インビボ 酵母中の生物発光レポーターを用いた代謝移行期の転写活性のモニタリング

要約

このプロトコルは生物発光レポーターを採用しており、 Saccharomyces eubayanus の転写活性を測定してグルコースからマルトースへの移行をモニタリングし、代謝適応のリアルタイム分析を可能にし、さまざまな条件下での工業的発酵のための菌株最適化をサポートします。

要約

好ましい糖源からあまり好ましくない糖源への逐次的な糖の消費は、酵母の重要な代謝適応を表しており、これは特にビール発酵に見られるような変動する環境での生存に関連しています。しかし、糖の移行は予測や検出が困難な環境変数であり、ビールの発酵結果に影響を与えます。このプロトコルは、さまざまな野生酵母株に適用されるSaccharomyces eubayanusのグルコースからマルトースへの代謝シフトに関連する転写活性化を監視するin vivoシステムについて説明しています。

このシステムは、S. cerevisiaeで研究されているように、代謝シフトの良好な読み出しを提供するため、MAL32に焦点を当てて、マルトース代謝のためのエピソーム生物発光転写レポーターを採用しています。このために、酵母株を、S. eubayanus由来のMAL32調節領域を含むプラスミドで形質転換し、ホタルルシフェラーゼ¹の不安定化バージョンをコードする遺伝子の発現を制御し、形質転換中のみ使用されるハイグロマイシン耐性遺伝子を使用してプラスミドの獲得を確実にしました。選択後、形質転換酵母細胞は、エピソームプラスミドが最大7日間培養条件で安定なままであるため、非選択的条件下で培養できます。

このシステムは、マイクロ発酵アッセイの複雑な糖環境下で検証され、代謝遷移を通知するルシフェラーゼレポーターの有効性が確認されました。サンプルは定期的に収集され、ルミノメーターで分析され、酵母の応答に関する継続的な洞察を提供しました。このプロトコルは広く適用可能ですが、代謝の変化が大きな課題となる発酵条件下での酵母の性能を評価するために特に価値があります。さらに、この方法論は、環境変化に対するより広範な応答を探索するための代替プロモーターを選択することで適応させることができ、多様な産業用途のための野生酵母株の特性評価と最適化を可能にします。

概要

酵母などの微生物は、フィットネスを維持し、生き残るために、常に動的な環境条件に適応する必要があります¹。これらの適応には、多くの場合、複数の細胞外シグナルを統合して正確な代謝応答を調整する複雑な遺伝子制御回路が含まれます^2,3。産業環境では、これらの代謝遷移の効率が重要であり、特に発酵プロセスでは、混乱が最適でない収量や不完全な発酵につながる可能性があります³。克服すべき重要な代謝上の課題は、細胞がグルコースからマルトースへのシフトのように、好ましい炭素源から二次的な炭素源に移行するときです。このプロセスは、二次炭素源の代謝に必要な遺伝子が抑制解除される遅延期を導入し、成長の再開を可能にする^4,5。

醸造では、サッカロマイセス酵母はグルコースからマルトース代謝に効率的に移行する必要があります。特に、ラガー酵母の耐寒性親種であるS.eubayanusは、そのような移行に適応する能力において、表現型の大きな変動性^{を示している6。}パタゴニア産のもののような野生の分離株は、最適化された発酵能力のために選択された家畜化された株と比較して、しばしば長い遅延期と遅いマルトース消費を示します^7,8。家畜化された菌株は混合糖環境を効率的に発酵させるように適応しているが、野生の菌株はしばしば代謝移行が遅く、これはおそらくより強いグルコース抑制とMAL遺伝子座の可変調節によるものである^6,9。

この研究では、S. eubayanusの自然変動をモデルとして利用し、グルコースからマルトースへの条件下での代謝適応を調査し、エピソーム不安定化ルシフェラーゼレポーターを活用して、発光を追跡することによりin vivoで遺伝子発現を監視します¹。選択されたレポーターMAL32は、グルコースからマルトースへの移行^10,11におけるマルトース異化作用の極めて重要な酵素であるマルターゼタンパク質をコードしています。驚くべきことに、MAL32プロモーターは、グルコース枯渇後のマルトース代謝誘導を評価するための成功したマーカーを表しています¹²。このレポーターシステムを組み込むことで、菌株特有の適応メカニズムを解明し、発酵性能を最適化するための潜在的なターゲットを特定することを目指しました。さらに、このプロトコルは醸造を超えて拡張することができ、複雑な糖環境が重要な役割を果たすバイオテクノロジーや環境研究への応用を提供します。S. eubayanusの変動する環境応答の遺伝的および調節的決定要因を理解することは、酵母生理学の知識を深め、多様な産業および研究用途のための堅牢な株の開発をサポートします。

プロトコル

1. エピソームレポーターの構築

注:我々は、マルトー^{スの消費を}モニタリングするためのエピソームプラスミドを構築するために、酵母の文献に基づいてレポーター調節領域を選択した^6,11,12。候補レポーター遺伝子のプロモーターは、候補ORFのすぐ上流から隣接する上流のORFに隣接するヌクレオチドまでの調節配列として定義されました。この領域は、S. eubayanus CBS12357 ^T参照株¹⁰のゲノムDNAから増幅されました。このアプローチにより、酵母の他の興味深い条件の研究を含むダウンストリームアプリケーションに適したエピソームプラスミドの高忠実度の構築が保証されます。

1. DNAフラグメントとオーバーラッププライマーを設計して、フラグメント間に30のヌクレオチド対形成配列を含めるように設計し、酵母組換えクローニング¹³ (図1)を介してシームレスにアセンブリします。プライマー配列については 、補足表S1 を参照してください。
2. 突然変異を避けるために、プロモーター領域(上記参照)、ならびに不安定化ルシフェラーゼ(LUC-PEST)および hphMX カセット¹ を、ハイフィデリティDNAポリメラーゼを用いて増幅します(プロトコールの詳細については、ポリメラーゼの製造元を参照してください)。サーモサイクラーを98°Cに10分間設定して初期変性を行い、続いて98°Cの変性、60°Cのアニーリング、および72°Cの伸長を30サイクル行います。72°Cで10分間の最終延長でプロトコルを完成させます。
   注:PCRのテンプレートとして酵母シャトルプラスミドを使用する場合は、アンプリコン反応をDpnI消化(酵素メーカーのプロトコルを参照)にさらすことを推奨し、酵母の形質転換を妨げる可能性のあるテンプレートプラスミドの痕跡を排除することをお勧めします。
3. pRS426プラスミド¹⁴ バックボーンをEcoRIおよびXhoI制限酵素で消化してベクターを直鎖化し、マルチクローニングサイトで切断し、組換えの準備をします(酵素メーカーのプロトコールを参照)。
4. 直鎖化されたpRS426骨格を増幅されたDNA断片と混合し、酵母組換えクローニング^13,15を使用して混合物をSaccharomyces cerevisiae BY4741に変換して、酵母の相同組換え機構がin vivoでプラスミドコンストラクトを組み立てることを可能にする。
5. ウラシルを欠く合成完全(SC)培地(SC-URA)に形質転換酵母を播種し、新規に構築されたベクターpRS426-MAL32-LUC-hphMX プラスミドを含む補助栄養形質転換体を選択します。
6. 製造元の指示に従って、酵母ミニ調製キットを使用して酵母からプラスミドを抽出し、抽出したプラスミドを 大腸菌 DH5αに変換して、さらなる分析のためにコンストラクトを増幅します。
7. PCRによって細菌コロニーをスクリーニングし、コンストラクトの正しい組み立てを確認します。
8. 標準的なプラスミド精製キットを使用してプラスミドDNAを精製し、サンガーシーケンシングを実施して、アセンブルされたプラスミドの完全性と配列を確認します。

2. 酵母株の形質転換

注:酵母形質転換プロトコルは、 S. eubayanus¹⁶ の以前に確立された方法から適応され、他の Saccharomyces 種および発酵酵母株にうまく適用されました。このプロトコールは、Gietz Lab¹⁵の伝統的な酵母形質転換法から導き出されました。このアプローチにより、さまざまな実験条件下での効率的なプラスミドの統合と選択が可能になり、さまざまな酵母株を形質転換するための堅牢で柔軟な方法が提供されます。これにより、ハイグロマイシン圧下でのエピソームプラスミドの信頼性の高い選択と維持が保証されます。

1. 5 mLのYPD(1% w/v酵母抽出物、2%w/vペプトン、2%w/vグルコース)で、20°C、200 rpmの攪拌で一晩、新たに成長した酵母の単一コロニーを予備培養します。
2. 培養物を新鮮なYPD培地でOD₆₂₀ 0.2に希釈し、200 rpmで撹拌しながら20°Cでインキュベートし、中間対数相(OD₆₂₀ 0.4-0.6)までインキュベートします。酵母株にもよりますが、これには通常3〜4時間かかります。
3. 細胞を21,380 × g で室温で1分間遠心分離して回収し、上清を捨て、ペレットを滅菌水で3回洗浄します。
4. 洗浄した細胞を100 μLの0.1 M酢酸リチウムに再懸濁し、ステップ2.3で説明したように遠心分離し、このプロセスを2回繰り返します。
5. 240 μL の 50% w/v PEG-4000、35 μL の 1 M LiAc、5 μL のプラスミド DNA (100 ng/μL)、20 μL の一本鎖キャリア DNA(ssDNA)を 98 °C で 10 分間加熱した状態で、次の成分をこの順序で細胞に加えます。穏やかに混合して、形質転換混合物を均質化します。
6. 混合物を20°Cで30分間インキュベートし、続いて34°Cで55分間ヒートショックします。ヒートショック後、100%エタノール38μLを最終濃度約0.1%まで加え、34°Cでさらに5分間インキュベートします。
   注:このプロトコルで使用される温度は、温帯林から分離された耐氷性株である Saccharomyces eubayanusに最適化されています。
   100%エタノールの使用は、細胞ストレスを誘発し、形質転換プロトコルの効率を高めるために必要です。
7. 形質転換した細胞に600 μLのYPDを加え、ステップ2.3と同様に遠心分離し、上清を捨てます。
8. 細胞ペレットを600 μLの新鮮なYPDに再懸濁し、懸濁液を撹拌せずに4°Cで一晩インキュベートして回収します。
9. 形質転換細胞を200 μg/mLのハイグロマイシンを添加したYPD寒天上に播種し、20°C〜30°Cで48〜72時間インキュベートします。
10. 形質転換プレートから10-12コロニーを選択し、200 μg/mLのハイグロマイシンを含むYPD寒天上に再ストリークしてプラスミドの存在を確認し、選択したコロニーの混合パッチを生成してさらに使用します。

3. 発光性の検証

注:発光レポーターの機能を検証するために、ルシフェラーゼレポーターの差次的発現を誘導するように設計された条件下で、形質転換株を試験しました。この段階的な検証により、変動する糖条件下でのレポーターの機能性の評価が可能になり、発光アッセイの堅牢性を活用してリアルタイムの代謝反応を捕捉できます。

1. 形質転換酵母株パッチからサンプルを採取し、5% w/vグルコースと200 μMのハイグロマイシンを含むYP培地(1% w/v酵母抽出物、2%w/vペプトン)に接種します。25°Cで24時間振とうせずにインキュベートします。新鮮な培地で1:10の希釈で培養物をリフレッシュし、同じ条件下でさらに24時間インキュベートします。
2. 細胞を砂糖を含まないYP培地で洗浄し、1:10の希釈で試験培地に接種します。試験培地には、ルシフェリンを最終濃度3 mMまで添加し、プラスミドの安定性を維持するために200 μMのハイグロマイシンを含有します。
3. 混合糖成長試験では、次の濃度(% w / v)のグルコース-マルトースマトリックスを使用します:グルコース(0%、0.5%、1%、2%)およびマルトース(0%、2%、5%、10%、20%、30%)YP培地中。各条件には、ルシフェリン(最終濃度3 mM)と200 μMのハイグロマイシンが添加されます。200 μLの培養物を96ウェルプレートの各ウェルに分注します(図2)。
4. ルミノメータープレートリーダーを使用して、30分ごとにルミネセンスとOD₆₂₀ を72時間測定し、減衰や積分時間を1秒に抑えることで、レポーターの活性と細胞密度の継続的なモニタリングを確保します。

4. 発酵サンプリングと発光モニタリング

注:形質転換菌株を制御されたマイクロ発酵条件にさらし、発酵中の発光活性化を評価しました。これにより、異なる発酵条件での発光活性化の比較が可能になり、長期発酵期間中の酵母代謝応答に関する洞察が得られます。

1. 麦芽エキスを水に溶かして麦芽エキス培地(12°Plato)を調製し、100°Cで20分間滅菌します。接種する前に、培地を室温まで冷ましてください。
2. 5 mLのYPD(1% w/v酵母抽出物、2%w/vペプトン、2%w/vグルコース)で20°Cで200 rpmで24時間攪拌しながら、形質転換酵母株を20°Cで予備培養しました。プレカルチャーを50 mLの麦芽抽出培地に移します。培養物を20°Cでインキュベートし、200rpmで24時間撹拌します。
3. 細胞を21,380 × g で室温で1分間遠心分離して回収し、それらを再懸濁して12°Plato麦芽抽出培地⁹で50 mLのマイクロ発酵を3回調製します。発酵性能を向上させるには、培地に0.3 mg / L ZnCl₂を補給します。
4. 反復間で細胞密度を一定にするには、次の式を使用して接種量を計算します。
   接種量=(1.5 × 10⁶)×容量(mL)×プラトン度
5. 調製した培地に接種し、培養物を20°Cで14日間振とうせずにインキュベートします。CO2の損失を毎日記録することにより、発酵の進行状況を監視します。CO2産生の指標として累積重量減少を測定するために、毎日同時に血管の重量を量ります。
6. 発光モニタリングのために、各微量発酵から定期的に200μLをサンプリングします。サンプルにルシフェリンを添加して最終濃度3 mMを達成し、ルミノメータープレートリーダーを使用して発光とOD₆₂₀ を減衰せず、1秒の積分時間で測定します。発酵期間中、定義された間隔で測定を行います(図3)。

結果

以下の結果は、新たに構築された発光レポーターが、発酵プロセスにおける酵母細胞のグルコースからマルトースへの移行をモニターするために使用できることを示しています。レポータープラスミドは、最初に酵母組換えクローニング¹³を用いてアセンブルされ、エピソームレポーターコンストラクトを生成する。このプロセスでは、異なるアン?...

ディスカッション

この研究は、代謝移行下でのS. eubayanusの転写活性化をモニタリングするためのエピソーム生物発光レポーターの有効性を示しています。MAL32を転写レ^{ポーター11}として用いることで、主要な代謝遷移をリアルタイムで追跡することができ、株特異的な適応を理解するための強固なフレームワークを提供することができました。マルトー?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001