В естественных условиях Мониторинг транскрипционной активности при метаболическом переходе с помощью биолюминесцентного репортера у дрожжей

Резюме

В этом протоколе используется биолюминесцентный репортер, позволяющий измерять транскрипционную активность у Saccharomyces eubayanus для мониторинга перехода от глюкозы к мальтозе, что позволяет анализировать метаболические адаптации в режиме реального времени и поддерживает оптимизацию штамма для промышленной ферментации в различных условиях.

Аннотация

Последовательное потребление сахара, от предпочтительного источника сахара к менее предпочтительному, представляет собой критическую метаболическую адаптацию дрожжей, которая особенно важна для выживания в колеблющихся средах, таких как те, которые обнаруживаются при брожении пива. Тем не менее, переход сахара — это переменная окружающей среды, которую сложно предсказать и обнаружить, что влияет на исход брожения пива. Этот протокол описывает систему in vivo для мониторинга активации транскрипции, связанной с метаболическим сдвигом глюкозы в мальтозу у Saccharomyces eubayanus , который применяется к различным диким штаммам дрожжей Saccharomyces .

Система использует эписомальный биолюминесцентный транскрипционный репортер для метаболизма мальтозы, фокусируясь на MAL32, поскольку он обеспечивает хорошее считывание метаболических сдвигов, изученных у S. cerevisiae. Для этого штаммы дрожжей трансформировали с помощью плазмид, содержащих регуляторную область MAL32 от S. eubayanus, контролирующую экспрессию гена, кодирующего дестабилизированную версию люциферазы светлячка¹, и гена устойчивости к гигромицину, используемого исключительно во время трансформации для обеспечения приобретения плазмид. После отбора трансформированные дрожжевые клетки могут быть культивированы в неселективных условиях, так как эписомальная плазмида остается стабильной в условиях культивирования до 7 дней.

Эта система была валидирована в сложной сахарной среде в анализах микроферментации, подтвердив эффективность репортера люциферазы в информировании метаболических переходов. Образцы регулярно собирали и анализировали с помощью люминометра, что обеспечивало непрерывное понимание реакции дрожжей. Несмотря на широкое применение, этот протокол особенно ценен для оценки производительности дрожжей в условиях брожения, где метаболические изменения представляют собой значительную проблему. Кроме того, эта методология может быть адаптирована путем выбора альтернативных промоторов для изучения более широкого спектра реакций на изменения окружающей среды, что позволяет характеризировать и оптимизировать штаммы диких дрожжей для различных промышленных применений.

Введение

Микроорганизмы, такие как дрожжи, должны постоянно адаптироваться к динамическим условиям окружающей среды, чтобы поддерживать физическую форму и выживать¹. Эти адаптации часто включают в себя сложные генные регуляторные цепи, интегрирующие множественные внеклеточные сигналы для организации точных метаболических реакций ^2,3. В промышленных условиях эффективность этих метаболических переходов имеет решающее значение, особенно в процессах ферментации, где сбои могут привести к неоптимальным выходам или незавершенной ферментации³. Ключевой метаболической проблемой, которую необходимо преодолеть, является переход клеток от предпочтительного к вторичному источнику углерода, например, сдвиг глюкозы в мальтозу. Этот процесс вводит фазу задержки, во время которой гены, необходимые для метаболизма вторичных источников углерода, подавляются, что позволяет возобновить^рост4,5.

В пивоварении дрожжи Saccharomyces должны эффективно переходить от метаболизма глюкозы к метаболизму мальтозы. В частности, S. eubayanus, холодоустойчивый родительский вид лагерных дрожжей, демонстрирует существенную фенотипическую изменчивость в своей способности приспосабливаться к таким переходам⁶. Дикие изоляты, такие как изоляты из Патагонии, часто демонстрируют более длительные фазы задержки и более медленное потребление мальтозы по сравнению с одомашненными сортами, которые были отобраны за их оптимизированные ферментативные способности ^7,8. В то время как одомашненные штаммы адаптировались к эффективной ферментации в смешанной сахарной среде, дикие штаммы часто демонстрируют более медленный метаболический переход, потенциально из-за более сильного подавления глюкозы и вариабельной регуляции локуса MAL ^6,9.

В этом исследовании используется естественная изменчивость S. eubayanus в качестве модели для изучения метаболических адаптаций в условиях глюкозо-мальтозы, используя эписомальный дестабилизированный репортер люциферазы для мониторинга экспрессии генов in vivo путем отслеживания люминесценции¹. Выбранный репортер MAL32 кодирует белок мальтазу, ключевой фермент для катаболизма мальтозы во время переходов от глюкозы к мальтозе^10,11. Примечательно, что промотор MAL32 представляет собой успешный маркер для оценки индукции метаболизма мальтозы после^{истощения} глюкозы. Внедрив эту систему отчетности, мы стремились выяснить специфические для штамма адаптивные механизмы и определить потенциальные цели для оптимизации производительности ферментации. Кроме того, этот протокол может быть расширен за пределы пивоварения, предлагая применение в биотехнологиях и экологических исследованиях, где сложные сахарные среды играют значительную роль. Понимание генетических и регуляторных детерминант флуктуантных реакций окружающей среды у S. eubayanus расширяет наши знания в области физиологии дрожжей, способствуя разработке надежных штаммов для различных промышленных и исследовательских применений.

протокол

1. Построение эпизодических репортеров

ПРИМЕЧАНИЕ: Мы выбрали репортерную регуляторную область на основе дрожжевой литературы для построения эписомальной плазмиды для мониторинга потребления мальтозы ^6,11,12. Промотор гена-репортера-кандидата определяли как регуляторную последовательность, находящуюся непосредственно перед кандидатом ORF до нуклеотида, фланкирующего соседний ORF вверх по потоку. Этот участок был амплифицирован из геномной ДНК S. eubayanus CBS12357 референсного штамма^{T 10}. Такой подход обеспечивает высокоточное конструирование эписомальных плазмид, пригодных для последующих применений, включая изучение других интересных условий в дрожжах.

1. Спроектируйте фрагменты ДНК и перекрывающиеся праймеры таким образом, чтобы они включали 30 нуклеотидных парных последовательностей между фрагментами для бесшовной сборки с помощью рекомбинационного клонирования дрожжей¹³ (рис. 1). Последовательности праймеров см. в Дополнительной таблице S1 .
2. Чтобы избежать мутаций, амплифицируйте промоторную область (см. выше), а также дестабилизированную люциферазу (LUC-PEST) и кассеты hphMX ¹ с помощью высокоточной ДНК-полимеразы (подробности протокола см. у производителя полимеразы). Установите термоамплификатор на 98 °C на 10 минут для начальной денатурации, затем 30 циклов денатурации при 98 °C, отжига при 60 °C и удлинения при 72 °C; завершите протокол окончательным продлением при температуре 72 °C в течение 10 минут.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании дрожжевых челночных плазмид в качестве матриц для ПЦР рекомендуется подвергать ампликонные реакции перевариванию DpnI (см. протокол производителя фермента) для устранения любых следов матричной плазмиды, которые могут препятствовать трансформации дрожжей.
3. Расщепите остов pRS426 плазмиды¹⁴ с помощью ферментов рестрикции EcoRI и XhoI, чтобы линеаризировать вектор, разрезая его в месте множественного клонирования, и подготовить его к рекомбинации (см. протокол производителя фермента).
4. Смешайте линеаризованный остов pRS426 с амплифицированными фрагментами ДНК и преобразуйте смесь в Saccharomyces cerevisiae BY4741 с использованием дрожжевого рекомбинационного клонирования^13,15, чтобы позволить гомологичному рекомбинационному механизму дрожжей собрать плазмидную конструкцию in vivo.
5. Пластинировать трансформированные дрожжи на синтетическую полную (SC) среду без урацила (SC-URA) для выбора ауксотрофных трансформантов, содержащих новую сконструированную векторную плазмиду pRS426-MAL32-LUC-hphMX.
6. Извлеките плазмиды из дрожжей с помощью набора для мини-подготовки дрожжей в соответствии с инструкциями производителя и преобразуйте извлеченную плазмиду в Escherichia coli DH5α для амплификации конструкции для дальнейших анализов.
7. Проведите скрининг бактериальных колоний с помощью ПЦР, чтобы подтвердить правильность сборки конструкций.
8. Очистите плазмидную ДНК с помощью стандартного набора для очистки плазмид и выполните секвенирование по Сэнгеру для проверки целостности и последовательности собранных плазмид.

2. Трансформация штаммов дрожжей

ПРИМЕЧАНИЕ: Протокол трансформации дрожжей был адаптирован из ранее разработанного метода для S. eubayanus¹⁶ и успешно применен к другим видам Saccharomyces и ферментативным штаммам дрожжей. Этот протокол был получен на основе традиционного метода трансформации дрожжей из лаборатории Гица¹⁵. Этот подход обеспечивает эффективную интеграцию и отбор плазмид в различных экспериментальных условиях, предлагая надежный и гибкий метод трансформации различных штаммов дрожжей. Он обеспечивает надежный выбор и поддержание эписомальной плазмиды под давлением гигромицина.

1. Предварительно культивируйте одну колонию свежевыращенных дрожжей в 5 мл YPD (1% w/v экстракта дрожжей, 2% w/v пептон, 2% w/v глюкозы) при 20 °C при 200 об/мин при перемешивании в течение ночи.
2. Разведите культуру до наружного диаметра₆₂₀ 0,2 в свежей среде YPD и инкубируйте при 20 °C с перемешиванием при 200 об/мин до середины логарифмической фазы (наружный диаметр₆₂₀ 0,4-0,6). В зависимости от штамма дрожжей на это обычно уходит 3-4 часа.
3. Соберите клетки центрифугированием при температуре 21 380 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре, выбросьте надосадочную жидкость и промойте гранулу 3 раза стерильной водой.
4. Повторно суспендируйте промытые элементы в 100 мкл 0,1 М ацетата лития, центрифугируйте, как описано в шаге 2.3, и повторите процесс 2 раза.
5. Добавьте в клетки следующие компоненты в следующем порядке: 240 мкл 50% w/v PEG-4000, 35 мкл 1 М LiAc, 5 мкл плазмидной ДНК (100 нг/мкл), 20 мкл одноцепочечной ДНК-носителя (ссДНК), предварительно нагретую при 98 °C в течение 10 мин. Аккуратно перемешайте, чтобы гомогенизировать смесь для трансформации.
6. Инкубируйте смесь при температуре 20 °C в течение 30 минут, а затем испытайте тепловой шок при 34 °C в течение 55 минут. После теплового шока добавьте 38 мкл 100% этанола до конечной концентрации почти 0,1% и инкубируйте еще 5 минут при 34 °C.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Температуры, используемые в этом протоколе, оптимизированы для Saccharomyces eubayanus, криотолерантного штамма, выделенного из лесов умеренного пояса.
   Использование 100% этанола необходимо для индуцирования клеточного стресса, что повышает эффективность протокола трансформации.
7. Добавьте 600 мкл YPD в трансформированные клетки, центрифугируйте как на шаге 2.3 и выбросьте надосадочную жидкость.
8. Повторно суспендируйте клеточную гранулу в 600 μл свежего YPD и инкубируйте суспензию без перемешивания в течение ночи при 4 °C для восстановления.
9. Трансформированные клетки наносят на агар YPD с добавлением гигромицина в концентрации 200 мкг/мл и инкубируют при 20-30 °С в течение 48-72 ч.
10. Выберите 10-12 колоний из трансформационных планшетов и повторно нанесите их на агар YPD, содержащий 200 мкг/мл гигромицина, чтобы обеспечить присутствие плазмиды и создать смешанный участок выбранных колоний для дальнейшего использования.

3. Валидация люминесценции

Примечание: Для проверки функциональности люминесцентных репортеров трансформированные штаммы были протестированы в условиях, предназначенных для индуцирования дифференциальной экспрессии люциферазного репортера. Эта ступенчатая валидация позволяет оценить функциональность репортера в условиях колебания сахара, используя надежность люминесцентных анализов для регистрации метаболических реакций в режиме реального времени.

1. Выберите образец из участка трансформированного штамма дрожжей и инокулируйте его в среду YP (1% w/v дрожжевого экстракта, 2% w/v пептон), содержащую 5% w/v глюкозы и 200 μМ гигромицина. Выдерживать при температуре 25 °C без встряхивания в течение 24 ч. Освежите культуры в свежей среде в соотношении 1:10 и инкубируйте в тех же условиях еще 24 ч.
2. Промойте клетки средой YP без сахара и инокулируйте их в тестовую среду в соотношении 1:10. Исследуемая среда дополнена люциферином до конечной концентрации 3 мМ и содержит 200 мкМ гигромицина для поддержания стабильности плазмид.
3. Для тестирования роста со смешанным сахаром используйте глюкозо-мальтозную матрицу со следующими концентрациями (% по объему): глюкоза (0%, 0,5%, 1%, 2%) и мальтоза (0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) в среде YP. Каждое состояние дополняют люциферином (конечная концентрация 3 мМ) и 200 мкМ гигромицина. Дозируйте по 200 мкл культуры в каждую лунку 96-луночного планшета (рис. 2).
4. Измеряйте люминесценцию и наружный диаметр₆₂₀ каждые 30 минут в течение 72 часов с помощью планшетного считывателя люминометра, без затухания и времени интегрирования 1 с, обеспечивая непрерывный мониторинг активности репортера и плотности ячеек.

4. Отбор проб ферментации и мониторинг люминесценции

Трансформированные штаммы подвергали контролируемым условиям микроферментации для оценки активации люминесценции во время брожения. Это позволяет сравнивать активацию люминесценции в различных условиях брожения, что дает представление о метаболических реакциях дрожжей в течение длительных периодов брожения.

1. Приготовьте среду для солодового экстракта (12 °Plato), растворив солодовый экстракт в воде, и стерилизуйте при 100 °C в течение 20 минут. Перед инокуляцией дайте среде остыть до комнатной температуры.
2. Прекультура трансформировала штаммы дрожжей в 5 мл YPD (1% w/v дрожжевого экстракта, 2% w/v пептон, 2% w/v глюкозы) при 20 °C с перемешиванием при 200 об/мин в течение 24 ч. Переложите прекультуру в 50 мл солодовой экстрактивной среды. Инкубировать культуру при 20 °C с перемешиванием при 200 об/мин в течение 24 ч.
3. Соберите клетки центрифугированием при 21 380 × г в течение 1 минуты при комнатной температуре и повторно суспендируйте их для приготовления тройного микроброжения 50 мл в среде солодового экстракта 12 °Plato⁹. Для повышения эффективности ферментации добавьте в среду 0,3 мг/л ZnCl2_.
4. Чтобы обеспечить постоянную плотность клеток среди репликатов, рассчитайте объем инокулюма по формуле:
   Объем посевного материала = (1,5 × 10⁶) × объем (мл) × градусов Платона
5. Подготовленную среду инокулировать и инкубировать культуры при температуре 20 °С без встряхивания в течение 14 дней. Контролируйте ход ферментации, ежедневно регистрируя потери_CO2 . Взвешивайте сосуды одновременно каждый день, чтобы измерить совокупную потерю веса как показатель производства_CO2 .
6. Для мониторинга люминесценции периодически отбирайте 200 мкл при каждой микроферментации. Добавьте люциферин в образцы для достижения конечной концентрации 3 мМ и измерьте люминесценцию и внешний диаметр₆₂₀ с помощью люминометра без затухания и времени интегрирования 1 с. Проводите измерения через определенные промежутки времени в течение всего периода брожения (Рисунок 3).

Результаты

Следующие результаты демонстрируют возможность использования недавно созданного люминесцентного репортера для мониторинга перехода от глюкозы к мальтозе в дрожжевых клетках в процессе ферментации. Репортерные плазмиды первоначально собирают с помощью дрожжевог?...

Обсуждение

Это исследование демонстрирует эффективность эписомального биолюминесцентного репортера для мониторинга транскрипционной активации у S. eubayanus при метаболических переходах. Используя MAL32 в качестве транскрипционного репортера¹¹, мы смогли отс?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001