة مئوية ، والتلدين 60 درجة مئوية ، وتمديد 72 درجة مئوية ؛ أكمل البروتوكول بتمديد نهائي عند 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
   ملاحظة: عند استخدام بلازميدات مكوك الخميرة كقوالب ل PCR ، يوصى بإخضاع تفاعلات Amplicon لهضم DpnI (انظر بروتوكول الشركة المصنعة للإنزيم) للتخلص من أي آثار لقالب البلازميد التي قد تتداخل مع تحول الخميرة.
3. قم بهضم العمود الفقري pRS426 البلازميد¹⁴ باستخدام إنزيمات تقييد EcoRI و XhoI لخطية الناقل ، وقطعه في موقع الاستنساخ المتعدد ، وإعداده لإعادة التركيب (راجع بروتوكول الشركة المصنعة للإنزيم).
4. امزج العمود الفقري الخطي pRS426 مع شظايا الحمض النووي المضخم وقم بتحويل الخليط إلى خميرة الخميرة BY4741 باستخدام استنساخ إعادة تركيب الخميرة^13،15 للسماح لآلية إعادة التركيب المتماثلة للخميرة بتجميع بنية البلازميد في الجسم الحي.
5. قم بلوحة الخميرة المحولة على وسط اصطناعي كامل (SC) يفتقر إلى اليوراسيل (SC-URA) لاختيار المحولات التي تحتوي على المتجه الجديد pRS426- MAL32-LUC-hphMX البلازميد.
6. استخرج البلازميدات من الخميرة باستخدام مجموعة تحضير الخميرة المصغرة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة وقم بتحويل البلازميد المستخرج إلى الإشريكية القولونية DH5α لتضخيم البناء لمزيد من التحليلات.
7. فحص المستعمرات البكتيرية عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل لتأكيد التجميع الصحيح للتركيبات.
8. قم بتنقية الحمض النووي البلازميد باستخدام مجموعة تنقية البلازميد القياسية وقم بإجراء تسلسل سانجر للتحقق من سلامة وتسلسل البلازميدات المجمعة.

2. تحويل سلالات الخميرة

ملاحظة: تم تكييف بروتوكول تحويل الخميرة من طريقة تم إنشاؤها مسبقا ل S. eubayanus¹⁶ وتم تطبيقه بنجاح على أنواع الخميرة الأخرى وسلالات الخميرة المخمرة. تم اشتقاق هذا البروتوكول من طريقة تحويل الخميرة التقليدية من Gietz Lab¹⁵. يتيح هذا النهج تكامل البلازميد الفعال والاختيار في ظل ظروف تجريبية متنوعة ، مما يوفر طريقة قوية ومرنة لتحويل سلالات الخميرة المختلفة. إنه يضمن اختيارا موثوقا وصيانة للبلازميد العرضي تحت ضغط الهيغروميسين.

1. استزراع مستعمرة واحدة من الخميرة الطازجة في 5 مل من YPD (1٪ وزن / حجم مستخلص الخميرة ، 2٪ وزن / حجم البيبتون ، 2٪ وزن / حجم الجلوكوز) عند 20 درجة مئوية عند 200 دورة في الدقيقة من التحريك بين عشية وضحاها.
2. قم بتخفيف المزرعة إلى OD₆₂₀ من 0.2 في وسط YPD الطازج واحتضانه عند 20 درجة مئوية مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة حتى منتصف مرحلة السجل (OD₆₂₀ 0.4-0.6). اعتمادا على سلالة الخميرة ، يتطلب هذا عادة 3-4 ساعات.
3. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 21,380 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة ، وتخلص من المادة الطافية ، واغسل الحبيبات 3x بالماء المعقم.
4. أعد تعليق الخلايا المغسولة في 100 ميكرولتر من أسيتات الليثيوم 0.1 M ، جهاز طرد مركزي كما هو موضح في الخطوة 2.3 ، وكرر العملية 2x.
5. أضف المكونات التالية إلى الخلايا بهذا الترتيب: 240 ميكرولتر من 50٪ وزن / حجم PEG-4000 ، 35 ميكرولتر من 1 M LiAc ، 5 ميكرولتر من الحمض النووي البلازميد (100 نانوغرام / ميكرولتر) ، 20 ميكرولتر من الحمض النووي الحامل أحادي الشريطة (ssDNA) تم تسخينه مسبقا عند 98 درجة مئوية لمدة 10 دقائق. تخلط بلطف لتجانس خليط التحول.
6. احتضان الخليط على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة ، متبوعا بصدمة حرارية عند 34 درجة مئوية لمدة 55 دقيقة. بعد الصدمة الحرارية ، أضف 38 ميكرولتر من الإيثانول بنسبة 100٪ إلى التركيز النهائي بنسبة 0.1٪ تقريبا واحتضنه لمدة 5 دقائق إضافية عند 34 درجة مئوية.
   ملاحظة: تم تحسين درجات الحرارة المستخدمة في هذا البروتوكول ل Saccharomyces eubayanus ، وهي سلالة متحملة للتبريد معزولة عن الغابات المعتدلة.
   مطلوب استخدام الإيثانول بنسبة 100٪ للحث على الإجهاد الخلوي ، مما يعزز كفاءة بروتوكول التحول.
7. أضف 600 ميكرولتر من YPD إلى الخلايا المحولة ، وجهاز الطرد المركزي كما في الخطوة 2.3 ، وتخلص من المادة الطافية.
8. أعد تعليق حبيبات الخلية في 600 ميكرولتر من YPD الطازج واحتضان التعليق دون تحريض طوال الليل عند 4 درجات مئوية للسماح بالاسترداد.
9. قم بلوحة الخلايا المحولة على أجار YPD المكملة ب 200 ميكروغرام / مل هيغروميسين واحتضانها عند 20 درجة مئوية -30 درجة مئوية لمدة 48-72 ساعة.
10. حدد 10-12 مستعمرة من ألواح التحويل وأعد خطها على أجار YPD الذي يحتوي على 200 ميكروغرام / مل من hygromycin لضمان وجود البلازميد وإنشاء رقعة مختلطة من المستعمرات المختارة لمزيد من الاستخدام.

3. التحقق من صحة التلألؤ

ملاحظة: للتحقق من صحة وظائف المراسلين المضيئين ، تم اختبار السلالات المحولة في ظل ظروف مصممة للحث على التعبير التفاضلي لمراسل لوسيفيراز. يسمح هذا التحقق التدريجي بتقييم وظائف المراسل في ظل ظروف السكر المتقلبة ، والاستفادة من متانة المقايسات المضيئة لالتقاط الاستجابات الأيضية في الوقت الفعلي.

1. اختر عينة من رقعة سلالة الخميرة المحولة وقم بتلقيحها في وسط YP (1٪ وزن / حجم مستخلص الخميرة ، 2٪ وزن / حجم بيبتون) تحتوي على 5٪ وزن / حجم جلوكوز و 200 ميكرومتر هيجروميسين. احتضان عند 25 درجة مئوية دون اهتزاز لمدة 24 ساعة. قم بتحديث الثقافات في وسط طازج عند تخفيف 1:10 واحتضانها في نفس الظروف لمدة 24 ساعة أخرى.
2. اغسل الخلايا بوسط YP بدون سكر وقم بتلقيحها في وسائط الاختبار عند تخفيف 1:10. يتم استكمال وسائط الاختبار باللوسيفيرين إلى تركيز نهائي يبلغ 3 ملي مولار وتحتوي على 200 ميكرومتر هيغروميسين للحفاظ على استقرار البلازميد.
3. لاختبار نمو السكر المختلط ، استخدم مصفوفة الجلوكوز والمالتوز بالتركيزات التالية (٪ وزن / حجم): الجلوكوز (0٪ ، 0.5٪ ، 1٪ ، 2٪) والمالتوز (0٪ ، 2٪ ، 5٪ ، 10٪ ، 20٪ ، 30٪) في وسط YP. يتم استكمال كل حالة باللوسيفيرين (التركيز النهائي 3 ملي مولار) و 200 ميكرومتر هيغروميسين. قم بتوزيع 200 ميكرولتر من الثقافة في كل بئر من صفيحة 96 بئرا (الشكل 2).
4. قم بقياس اللمعان و OD₆₂₀ كل 30 دقيقة لمدة 72 ساعة باستخدام قارئ لوحة مقياس الإضاءة ، دون توهين و 1 ثانية من وقت التكامل ، مما يضمن نشاط المراسل المستمر ومراقبة كثافة الخلية.

4. أخذ عينات التخمير ومراقبة التلألؤ

ملاحظة: تعرضت السلالات المحولة لظروف تخمير دقيق خاضعة للرقابة لتقييم تنشيط التلألؤ أثناء التخمير. يتيح ذلك مقارنة تنشيط التلألؤ عبر ظروف التخمير المختلفة ، مما يوفر رؤى حول استجابات التمثيل الغذائي للخميرة خلال فترات التخمير الممتدة.

1. تحضير وسط مستخلص الشعير (12 درجة أفلاطون) عن طريق إذابة مستخلص الشعير في الماء وتعقيمه عند 100 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة. اترك الوسط يبرد إلى درجة حرارة الغرفة قبل التلقيح.
2. سلالات الخميرة المحولة قبل الزراعة في 5 مل من YPD (1٪ وزن / حجم مستخلص الخميرة ، 2٪ وزن / حجم البيبتون ، 2٪ وزن / حجم الجلوكوز) عند 20 درجة مئوية مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة. انقل الزراعة المسبقة إلى 50 مل من وسط مستخلص الشعير. احتضان المزرعة عند 20 درجة مئوية مع التحريك عند 200 دورة في الدقيقة لمدة 24 ساعة.
3. احصد الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 21،380 × جم لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة وأعد تعليقها لتحضير ثلاث نسخ 50 مل من التخمير الدقيق في 12 درجة وسط مستخلص الشعير^{أفلاطون 9}. لتحسين أداء التخمير ، استكمل الوسط ب 0.3 مجم / لتر ZnCl₂.
4. لضمان كثافة الخلايا المتسقة عبر التكرارات ، احسب حجم اللقاح باستخدام الصيغة:
   حجم اللقاح = (1.5 × 10⁶) × الحجم (مل) × درجة أفلاطون
5. تلقيح الوسط المحضر واحتضان المزارع عند 20 درجة مئوية دون رج لمدة 14 يوما. راقب تقدم التخمير عن طريق تسجيل فقدان ثاني أكسيد الكربون₂ يوميا. قم بوزن الأوعية في وقت واحد كل يوم لقياس فقدان الوزن التراكمي كمؤشر_لإنتاج ثاني أكسيد الكربون.
6. لمراقبة التلألؤ ، قم بأخذ عينة دورية من 200 ميكرولتر من كل تخمير دقيق. أضف لوسيفيرين إلى العينات لتحقيق تركيز نهائي قدره 3 ملي مولار وقياس اللمعان و OD₆₂₀ باستخدام قارئ لوحة مقياس الإضاءة دون توهين و 1 ثانية من وقت التكامل. قم بإجراء القياسات على فترات زمنية محددة طوال فترة التخمير (الشكل 3).

النتائج

توضح النتائج التالية قابلية استخدام مراسل الإنارة الذي تم إنشاؤه حديثا لمراقبة انتقال الجلوكوز إلى المالتوز في خلايا الخميرة في عملية تخميرية. يتم تجميع بلازميدات المراسل في البداية باستخدام استنساخ إعادة تركيب الخميرة¹³ لإنشاء تركيبات مراسل عرضي. تتطلب ه...

Discussion

توضح هذه الدراسة فعالية مراسل التلألؤ الحيوي العرضي لمراقبة تنشيط النسخ في S. eubayanus تحت التحولات الأيضية. من خلال استخدام MAL32 كمراسل نسخ¹¹ ، يمكننا تتبع التحولات الأيضية الرئيسية في الوقت الفعلي ، مما يوفر إطارا قويا لفهم التكيفات الخاصة بالسلالة. ي?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001