In vivo Monitorización de la actividad transcripcional durante la transición metabólica mediante un reportero bioluminiscente en levadura

Resumen

Este protocolo emplea un reportero bioluminiscente, lo que permite mediciones de la actividad transcripcional en Saccharomyces eubayanus para monitorear la transición de glucosa a maltosa, lo que permite el análisis en tiempo real de las adaptaciones metabólicas y apoya la optimización de la cepa para la fermentación industrial en diversas condiciones.

Resumen

El consumo secuencial de azúcar, desde una fuente de azúcar preferida a una menos preferida, representa una adaptación metabólica crítica en la levadura, que es particularmente relevante para la supervivencia en ambientes fluctuantes como los que se encuentran en la fermentación de la cerveza. Sin embargo, las transiciones de azúcar son una variable ambiental difícil de predecir y detectar, que afecta el resultado de las fermentaciones de la cerveza. Este protocolo describe un sistema in vivo para monitorear la activación transcripcional asociada con el cambio metabólico de glucosa a maltosa en Saccharomyces eubayanus que se aplica a diferentes cepas de levadura silvestre de Saccharomyces .

El sistema emplea un reportero transcripcional bioluminiscente episomal para el metabolismo de la maltosa, centrándose en MAL32, ya que proporciona una buena lectura de los cambios metabólicos, tal y como se estudia en S. cerevisiae. Para ello, se transformaron cepas de levadura con plásmidos que contenían la región reguladora MAL32 de S. eubayanus, controlando la expresión de un gen que codifica para una versión desestabilizada de la luciferasa 1 de luciérnaga^de luciérnaga, y un gen de resistencia a la higromicina utilizado exclusivamente durante la transformación para asegurar la adquisición de plásmidos. Después de la selección, las células de levadura transformadas se pueden cultivar en condiciones no selectivas, ya que el plásmido episomal permanece estable en condiciones de cultivo durante un máximo de 7 días.

Este sistema se validó en un entorno complejo de azúcar en ensayos de microfermentación, lo que confirma la eficacia del indicador de luciferasa para informar sobre las transiciones metabólicas. Las muestras se recogieron regularmente y se analizaron con un luminómetro, lo que proporcionó información continua sobre las respuestas de la levadura. Si bien es ampliamente aplicable, este protocolo es particularmente valioso para evaluar el rendimiento de la levadura en condiciones de fermentación, donde los cambios metabólicos plantean un desafío significativo. Además, esta metodología se puede adaptar mediante la selección de promotores alternativos para explorar una gama más amplia de respuestas a los cambios ambientales, lo que permite la caracterización y optimización de cepas de levaduras silvestres para diversas aplicaciones industriales.

Introducción

Los microorganismos, como las levaduras, deben adaptarse constantemente a las condiciones ambientales dinámicas para mantenerse en forma y sobrevivir¹. Estas adaptaciones a menudo involucran circuitos reguladores de genes complejos que integran múltiples señales extracelulares para orquestar respuestas metabólicas precisas ^2,3. En entornos industriales, la eficiencia de estas transiciones metabólicas es crítica, particularmente en los procesos de fermentación donde las interrupciones pueden conducir a rendimientos subóptimos o fermentaciones incompletas³. Un desafío metabólico clave que se debe superar es cuando las células pasan de una fuente de carbono preferida a una secundaria, como el cambio de glucosa a maltosa. Este proceso introduce una fase de retraso durante la cual los genes necesarios para el metabolismo de las fuentes secundarias de carbono se suprimen, lo que permite la reanudación del crecimiento ^4,5.

En la elaboración de cerveza, las levaduras Saccharomyces deben realizar una transición eficiente del metabolismo de la glucosa al de la maltosa. En particular, S. eubayanus, la especie parental de levaduras lager tolerantes al frío, muestra una variabilidad fenotípica sustancial en su capacidad para adaptarse a tales transiciones⁶. Los aislados silvestres, como los de la Patagonia, a menudo presentan fases de retraso prolongadas y un consumo de maltosa más lento en comparación con las cepas domesticadas, que han sido seleccionadas por sus capacidades fermentativas optimizadas ^7,8. Mientras que las cepas domesticadas se han adaptado a fermentar ambientes de azúcar mixto de manera eficiente, las cepas silvestres a menudo muestran una transición metabólica más lenta, posiblemente debido a una represión de glucosa más fuerte y una regulación variable del locus MAL ^6,9.

Este estudio utiliza la variabilidad natural de S. eubayanus como modelo para investigar las adaptaciones metabólicas en condiciones de glucosa a maltosa, aprovechando un reportero de luciferasa episomal desestabilizado para monitorear la expresión génica in vivo, mediante el seguimiento de la luminiscencia¹. El reportero seleccionado MAL32 codifica una proteína maltasa, una enzima fundamental para el catabolismo de la maltosa durante las transiciones de glucosa a maltosa^10,11. Sorprendentemente, el promotor de MAL32 representa un marcador exitoso para evaluar la inducción del metabolismo de la maltosa después de la depleción de glucosa¹². Al incorporar este sistema de reporteros, nuestro objetivo era dilucidar los mecanismos adaptativos específicos de la cepa e identificar posibles objetivos para optimizar el rendimiento de la fermentación. Además, este protocolo puede expandirse más allá de la elaboración de cerveza, ofreciendo aplicaciones en biotecnología y estudios ambientales donde los entornos complejos de azúcar juegan un papel importante. La comprensión de los determinantes genéticos y reguladores de las respuestas ambientales fluctuantes en S. eubayanus mejora nuestro conocimiento de la fisiología de la levadura, apoyando el desarrollo de cepas robustas para diversas aplicaciones industriales y de investigación.

Protocolo

1. Construcción de reporteros episomales

NOTA: Seleccionamos una región reguladora reportera con base en la literatura sobre levaduras para construir el plásmido episomal para monitorear el consumo de maltosa ^6,11,12. El promotor del gen reportero candidato se definió como la secuencia reguladora inmediatamente aguas arriba desde el ORF candidato hasta el nucleótido que flanquea el ORF adyacente aguas arriba. Esta región se amplificó a partir del ADN genómico de S. eubayanus CBS12357 cepa^{de referencia T 10}. Este enfoque garantiza la construcción de alta fidelidad de plásmidos episomales adecuados para aplicaciones posteriores, incluido el estudio de otras condiciones interesantes en levaduras.

1. Diseñe los fragmentos de ADN y los cebadores superpuestos para incluir 30 secuencias de emparejamiento de nucleótidos entre fragmentos para un ensamblaje sin interrupciones a través de la clonación recombinacional de levaduras¹³ (Figura 1). Consulte la Tabla Suplementaria S1 para ver las secuencias de cebadores.
2. Para evitar mutaciones, amplifique la región promotora (ver arriba), así como la luciferasa desestabilizada (LUC-PEST) y los casetes hphMX ¹ utilizando una ADN polimerasa de alta fidelidad (consulte al fabricante de la polimerasa para obtener detalles del protocolo). Ajuste el termociclador a 98 °C durante 10 minutos para la desnaturalización inicial, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 98 °C, recocido a 60 °C y extensión a 72 °C; completar el protocolo con una extensión final a 72 °C durante 10 min.
   NOTA: Cuando se utilizan plásmidos de lanzadera de levadura como plantillas para PCR, se recomienda someter las reacciones de amplicones a una digestión con DpnI (consulte el protocolo del fabricante de la enzima) para eliminar cualquier rastro de plásmido molde que pueda interferir con la transformación de la levadura.
3. Digiera la columna vertebral del plásmido pRS426¹⁴ con enzimas de restricción EcoRI y XhoI para linealizar el vector, cortarlo en el sitio de clonación múltiple y prepararlo para la recombinación (consulte el protocolo del fabricante de la enzima).
4. Mezcle la columna vertebral linealizada de pRS426 con los fragmentos de ADN amplificados y transforme la mezcla en Saccharomyces cerevisiae BY4741 utilizando clonación recombinatoria de levadura^13,15 para permitir que la maquinaria de recombinación homóloga de la levadura ensamble la construcción del plásmido in vivo.
5. Coloque la levadura transformada en un medio sintético completo (SC) que carezca de uracilo (SC-URA) para seleccionar transformantes auxotróficos que contengan el nuevo plásmido pRS426-MAL32-LUC-hphMX .
6. Extraiga plásmidos de la levadura utilizando un minikit de preparación de levadura de acuerdo con las instrucciones del fabricante y transforme el plásmido extraído en Escherichia coli DH5α para amplificar la construcción para análisis posteriores.
7. Cribado de colonias bacterianas mediante PCR para confirmar el correcto ensamblaje de las construcciones.
8. Purifique el ADN del plásmido utilizando un kit de purificación de plásmidos estándar y realice la secuenciación Sanger para verificar la integridad y la secuencia de los plásmidos ensamblados.

2. Transformación de cepas de levadura

NOTA: El protocolo de transformación de levaduras se adaptó a partir de un método previamente establecido para S. eubayanus¹⁶ y se aplicó con éxito a otras especies de Saccharomyces y cepas de levaduras fermentativas. Este protocolo se derivó del método tradicional de transformación de levadura del Gietz Lab¹⁵. Este enfoque permite la integración y selección eficiente de plásmidos en diversas condiciones experimentales, ofreciendo un método robusto y flexible para transformar diferentes cepas de levadura. Garantiza la selección y el mantenimiento fiables del plásmido episomal bajo presión de higromicina.

1. Precultivo de una sola colonia de levadura recién cultivada en 5 mL de YPD (1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de peptona, 2% p/v de glucosa) a 20 °C a 200 rpm de agitación durante la noche.
2. Diluir el cultivo a un DO₆₂₀ de 0,2 en medio fresco de YPD e incubar a 20 °C con agitación a 200 rpm hasta la fase mitad del registro (DO₆₂₀ 0,4-0,6). Dependiendo de la cepa de levadura, esto suele requerir 3-4 h.
3. Recolectar las células por centrifugación a 21.380 × g durante 1 min a temperatura ambiente, desechar el sobrenadante y lavar el pellet 3 veces con agua estéril.
4. Vuelva a suspender las células lavadas en 100 μL de acetato de litio 0,1 M, centrifugar como se describe en el paso 2.3 y repita el proceso 2 veces.
5. Agregue los siguientes componentes a las celdas en este orden: 240 μL de PEG-4000 al 50% p/v, 35 μL de LiAc 1 M, 5 μL de ADN plasmídico (100 ng/μL), 20 μL de ADN portador monocatenario (ssDNA) previamente calentado a 98 °C durante 10 min. Mezclar suavemente para homogeneizar la mezcla de transformación.
6. Incubar la mezcla a 20 °C durante 30 min, seguido de un choque térmico a 34 °C durante 55 min. Después del choque térmico, añadir 38 μL de etanol al 100% hasta una concentración final de casi el 0,1% e incubar durante 5 minutos más a 34 °C.
   NOTA: Las temperaturas utilizadas en este protocolo están optimizadas para Saccharomyces eubayanus, una cepa criotolerante aislada de bosques templados.
   Se requiere el uso de etanol al 100% para inducir estrés celular, lo que mejora la eficiencia del protocolo de transformación.
7. Agregue 600 μL de YPD a las células transformadas, centrifugue como en el paso 2.3 y deseche el sobrenadante.
8. Vuelva a suspender el pellet celular en 600 μL de YPD fresco e incube la suspensión sin agitación durante la noche a 4 °C para permitir la recuperación.
9. Colocar las células transformadas en agar YPD suplementado con 200 μg/mL de higromicina e incubar a 20 °C-30 °C durante 48-72 h.
10. Seleccione 10-12 colonias de las placas de transformación y vuelva a colocarlas en agar YPD que contenga 200 μg/mL de higromicina para garantizar la presencia del plásmido y generar un parche mixto de las colonias seleccionadas para su uso posterior.

3. Validación de la luminiscencia

NOTA: Para validar la funcionalidad de los reporteros luminiscentes, se probaron cepas transformadas en condiciones diseñadas para inducir la expresión diferencial del reportero de luciferasa. Esta validación escalonada permite evaluar la funcionalidad del indicador en condiciones fluctuantes de azúcar, aprovechando la solidez de los ensayos luminiscentes para capturar respuestas metabólicas en tiempo real.

1. Elija una muestra de un parche de cepa de levadura transformada e inocule en medio YP (1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de peptona) que contenga 5% p/v de glucosa y 200 μM de higromicina. Incubar a 25 °C sin agitar durante 24 h. Refrescar los cultivos en medio fresco a una dilución de 1:10 e incubar en las mismas condiciones durante otras 24 h.
2. Lave las células con medio YP sin azúcar e inocule en el medio de prueba en una dilución de 1:10. El medio de prueba se complementa con luciferina hasta una concentración final de 3 mM y contiene 200 μM de higromicina para mantener la estabilidad del plásmido.
3. Para las pruebas de crecimiento de azúcar mezclada, utilice una matriz de glucosa-maltosa con las siguientes concentraciones (% p/v): glucosa (0%, 0,5%, 1%, 2%) y maltosa (0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) en medio YP. Cada condición se complementa con luciferina (concentración final de 3 mM) y 200 μM de higromicina. Dispense 200 μL de cultivo en cada pocillo de una placa de 96 pocillos (Figura 2).
4. Mida la luminiscencia y el diámetro exterior₆₂₀ cada 30 min durante 72 h utilizando un lector de placas luminométricas, sin atenuación y 1 s de tiempo de integración, lo que garantiza la actividad reportera continua y la monitorización de la densidad celular.

4. Muestreo de fermentación y control de luminiscencia

NOTA: Las cepas transformadas se sometieron a condiciones controladas de microfermentación para evaluar la activación de la luminiscencia durante la fermentación. Esto permite comparar la activación de la luminiscencia en diferentes condiciones de fermentación, proporcionando información sobre las respuestas metabólicas de la levadura durante períodos de fermentación prolongados.

1. Preparar el medio de extracto de malta (12 °Plato) disolviendo el extracto de malta en agua y esterilizar a 100 °C durante 20 min. Deje que el medio se enfríe a temperatura ambiente antes de la inoculación.
2. Precultivo de cepas de levadura transformadas en 5 mL de YPD (1% p/v de extracto de levadura, 2% p/v de peptona, 2% p/v de glucosa) a 20 °C con agitación a 200 rpm durante 24 h. Transfiera el precultivo a 50 mL de medio de extracto de malta. Incubar el cultivo a 20 °C con agitación a 200 rpm durante 24 h.
3. Cosechar las células por centrifugación a 21.380 × g durante 1 min a temperatura ambiente y resuspenderlas para preparar micro fermentaciones triplicadas de 50 mL en medio de extracto de malta 12 °Plato⁹. Para mejorar el rendimiento de la fermentación, suplementar el medio con 0,3 mg/L de ZnCl₂.
4. Para garantizar densidades celulares consistentes en todas las réplicas, calcule el volumen de inóculo utilizando la fórmula:
   Volumen de inóculo = (1,5 × 10⁶) Volumen × (mL) × Grados Plato
5. Inocular el medio preparado e incubar los cultivos a 20 °C sin agitar durante 14 días. Controle el progreso de la fermentación registrando la pérdida de_CO2 diariamente. Pesar los recipientes simultáneamente cada día para medir la pérdida de peso acumulada como indicador de la producción de CO₂ .
6. Para el control de la luminiscencia, muestree periódicamente 200 μL de cada microfermentación. Añada luciferina a las muestras para lograr una concentración final de 3 mM y mida la luminiscencia y el diámetro exterior₆₂₀ utilizando un lector de placas luminométrica sin atenuación y 1 s de tiempo de integración. Realice mediciones a intervalos definidos a lo largo del período de fermentación (Figura 3).

Resultados

Los siguientes resultados demuestran la usabilidad del reportero luminiscente recién construido para monitorear la transición de glucosa a maltosa en células de levadura en un proceso fermentativo. Los plásmidos reporteros se ensamblan inicialmente utilizando clonación recombinacional de levadura¹³ para generar construcciones reporteras episomales. Este proceso requiere la superposición de secuencias de nucleótidos de al menos 30 nucleótidos entre los dife...

Discusión

Este estudio demuestra la efectividad de un reportero bioluminiscente episomal para monitorear la activación transcripcional en S. eubayanus bajo transiciones metabólicas. Al emplear MAL32 como reportero transcripcional¹¹, pudimos rastrear transiciones metabólicas clave en tiempo real, proporcionando un marco sólido para comprender las adaptaciones específicas de la cepa. Este reportero, seleccionado por su papel en el metabolismo de la malt...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001