In vivo (İn canlı) Mayada Biyolüminesan Raportör Kullanılarak Metabolik Geçiş Sırasında Transkripsiyonel Aktivitenin İzlenmesi

Özet

Bu protokol, Saccharomyces eubayanus'ta transkripsiyonel aktivite ölçümlerine izin vererek, glikozdan maltoza geçişi izlemek, metabolik adaptasyonların gerçek zamanlı analizini sağlamak ve çeşitli koşullar altında endüstriyel fermantasyon için gerinim optimizasyonunu desteklemek için bir biyolüminesan raportör kullanır.

Özet

Tercih edilen bir şeker kaynağından daha az tercih edilene kadar sıralı şeker tüketimi, mayada kritik bir metabolik adaptasyonu temsil eder ve bu, özellikle bira fermantasyonunda bulunanlar gibi dalgalı ortamlarda hayatta kalmak için önemlidir. Bununla birlikte, şeker geçişleri, tahmin edilmesi ve tespit edilmesi zor olan ve bira fermantasyonlarının sonucunu etkileyen çevresel bir değişkendir. Bu protokol, farklı yabani Saccharomyces maya suşları için geçerli olan Saccharomyces eubayanus'taki glikoz-maltoz metabolik değişimi ile ilişkili transkripsiyonel aktivasyonu izlemek için in vivo bir sistemi tanımlar.

Sistem, S. cerevisiae'de incelendiği gibi metabolik değişimler için iyi bir okuma sağladığı için MAL32'ye odaklanan maltoz metabolizması için epizomal bir biyolüminesan transkripsiyonel raportör kullanır. Bunun için maya suşları, ateşböceği lusiferaz^1'in kararsızlaştırılmış bir versiyonunu kodlayan bir genin ekspresyonunu ve plazmit edinimini sağlamak için yalnızca transformasyon sırasında kullanılan bir higromisin direnç genini kontrol eden S. eubayanus'tan MAL32 düzenleyici bölgesini içeren plazmitlerle dönüştürüldü. Seçimden sonra, transforme edilmiş maya hücreleri, epizomal plazmit kültür koşullarında 7 güne kadar stabil kaldığından, seçici olmayan koşullar altında kültürlenebilir.

Bu sistem, mikrofermantasyon deneylerinde karmaşık bir şeker ortamı altında doğrulandı ve lusiferaz raportörünün metabolik geçişleri bilgilendirmedeki etkinliğini doğruladı. Numuneler düzenli olarak toplandı ve bir luminometre ile analiz edildi, bu da maya tepkileri hakkında sürekli bilgi sağladı. Geniş çapta uygulanabilir olsa da, bu protokol, metabolik değişikliklerin önemli bir zorluk teşkil ettiği fermantasyon koşulları altında maya performansını değerlendirmek için özellikle değerlidir. Ek olarak, bu metodoloji, çevresel değişikliklere daha geniş bir tepki yelpazesini keşfetmek için alternatif destekleyiciler seçilerek uyarlanabilir ve çeşitli endüstriyel uygulamalar için yabani maya suşlarının karakterizasyonuna ve optimizasyonuna izin verir.

Giriş

Mayalar gibi mikroorganizmalar, zindeliği korumak ve hayatta kalmak için dinamik çevre koşullarına sürekli olarak uyum sağlamalıdır¹. Bu adaptasyonlar genellikle, kesin metabolik tepkileri düzenlemek için birden fazla hücre dışı sinyali entegre eden karmaşık gen düzenleyici devreleri içerir ^2,3. Endüstriyel ortamlarda, bu metabolik geçişlerin verimliliği, özellikle bozulmaların optimal olmayan verimlere veya eksik fermantasyonlara yol açabileceği fermantasyon süreçlerinde kritik öneme sahiptir³. Üstesinden gelinmesi gereken önemli bir metabolik zorluk, hücrelerin glikozdan maltoza kayma gibi tercih edilen bir karbon kaynağından ikincil bir karbon kaynağına geçmesidir. Bu süreç, ikincil karbon kaynaklarının metabolizması için gerekli olan genlerin baskılandığı ve büyümenin yeniden başlamasını sağlayan bir gecikme fazı getirir ^4,5.

Bira yapımında, Saccharomyces mayaları glikozdan maltoz metabolizmasına verimli bir şekilde geçmelidir. Özellikle, lager mayalarının soğuğa dayanıklı ebeveyn türü olan S. eubayanus, bu tür geçişlere uyum sağlama yeteneğinde önemli fenotipik değişkenlik gösterir⁶. Patagonya'dan gelenler gibi yabani izolatlar, optimize edilmiş fermantasyon kapasiteleri için seçilen evcilleştirilmiş suşlara kıyasla genellikle uzun süreli gecikme fazları ve daha yavaş maltoz tüketimi sergiler ^7,8. Evcilleştirilmiş suşlar, karışık şeker ortamlarını verimli bir şekilde fermente etmeye adapte olmuş olsa da, yabani suşlar, potansiyel olarak daha güçlü glikoz baskılanması ve MAL lokusunun değişken regülasyonu^{nedeniyle genellikle} daha yavaş bir metabolik geçiş gösterir ^6,9.

Bu çalışma, S. eubayanus'un doğal değişkenliğini glikoz-maltoz koşulları altında metabolik adaptasyonları araştırmak için bir model olarak kullanır ve lüminesansı izleyerek in vivo gen ekspresyonunu izlemek için epizomal destabilize lusiferaz raportöründen yararlanır¹. Seçilen raportör MAL32, glikozdan maltoza geçişler sırasında maltoz katabolizması için çok önemli bir enzim olan bir maltaz proteinini kodlar^10,11. Dikkat çekici bir şekilde, MAL32 promotörü, glikoz tükenmesinden sonra maltoz metabolizması indüksiyonunu değerlendirmek için başarılı bir belirteç^{temsil eder 12}. Bu raportör sistemini dahil ederek, suşa özgü uyarlanabilir mekanizmaları aydınlatmayı ve fermantasyon performansını optimize etmek için potansiyel hedefleri belirlemeyi amaçladık. Ayrıca, bu protokol bira üretiminin ötesine genişletilebilir ve karmaşık şeker ortamlarının önemli bir rol oynadığı biyoteknoloji ve çevresel çalışmalarda uygulamalar sunar. S. eubayanus'taki dalgalı ortam tepkilerinin genetik ve düzenleyici belirleyicilerini anlamak, çeşitli endüstriyel ve araştırma uygulamaları için sağlam suşların geliştirilmesini destekleyerek maya fizyolojisi hakkındaki bilgimizi geliştirir.

Protokol

1. Epizomal muhabirlerin inşası

NOT: Maltoz tüketimini izlemek için epizomal plazmidi oluşturmak için maya literatürüne dayalı bir raportör düzenleyici bölge seçtik ^6,11,12. Aday raportör genin promotörü, aday ORF'den hemen yukarı akışta, bitişik yukarı akış ORF'yi çevreleyen nükleotidde kadar düzenleyici dizi olarak tanımlandı. Bu bölge, S. eubayanus CBS12357^T referans suşu^10'un genomik DNA'sından amplifiye edildi. Bu yaklaşım, mayadaki diğer ilginç koşulların incelenmesi de dahil olmak üzere, aşağı akış uygulamaları için uygun epizomal plazmitlerin yüksek kaliteli yapısını sağlar.

1. DNA fragmanlarını ve üst üste binen primerleri, maya rekombinasyonel klonlama¹³ yoluyla kesintisiz bir montaj için fragmanlar arasında 30 nükleotid eşleştirme dizisi içerecek şekilde tasarlayın (Şekil 1). Primer dizileri için Ek Tablo S1'e bakın.
2. Mutasyonları önlemek için, promotör bölgesini (yukarıya bakın) ve ayrıca kararsız lusiferazı (LUC-PEST) ve hphMX kasetlerini¹ yüksek kaliteli bir DNA polimeraz kullanarak amplifiye edin (protokol ayrıntıları için polimeraz üreticisine bakın). İlk denatürasyon için termodöngüleyiciyi 10 dakika boyunca 98 °C'ye ayarlayın, ardından 30 döngü 98 °C denatürasyon, 60 °C tavlama ve 72 °C uzatma izleyin; protokolü 72 °C'de 10 dakika boyunca son bir uzatma ile tamamlayın.
   NOT: PCR için şablon olarak maya mekik plazmitlerini kullanırken, maya transformasyonuna müdahale edebilecek herhangi bir şablon plazmit izini ortadan kaldırmak için amplikon reaksiyonlarının bir DpnI sindirimine tabi tutulması önerilir (enzim üreticisinin protokolüne bakın).
3. Vektörü doğrusallaştırmak, çoklu klonlama bölgesinde kesmek ve rekombinasyon için hazırlamak için pRS426 plazmid¹⁴ omurgasını EcoRI ve XhoI kısıtlama enzimleri ile sindirin (enzim üreticisinin protokolüne bakın).
4. Doğrusallaştırılmış pRS426 omurgasını amplifiye edilmiş DNA fragmanları ile karıştırın ve mayanın homolog rekombinasyon mekanizmasının plazmit yapısını in vivo olarak bir araya getirmesine izin vermek için maya rekombinasyonel klonlama^13,15 kullanarak karışımı Saccharomyces cerevisiae BY4741'e dönüştürün.
5. Yeni yapılandırılmış vektör pRS426- MAL32-LUC-hphMX plazmidini içeren oksotrofik dönüştürücüleri seçmek için dönüştürülmüş mayayı urasil (SC-URA) içermeyen sentetik tam (SC) bir ortam üzerine yerleştirin.
6. Üreticinin talimatlarına göre bir maya mini hazırlama kiti kullanarak mayadan plazmitleri çıkarın ve ekstrakte edilen plazmiti daha ileri analizler için yapıyı güçlendirmek üzere Escherichia coli DH5α'ya dönüştürün.
7. Yapıların doğru montajını doğrulamak için bakteri kolonilerini PCR ile tarayın.
8. Standart bir plazmit saflaştırma kiti kullanarak plazmit DNA'sını saflaştırın ve birleştirilen plazmitlerin bütünlüğünü ve dizisini doğrulamak için Sanger dizilimi gerçekleştirin.

2. Maya suşlarının dönüşümü

NOT: Maya dönüşüm protokolü, S. eubayanus¹⁶ için daha önce belirlenmiş bir yöntemden uyarlanmış ve diğer Saccharomyces türlerine ve fermentatif maya suşlarına başarıyla uygulanmıştır. Bu protokol, Gietz Lab^15'in geleneksel maya dönüştürme yönteminden türetilmiştir. Bu yaklaşım, farklı maya suşlarını dönüştürmek için sağlam ve esnek bir yöntem sunarak, çeşitli deneysel koşullar altında verimli plazmit entegrasyonunu ve seçimini mümkün kılar. Higromisin basıncı altında epizomal plazmitin güvenilir bir şekilde seçilmesini ve korunmasını sağlar.

1. 20 ° C'de 20 ° C'de gece boyunca 200 rpm'de 5 mL YPD'de (% 1 w / v maya özütü,% 2 w / v pepton,% 2 w / v glikoz) tek bir taze yetiştirilmiş maya kolonisini ön kültürleyin.
2. Kültürü taze YPD ortamında 0.2'lik bir OD_620'ye seyreltin ve orta log fazına kadar 200 rpm'de çalkalama ile 20 ° C'de inkübe edin (OD₆₂₀ 0.4-0.6). Maya suşuna bağlı olarak, bu tipik olarak 3-4 saat gerektirir.
3. Hücreleri oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 21.380 × g'da santrifüjleme ile hasat edin, süpernatanı atın ve peleti 3x steril suyla yıkayın.
4. Yıkanmış hücreleri 100 μL 0.1 M lityum asetat içinde yeniden süspanse edin, adım 2.3'te açıklandığı gibi santrifüjleyin ve işlemi 2 kez tekrarlayın.
5. Aşağıdaki bileşenleri hücrelere şu sırayla ekleyin: 240 μL %50 w/v PEG-4000, 35 μL 1 M LiAc, 5 μL plazmit DNA (100 ng/μL), 20 μL tek sarmallı taşıyıcı DNA (ssDNA) daha önce 98 °C'de 10 dakika ısıtılmış. Dönüşüm karışımını homojen hale getirmek için hafifçe karıştırın.
6. Karışımı 20 °C'de 30 dakika inkübe edin, ardından 34 °C'de 55 dakika ısı şoku uygulayın. Isı şokundan sonra, yaklaşık% 0.1'lik bir nihai konsantrasyona 38 μL% 100 etanol ekleyin ve 34 ° C'de 5 dakika daha inkübe edin.
   NOT: Bu protokolde kullanılan sıcaklıklar, ılıman ormanlardan izole edilen kriyototoleranslı bir tür olan Saccharomyces eubayanus için optimize edilmiştir.
   Hücresel stresi indüklemek için %100 etanol kullanılması gerekir ve bu da dönüşüm protokolünün verimliliğini artırır.
7. Dönüştürülmüş hücrelere 600 μL YPD ekleyin, adım 2.3'teki gibi santrifüjleyin ve süpernatanı atın.
8. Hücre peletini 600 μL taze YPD içinde yeniden süspanse edin ve geri kazanımı sağlamak için süspansiyonu gece boyunca 4 ° C'de çalkalamadan inkübe edin.
9. Dönüştürülmüş hücreleri 200 μg / mL higromisin ile takviye edilmiş YPD agar üzerine yerleştirin ve 20 ° C-30 ° C'de 48-72 saat inkübe edin.
10. Dönüşüm plakalarından 10-12 koloni seçin ve plazmidin varlığını sağlamak ve daha sonraki kullanım için seçilen kolonilerin karışık bir yamasını oluşturmak için bunları 200 μg/mL higromisin içeren YPD agar üzerine yeniden çizin.

3. Lüminesansın doğrulanması

NOT: Lüminesan raportörlerin işlevselliğini doğrulamak için, dönüştürülmüş suşlar, lusiferaz raportörünün diferansiyel ifadesini indüklemek için tasarlanmış koşullar altında test edildi. Bu aşamalı doğrulama, gerçek zamanlı metabolik tepkileri yakalamak için ışıldayan tahlillerin sağlamlığından yararlanarak, dalgalanan şeker koşulları altında raporlayıcı işlevselliğinin değerlendirilmesine olanak tanır.

1. Dönüştürülmüş bir maya suşu yamasından bir numune seçin ve bunu %5 w/v glikoz ve 200 μM higromisin içeren YP ortamına (%1 a/v maya özütü, %2/v pepton) aşılayın. 25 °C'de 24 saat çalkalamadan inkübe edin. Kültürleri taze ortamda 1:10 oranında seyreltin ve aynı koşullar altında 24 saat daha inkübe edin.
2. Hücreleri şekersiz YP besiyeri ile yıkayın ve 1:10 oranında seyreltilerek test ortamına aşılayın. Test ortamı, 3 mM'lik bir nihai konsantrasyona kadar lusiferin ile desteklenir ve plazmit stabilitesini korumak için 200 μM higromisin içerir.
3. Karışık şeker büyüme testi için, aşağıdaki konsantrasyonlara (% a/h) sahip bir glikoz-maltoz matrisi kullanın: glikoz (%0, %0.5, %1, %2) ve maltoz (%0, %2, %5, %10, %2, %30) YP ortamında. Her koşul lusiferin (3 mM nihai konsantrasyon) ve 200 μM higromisin ile desteklenir. 96 oyuklu bir plakanın her bir oyuğuna 200 μL kültür dağıtın (Şekil 2).
4. Lüminesansı ve OD_620'yi bir luminometre plaka okuyucu kullanarak 72 saat boyunca her 30 dakikada bir, zayıflama ve 1 sn entegrasyon süresi olmadan ölçün, sürekli raporlayıcı etkinliği ve hücre yoğunluğu izleme sağlayın.

4. Fermantasyon örneklemesi ve lüminesans izleme

NOT: Dönüştürülmüş suşlar, fermantasyon sırasında lüminesans aktivasyonunu değerlendirmek için kontrollü mikro fermantasyon koşullarına tabi tutuldu. Bu, farklı fermantasyon koşullarında lüminesans aktivasyonunun karşılaştırılmasını sağlayarak, uzun fermantasyon süreleri boyunca maya metabolik tepkileri hakkında bilgi sağlar.

1. Malt ekstraktını suda çözerek malt ekstraktı ortamını (12 ° Plato) hazırlayın ve 100 ° C'de 20 dakika sterilize edin. Aşılamadan önce ortamın oda sıcaklığına soğumasını bekleyin.
2. Ön kültür, maya suşlarını 5 mL YPD'de (%1 a/v maya özütü, %2 w/v pepton, %2 w/v glikoz) 20 ° C'de 24 saat boyunca 200 rpm'de çalkalama ile dönüştürdü. Ön kültürü 50 mL malt ekstrakt ortamına aktarın. Kültürü 20 ° C'de 24 saat boyunca 200 rpm'de çalkalama ile inkübe edin.
3. Hücreleri, oda sıcaklığında 1 dakika boyunca 21.380 × g'da santrifüjleme ile hasat edin ve 12 ° Plato malt özü ortamı^9'da üçlü 50 mL mikro fermantasyonlar hazırlamak için yeniden süspanse edin. Fermantasyon performansını artırmak için, ortamı 0.3 mg / L ZnCl₂ ile destekleyin.
4. Replikasyonlar arasında tutarlı hücre yoğunlukları sağlamak için, aşağıdaki formülü kullanarak aşı hacmini hesaplayın:
   Aşı hacmi = (1.5 × 10⁶) × Hacim (mL) × derece Plato
5. Hazırlanan besiyerini aşılayın ve kültürleri 14 gün boyunca çalkalamadan 20 ° C'de inkübe edin. Günlük CO₂ kaybını kaydederek fermantasyon ilerlemesini izleyin. CO₂ üretiminin bir göstergesi olarak kümülatif kilo kaybını ölçmek için kapları her gün aynı anda tartın.
6. Lüminesans izleme için, her mikrofermantasyondan periyodik olarak 200 μL numune alın. 3 mM'lik bir nihai konsantrasyon elde etmek için numunelere lusiferin ekleyin ve zayıflama ve 1 s entegrasyon süresi olmadan bir luminometre plaka okuyucusu kullanarak lüminesansı ve OD_620'yi ölçün. Fermantasyon süresi boyunca belirli aralıklarla ölçümler yapın (Şekil 3).

Sonuçlar

Aşağıdaki sonuçlar, fermentatif bir süreçte maya hücrelerinde glikozdan maltoza geçişi izlemek için yeni oluşturulan ışıldayan raportörün kullanılabilirliğini göstermektedir. Raportör plazmitler başlangıçta epizomal raportör yapıları oluşturmak için maya rekombinasyonel klonlama¹³ kullanılarak birleştirilir. Bu işlem, tümü Şekil 1'de gösterilen farklı amplikonlar arasında en az 30 nükleotidin ört...

Tartışmalar

Bu çalışma, metabolik geçişler altında S. eubayanus'ta transkripsiyonel aktivasyonu izlemek için bir epizomal biyolüminesan raportörün etkinliğini göstermektedir. MAL32'yi transkripsiyonel raportör¹¹ olarak kullanarak, suşa özgü adaptasyonları anlamak için sağlam bir çerçeve sağlayarak temel metabolik geçişleri gerçek zamanlı olarak izleyebiliriz. Maltoz metabolizmasındaki rolleri nedeniyle seçilen bu raportör, mayada...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001