In vivo Suivi de l’activité transcriptionnelle pendant la transition métabolique à l’aide d’un rapporteur bioluminescent chez la levure

Résumé

Ce protocole utilise un rapporteur bioluminescent, permettant de mesurer l’activité transcriptionnelle chez Saccharomyces eubayanus pour surveiller la transition glucose-maltose, permettant une analyse en temps réel des adaptations métaboliques et soutenant l’optimisation des souches pour la fermentation industrielle dans diverses conditions.

Résumé

La consommation séquentielle de sucre, d’une source de sucre préférée à une source moins préférée, représente une adaptation métabolique critique chez la levure, ce qui est particulièrement pertinent pour la survie dans des environnements fluctuants tels que ceux trouvés dans la fermentation de la bière. Cependant, les transitions sucrées sont une variable environnementale difficile à prévoir et à détecter, ce qui a un impact sur le résultat des fermentations de la bière. Ce protocole décrit un système in vivo pour surveiller l’activation transcriptionnelle associée au changement métabolique du glucose au maltose chez Saccharomyces eubayanus qui s’applique à différentes souches de levures sauvages Saccharomyces .

Le système utilise un rapporteur transcriptionnel bioluminescent épisomique pour le métabolisme du maltose, en se concentrant sur MAL32, car il fournit une bonne lecture des changements métaboliques, comme étudié chez S. cerevisiae. Pour cela, des souches de levure ont été transformées avec des plasmides contenant la région régulatrice MAL32 de S. eubayanus, contrôlant l’expression d’un gène codant pour une version déstabilisée de la luciférase¹ et d’un gène de résistance à l’hygromycine utilisé exclusivement lors de la transformation pour assurer l’acquisition du plasmide. Après la sélection, les cellules de levure transformées peuvent être cultivées dans des conditions non sélectives, car le plasmide épisomal reste stable dans des conditions de culture jusqu’à 7 jours.

Ce système a été validé dans un environnement de sucre complexe dans des essais de microfermentation, confirmant l’efficacité du rapporteur de la luciférase pour informer les transitions métaboliques. Des échantillons ont été collectés régulièrement et analysés à l’aide d’un luminomètre, ce qui a permis de mieux comprendre les réponses des levures. Bien qu’il soit largement applicable, ce protocole est particulièrement utile pour évaluer les performances des levures dans des conditions de fermentation, où les changements métaboliques posent un défi important. De plus, cette méthodologie peut être adaptée en sélectionnant des promoteurs alternatifs pour explorer un plus large éventail de réponses aux changements environnementaux, permettant la caractérisation ainsi que l’optimisation des souches de levures sauvages pour diverses applications industrielles.

Introduction

Les micro-organismes tels que les levures doivent constamment s’adapter à des conditions environnementales dynamiques pour maintenir leur forme physique et survivre¹. Ces adaptations impliquent souvent des circuits de régulation génique complexes intégrant plusieurs signaux extracellulaires pour orchestrer des réponses métaboliques précises ^2,3. En milieu industriel, l’efficacité de ces transitions métaboliques est critique, en particulier dans les processus de fermentation où les perturbations peuvent conduire à des rendements sous-optimaux ou à des fermentations incomplètes³. L’un des principaux défis métaboliques à surmonter est la transition des cellules d’une source de carbone préférée à une source de carbone secondaire, comme le passage du glucose au maltose. Ce processus introduit une phase de latence au cours de laquelle les gènes nécessaires au métabolisme des sources de carbone secondaires sont déprimés, permettant la reprise de la croissance ^4,5.

Dans le brassage, les levures Saccharomyces doivent passer efficacement du métabolisme du glucose au métabolisme du maltose. En particulier, S. eubayanus, l’espèce parentale tolérante au froid des levures blondes, présente une variabilité phénotypique substantielle dans sa capacité à s’adapter à de telles transitions⁶. Les isolats sauvages, tels que ceux de Patagonie, présentent souvent des phases de latence prolongées et une consommation de maltose plus lente par rapport aux souches domestiquées, qui ont été sélectionnées pour leurs capacités fermentatives optimisées ^7,8. Alors que les souches domestiquées se sont adaptées pour fermenter efficacement les environnements sucrés mixtes, les souches sauvages présentent souvent une transition métabolique plus lente, potentiellement en raison d’une répression plus forte du glucose et d’une régulation variable du locus MAL ^6,9.

Cette étude utilise la variabilité naturelle de S. eubayanus comme modèle pour étudier les adaptations métaboliques dans des conditions de glucose-maltose, en exploitant un rapporteur de luciférase déstabilisé épisomal pour surveiller l’expression génique in vivo, en suivant la luminescence¹. Le rapporteur MAL32 sélectionné code pour une protéine maltase, une enzyme pivot pour le catabolisme du maltose lors des transitions glucose-maltose^10,11. Remarquablement, le promoteur MAL32 représente un marqueur efficace pour évaluer l’induction du métabolisme du maltose après une appauvrissement en glucose¹². En incorporant ce système de rapporteur, nous avons cherché à élucider les mécanismes adaptatifs spécifiques à la souche et à identifier des cibles potentielles pour optimiser les performances de fermentation. De plus, ce protocole peut être étendu au-delà du brassage, offrant des applications dans la biotechnologie et les études environnementales où les environnements sucriers complexes jouent un rôle important. La compréhension des déterminants génétiques et régulateurs des réponses environnementales fluctuantes chez S. eubayanus améliore nos connaissances de la physiologie de la levure, soutenant le développement de souches robustes pour diverses applications industrielles et de recherche.

Protocole

1. Construction des rapporteurs épisomaux

REMARQUE : Nous avons sélectionné une région régulatrice rapporteure sur la base de la littérature sur la levure pour construire le plasmide épisomique pour le suivi de la consommation de maltose ^6,11,12. Le promoteur du gène rapporteur candidat a été défini comme la séquence régulatrice immédiatement en amont de l’ORF candidat jusqu’au nucléotide flanquant l’ORF adjacent en amont. Cette région a été amplifiée à partir de l’ADN génomique de la souche de référence^{T 10} de S. eubayanus CBS12357. Cette approche garantit la construction haute fidélité de plasmides épisomaux adaptés aux applications en aval, y compris l’étude d’autres conditions intéressantes chez la levure.

1. Concevoir les fragments d’ADN et les amorces qui se chevauchent de manière à inclure 30 séquences d’appariement de nucléotides entre les fragments pour un assemblage sans couture par clonage recombinatoire de levure¹³ (Figure 1). Voir le tableau supplémentaire S1 pour les séquences d’amorces.
2. Pour éviter les mutations, amplifiez la région promotrice (voir ci-dessus), ainsi que la luciférase déstabilisée (LUC-PEST) et les cassettes hphMX ¹ à l’aide d’une ADN polymérase haute fidélité (voir le fabricant de la polymérase pour les détails du protocole). Réglez le thermocycleur à 98 °C pendant 10 min pour la dénaturation initiale, suivie de 30 cycles de dénaturation à 98 °C, de recuit à 60 °C et d’extension à 72 °C ; compléter le protocole par une extension finale à 72 °C pendant 10 min.
   REMARQUE : Lors de l’utilisation de plasmides de navette de levure comme matrices pour la PCR, il est recommandé de soumettre les réactions d’amplicon à une digestion DpnI (voir le protocole du fabricant de l’enzyme) afin d’éliminer toute trace de plasmide matrice qui pourrait interférer avec la transformation de la levure.
3. Digérer le squelette du plasmide¹⁴ pRS426 avec les enzymes de restriction EcoRI et XhoI pour linéariser le vecteur, le couper au site de clonage multiple et le préparer pour la recombinaison (reportez-vous au protocole du fabricant de l’enzyme).
4. Mélangez le squelette linéarisé pRS426 avec les fragments d’ADN amplifiés et transformez le mélange en Saccharomyces cerevisiae BY4741 en utilisant le clonage recombinatoire de levure^13,15 pour permettre à la machinerie de recombinaison homologue de la levure d’assembler la construction plasmidique in vivo.
5. Placez la levure transformée sur un milieu synthétique complet (SC) dépourvu d’uracile (SC-URA) pour sélectionner les transformants auxotrophes contenant le nouveau plasmide vecteur construit pRS426-MAL32-LUC-hphMX .
6. Extraire les plasmides de la levure à l’aide d’un mini-kit de préparation de levure selon les instructions du fabricant et transformer le plasmide extrait en Escherichia coli DH5α pour amplifier la construction pour des analyses ultérieures.
7. Criblez les colonies bactériennes par PCR pour confirmer l’assemblage correct des constructions.
8. Purifiez l’ADN plasmidique à l’aide d’un kit de purification de plasmide standard et effectuez un séquençage Sanger pour vérifier l’intégrité et la séquence des plasmides assemblés.

2. Transformation des souches de levure

REMARQUE : Le protocole de transformation des levures a été adapté à partir d’une méthode précédemment établie pour S. eubayanus¹⁶ et appliqué avec succès à d’autres espèces de Saccharomyces et souches de levures fermentatives. Ce protocole a été dérivé de la méthode traditionnelle de transformation de la levure du Gietz Lab¹⁵. Cette approche permet une intégration et une sélection efficaces des plasmides dans diverses conditions expérimentales, offrant une méthode robuste et flexible pour transformer différentes souches de levure. Il assure une sélection et une maintenance fiables du plasmide épisomal sous la pression de l’hygromycine.

1. Préculture d’une seule colonie de levures fraîchement cultivées dans 5 mL de YPD (1 % p/v d’extrait de levure, 2 % p/v de peptone, 2 % p/v de glucose) à 20 °C à 200 tr/min d’agitation pendant la nuit.
2. Diluer la culture à une DO₆₂₀ de 0,2 dans un milieu YPD frais et incuber à 20 °C en agitant à 200 tr/min jusqu’à la phase mi-log (DO₆₂₀ 0,4-0,6). Selon la souche de levure, cela prend généralement 3 à 4 h.
3. Récoltez les cellules par centrifugation à 21 380 × g pendant 1 min à température ambiante, jetez le surnageant et lavez la pastille 3 fois avec de l’eau stérile.
4. Remettez les cellules lavées en suspension dans 100 μL d’acétate de lithium 0,1 M, centrifugez-les comme décrit à l’étape 2.3 et répétez le processus 2 fois.
5. Ajoutez les composants suivants aux cellules dans cet ordre : 240 μL de PEG-4000 à 50 % p/v, 35 μL de 1 M LiAc, 5 μL d’ADN plasmidique (100 ng/μL), 20 μL d’ADN porteur simple brin (ADNsb) préalablement chauffé à 98 °C pendant 10 min. Mélangez délicatement pour homogénéiser le mélange de transformation.
6. Incuber le mélange à 20 °C pendant 30 min, suivi d’un choc thermique à 34 °C pendant 55 min. Après un choc thermique, ajoutez 38 μL d’éthanol à 100 % à une concentration finale de près de 0,1 % et incubez pendant 5 minutes supplémentaires à 34 °C.
   REMARQUE : Les températures utilisées dans ce protocole sont optimisées pour Saccharomyces eubayanus, une souche cryotolérante isolée dans les forêts tempérées.
   L’utilisation de 100 % d’éthanol est nécessaire pour induire un stress cellulaire, améliorant ainsi l’efficacité du protocole de transformation.
7. Ajouter 600 μL de YPD dans les cellules transformées, centrifuger comme à l’étape 2.3 et jeter le surnageant.
8. Remettre la pastille en suspension dans 600 μL de YPD frais et incuber la suspension sans agitation pendant la nuit à 4 °C pour permettre la récupération.
9. Déposer les cellules transformées sur une gélose YPD complétée par 200 μg/mL d’hygromycine et incuber à 20 °C-30 °C pendant 48 à 72 h.
10. Sélectionner 10 à 12 colonies dans les plaques de transformation et les réétaler sur une gélose YPD contenant 200 μg/mL d’hygromycine pour assurer la présence du plasmide et générer une plaque mixte des colonies sélectionnées pour une utilisation ultérieure.

3. Validation de la luminescence

REMARQUE : Pour valider la fonctionnalité des rapporteurs luminescents, des souches transformées ont été testées dans des conditions conçues pour induire l’expression différentielle du rapporteur luciférase. Cette validation par étapes permet d’évaluer la fonctionnalité du rapporteur dans des conditions de sucre fluctuantes, en tirant parti de la robustesse des dosages luminescents pour capturer les réponses métaboliques en temps réel.

1. Prélever un échantillon dans un patch de souche de levure transformée et l’inoculer dans un milieu YP (1 % p/v d’extrait de levure, 2 % p/v de peptone) contenant 5 % p/v de glucose et 200 μM d’hygromycine. Incuber à 25 °C sans agiter pendant 24 h. Rafraîchir les cultures dans un milieu frais à une dilution de 1:10 et incuber dans les mêmes conditions pendant encore 24 heures.
2. Lavez les cellules avec un milieu YP sans sucre et inoculancez-les dans le milieu d’essai à une dilution de 1:10. Le milieu de test est complété par de la luciférine jusqu’à une concentration finale de 3 mM et contient 200 μM d’hygromycine pour maintenir la stabilité plasmidique.
3. Pour les essais de croissance à sucres mixtes, utilisez une matrice glucose-maltose avec les concentrations suivantes ( % p/v) : glucose (0 %, 0,5 %, 1 %, 2 %) et maltose (0 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %) dans le milieu YP. Chaque affection est complétée par de la luciférine (concentration finale de 3 mM) et de l’hygromycine de 200 μM. Distribuer 200 μL de culture dans chaque puits d’une plaque de 96 puits (figure 2).
4. Mesurez la luminescence et le DO₆₂₀ toutes les 30 min pendant 72 h à l’aide d’un lecteur de plaques luminométriques, sans atténuation et 1 s de temps d’intégration, assurant une activité continue du rapporteur et un suivi de la densité cellulaire.

4. Échantillonnage de fermentation et surveillance de la luminescence

REMARQUE : Les souches transformées ont été soumises à des conditions de micro-fermentation contrôlées pour évaluer l’activation de la luminescence pendant la fermentation. Cela permet de comparer l’activation de la luminescence dans différentes conditions de fermentation, ce qui donne un aperçu des réponses métaboliques des levures pendant des périodes de fermentation prolongées.

1. Préparez le milieu d’extrait de malt (12 °Plato) en dissolvant l’extrait de malt dans de l’eau et stérilisez à 100 °C pendant 20 min. Laissez le milieu refroidir à température ambiante avant l’inoculation.
2. Pré-culture : Transformer des souches de levure dans 5 mL de YPD (1 % p/v d’extrait de levure, 2 % p/v peptone, 2 % p/v de glucose) à 20 °C avec agitation à 200 tr/min pendant 24 h. Transférer la préculture dans 50 mL de milieu d’extrait de malt. Incuber la culture à 20 °C avec agitation à 200 tr/min pendant 24 h.
3. Récoltez les cellules par centrifugation à 21 380 × g pendant 1 min à température ambiante et mettez-les en suspension pour préparer des micro-fermentations triples de 50 mL dans un milieu^d’extrait de malt 12°Plato 9. Pour améliorer les performances de fermentation, complétez le milieu avec 0,3 mg/L de ZnCl₂.
4. Pour garantir des densités cellulaires constantes entre les répétitions, calculez le volume de l’inoculum à l’aide de la formule suivante :
   Volume de l’inoculum = (1,5 × 10⁶) × Volume (mL) × Degrés Plato
5. Inoculez le milieu préparé et incubez les cultures à 20 °C sans agiter pendant 14 jours. Surveillez la progression de la fermentation en enregistrant quotidiennement les pertes de_CO2 . Pesez les récipients simultanément chaque jour pour mesurer la perte de poids cumulée comme indicateur de la production de CO₂ .
6. Pour le suivi de la luminescence, prélever périodiquement 200 μL de chaque microfermentation. Ajouter de la luciférine aux échantillons pour obtenir une concentration finale de 3 mM et mesurer la luminescence et la DO₆₂₀ à l’aide d’un lecteur de plaque de luminomètre sans atténuation et 1 s de temps d’intégration. Effectuez des mesures à des intervalles définis tout au long de la période de fermentation (Figure 3).

Résultats

Les résultats suivants démontrent l’utilisabilité du rapporteur luminescent nouvellement construit pour surveiller la transition du glucose au maltose dans les cellules de levure dans un processus de fermentation. Les plasmides rapporteurs sont initialement assemblés à l’aide d’un clonage recombinatoire de levure¹³ pour générer des constructions rapporteures épisomiques. Ce processus nécessite le chevauchement de séquences nucléotidiques d’au mo...

Discussion

Cette étude démontre l’efficacité d’un rapporteur bioluminescent épisomique pour surveiller l’activation transcriptionnelle chez S. eubayanus lors de transitions métaboliques. En utilisant MAL32 comme rapporteur transcriptionnel¹¹, nous avons pu suivre les transitions métaboliques clés en temps réel, fournissant ainsi un cadre solide pour comprendre les adaptations spécifiques à une souche. Ce rapporteur, sélectionné pour son r?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001