In vivo Monitoramento da atividade transcricional durante a transição metabólica usando um repórter bioluminescente em levedura

Resumo

Este protocolo emprega um repórter bioluminescente, permitindo medições da atividade transcricional em Saccharomyces eubayanus para monitorar a transição glicose-maltose, permitindo a análise em tempo real das adaptações metabólicas e apoiando a otimização da cepa para fermentação industrial sob diversas condições.

Resumo

O consumo sequencial de açúcar, de uma fonte de açúcar preferida para uma menos preferida, representa uma adaptação metabólica crítica na levedura, que é particularmente relevante para a sobrevivência em ambientes flutuantes, como os encontrados na fermentação da cerveja. No entanto, as transições de açúcar são uma variável ambiental difícil de prever e detectar, impactando o resultado das fermentações da cerveja. Este protocolo descreve um sistema in vivo para monitorar a ativação transcricional associada ao deslocamento metabólico de glicose para maltose em Saccharomyces eubayanus que se aplica a diferentes cepas de leveduras selvagens de Saczaromyces .

O sistema emprega um repórter transcricional bioluminescente episômico para o metabolismo da maltose, com foco na MAL32, uma vez que fornece uma boa leitura para mudanças metabólicas, conforme estudado em S. cerevisiae. Para isso, cepas de leveduras foram transformadas com plasmídeos contendo a região regulatória MAL32 de S. eubayanus, controlando a expressão de um gene que codifica para uma versão desestabilizada da luciferase¹ do vaga-lume e um gene de resistência à higromicina usado exclusivamente durante a transformação para garantir a aquisição do plasmídeo. Após a seleção, as células de levedura transformadas podem ser cultivadas em condições não seletivas, pois o plasmídeo epissomal permanece estável em condições de cultura por até 7 dias.

Este sistema foi validado sob um ambiente complexo de açúcar em ensaios de microfermentação, confirmando a eficácia do repórter de luciferase em informar transições metabólicas. As amostras foram coletadas regularmente e analisadas com um luminômetro, fornecendo informações contínuas sobre as respostas das leveduras. Embora amplamente aplicável, este protocolo é particularmente valioso para avaliar o desempenho da levedura em condições de fermentação, onde as alterações metabólicas representam um desafio significativo. Além disso, essa metodologia pode ser adaptada selecionando promotores alternativos para explorar uma gama mais ampla de respostas às mudanças ambientais, permitindo a caracterização e otimização de cepas de leveduras selvagens para diversas aplicações industriais.

Introdução

Microrganismos como leveduras devem se adaptar constantemente a condições ambientais dinâmicas para manter a aptidão e sobreviver¹. Essas adaptações geralmente envolvem circuitos reguladores genéticos complexos que integram vários sinais extracelulares para orquestrar respostas metabólicas precisas ^2,3. Em ambientes industriais, a eficiência dessas transições metabólicas é crítica, particularmente em processos de fermentação onde as interrupções podem levar a rendimentos abaixo do ideal ou fermentações incompletas³. Um desafio metabólico importante a ser superado é quando as células fazem a transição de uma fonte de carbono preferida para uma fonte secundária, como a mudança de glicose para maltose. Esse processo introduz uma fase de defasagem durante a qual os genes necessários para o metabolismo das fontes secundárias de carbono são desreprimidos, permitindo a retomada do crescimento ^4,5.

Na fabricação de cerveja, as leveduras Saccharomyces devem fazer a transição eficiente do metabolismo da glicose para a maltose. Em particular, S. eubayanus, a espécie parental tolerante ao frio de leveduras lager, exibe variabilidade fenotípica substancial em sua capacidade de se adaptar a tais transições⁶. Isolados selvagens, como os da Patagônia, geralmente exibem fases de atraso prolongadas e consumo mais lento de maltose em comparação com cepas domesticadas, que foram selecionadas por suas capacidades fermentativas otimizadas ^7,8. Embora as cepas domesticadas tenham se adaptado para fermentar ambientes de açúcar misturado de forma eficiente, as cepas selvagens geralmente exibem uma transição metabólica mais lenta, potencialmente devido à repressão mais forte da glicose e à regulação variável do locus MAL ^6,9.

Este estudo utiliza a variabilidade natural de S. eubayanus como modelo para investigar adaptações metabólicas em condições de glicose para maltose, aproveitando um repórter de luciferase desestabilizada episomal para monitorar a expressão gênica in vivo, rastreando a luminescência¹. O repórter selecionado MAL32 codifica uma proteína maltase, uma enzima fundamental para o catabolismo da maltose durante as transições de glicose para maltose ^10,11. Notavelmente, o promotor MAL32 representa um marcador bem-sucedido para avaliar a indução do metabolismo da maltose após a depleção de glicose¹². Ao incorporar este sistema repórter, pretendemos elucidar os mecanismos adaptativos específicos da cepa e identificar alvos potenciais para otimizar o desempenho da fermentação. Além disso, este protocolo pode ser expandido para além da fabricação de cerveja, oferecendo aplicações em biotecnologia e estudos ambientais onde ambientes complexos de açúcar desempenham um papel significativo. Compreender os determinantes genéticos e regulatórios das respostas do ambiente flutuante em S. eubayanus aprimora nosso conhecimento da fisiologia da levedura, apoiando o desenvolvimento de cepas robustas para diversas aplicações industriais e de pesquisa.

Protocolo

1. Construção de repórteres episómicos

NOTA: Selecionamos uma região regulatória repórter com base na literatura de leveduras para construir o plasmídeo episômico para monitorar o consumo de maltose ^6,11,12. O promotor do gene repórter candidato foi definido como a sequência regulatória imediatamente a montante da ORF candidata até o nucleotídeo flanqueando a ORF adjacente a montante. Esta região foi amplificada a partir do DNA genômico de S. eubayanus CBS12357^{cepa T} de referência¹⁰. Essa abordagem garante a construção de alta fidelidade de plasmídeos epissómicos adequados para aplicações a jusante, incluindo o estudo de outras condições interessantes em leveduras.

1. Projete os fragmentos de DNA e primers sobrepostos para incluir 30 sequências de emparelhamento de nucleotídeos entre fragmentos para uma montagem perfeita por meio de clonagem recombinacional de levedura¹³ (Figura 1). Consulte a Tabela Suplementar S1 para sequências de primers.
2. Para evitar mutações, amplifique a região promotora (veja acima), bem como a luciferase desestabilizada (LUC-PEST) e os hphMX ¹ usando uma DNA polimerase de alta fidelidade (consulte o fabricante da polimerase para obter detalhes do protocolo). Defina o termociclador para 98 °C por 10 min para desnaturação inicial, seguido por 30 ciclos de desnaturação a 98 °C, recozimento de 60 °C e extensão de 72 °C; completar o protocolo com uma extensão final a 72 °C por 10 min.
   NOTA: Ao usar plasmídeos de transporte de levedura como modelos para PCR, recomenda-se submeter as reações de amplicon a uma digestão de DpnI (consulte o protocolo do fabricante da enzima) para eliminar quaisquer vestígios de plasmídeo molde que possam interferir na transformação da levedura.
3. Digerir o esqueleto do plasmídeo¹⁴ pRS426 com enzimas de restrição EcoRI e XhoI para linearizar o vetor, cortando-o no local de clonagem múltipla e preparando-o para recombinação (consulte o protocolo do fabricante da enzima).
4. Misture o esqueleto pRS426 linearizado com os fragmentos de DNA amplificados e transforme a mistura em Saccharomyces cerevisiae BY4741 usando clonagem recombinacional de levedura^13,15 para permitir que a maquinaria de recombinação homóloga da levedura monte a construção do plasmídeo in vivo.
5. Colocar a levedura transformada em um meio sintético completo (SC) sem uracila (SC-URA) para selecionar transformantes auxotróficos contendo o novo plasmídeo vetorial construído pRS426-MAL32-LUC-hphMX.
6. Extraia plasmídeos de leveduras usando um kit de mini-preparação de leveduras de acordo com as instruções do fabricante e transforme o plasmídeo extraído em Escherichia coli DH5α para amplificar a construção para análises posteriores.
7. Rastreie as colônias bacterianas via PCR para confirmar a montagem correta das construções.
8. Purifique o DNA do plasmídeo usando um kit de purificação de plasmídeo padrão e execute o sequenciamento Sanger para verificar a integridade e a sequência dos plasmídeos montados.

2. Transformação de cepas de levedura

NOTA: O protocolo de transformação de levedura foi adaptado de um método previamente estabelecido para S. eubayanus¹⁶ e aplicado com sucesso a outras espécies de Saccharomyces e cepas de leveduras fermentativas. Este protocolo foi derivado do método tradicional de transformação de levedura do Gietz Lab¹⁵. Essa abordagem permite a integração e seleção eficientes de plasmídeos sob diversas condições experimentais, oferecendo um método robusto e flexível para transformar diferentes cepas de leveduras. Ele garante a seleção e manutenção confiáveis do plasmídeo epissomal sob pressão de higromicina.

1. Pré-cultive uma única colônia de levedura recém-cultivada em 5 mL de YPD (1% p / v de extrato de levedura, 2% p / v de peptona, 2% p / v de glicose) a 20 ° C a 200 rpm de agitação durante a noite.
2. Diluir a cultura até um OD₆₂₀ de 0,2 em meio YPD fresco e incubar a 20 °C com agitação a 200 rpm até a fase intermediária (OD₆₂₀ 0,4-0,6). Dependendo da cepa de levedura, isso normalmente requer 3-4 h.
3. Colha as células por centrifugação a 21.380 × g por 1 min em temperatura ambiente, descarte o sobrenadante e lave o pellet 3x com água estéril.
4. Ressuspenda as células lavadas em 100 μL de acetato de lítio 0,1 M, centrifugue conforme descrito na etapa 2.3 e repita o processo 2x.
5. Adicione os seguintes componentes às células nesta ordem: 240 μL de 50% p / v PEG-4000, 35 μL de 1 M LiAc, 5 μL de DNA plasmidial (100 ng / μL), 20 μL de DNA transportador de fita simples (ssDNA) previamente aquecido a 98 ° C por 10 min. Misture delicadamente para homogeneizar a mistura de transformação.
6. Incubar a mistura a 20 °C durante 30 min, seguido de choque térmico a 34 °C durante 55 min. Após choque térmico, adicione 38 μL de etanol 100% a uma concentração final de quase 0,1% e incube por mais 5 min a 34 °C.
   NOTA: As temperaturas utilizadas neste protocolo são otimizadas para Saccharomyces eubayanus, uma cepa criotolerante isolada de florestas temperadas.
   O uso de etanol 100% é necessário para induzir o estresse celular, aumentando a eficiência do protocolo de transformação.
7. Adicione 600 μL de YPD às células transformadas, centrifugue como na etapa 2.3 e descarte o sobrenadante.
8. Ressuspender o sedimento celular em 600 μL de YPD fresco e incubar a suspensão sem agitação durante a noite a 4 °C para permitir a recuperação.
9. Coloque as células transformadas em ágar YPD suplementado com 200 μg / mL de higromicina e incube a 20 ° C-30 ° C por 48-72 h.
10. Selecione 10-12 colônias das placas de transformação e coloque-as novamente em ágar YPD contendo 200 μg / mL de higromicina para garantir a presença do plasmídeo e gerar uma mancha mista das colônias selecionadas para uso posterior.

3. Validação da luminescência

NOTA: Para validar a funcionalidade dos repórteres luminescentes, cepas transformadas foram testadas em condições projetadas para induzir a expressão diferencial do repórter de luciferase. Essa validação gradual permite a avaliação da funcionalidade do repórter sob condições flutuantes de açúcar, aproveitando a robustez dos ensaios luminescentes para capturar respostas metabólicas em tempo real.

1. Escolha uma amostra de um adesivo de cepa de levedura transformada e inocule-a em meio YP (1% p/v de extrato de levedura, 2% p/v de peptona) contendo 5% p/v de glicose e 200 μM de higromicina. Incubar a 25 °C sem agitar durante 24 h. Refrescar as culturas em meio fresco a uma diluição de 1:10 e incubar nas mesmas condições durante mais 24 horas.
2. Lave as células com meio YP sem açúcar e inocule-as no meio de teste em uma diluição de 1:10. O meio de teste é suplementado com luciferina até uma concentração final de 3 mM e contém 200 μM de higromicina para manter a estabilidade do plasmídeo.
3. Para o teste de crescimento de açúcares mistosos, use uma matriz glicose-maltose com as seguintes concentrações (% p / v): glicose (0%, 0,5%, 1%, 2%) e maltose (0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) em meio YP. Cada condição é suplementada com luciferina (concentração final de 3 mM) e higromicina 200 μM. Dispense 200 μL de cultura em cada poço de uma placa de 96 poços (Figura 2).
4. Meça a luminescência e o OD₆₂₀ a cada 30 min por 72 h usando um leitor de placas de luminômetro, sem atenuação e 1 s de tempo de integração, garantindo a atividade contínua do repórter e o monitoramento da densidade celular.

4. Amostragem de fermentação e monitoramento de luminescência

NOTA: As cepas transformadas foram submetidas a condições controladas de microfermentação para avaliar a ativação da luminescência durante a fermentação. Isso permite a comparação da ativação de luminescência em diferentes condições de fermentação, fornecendo informações sobre as respostas metabólicas da levedura durante longos períodos de fermentação.

1. Prepare o meio de extrato de malte (12 ° Plato) dissolvendo o extrato de malte em água e esterilize a 100 ° C por 20 min. Deixe o meio esfriar até a temperatura ambiente antes da inoculação.
2. Cepas de levedura transformadas em pré-cultura em 5 mL de YPD (1% p/v de extrato de levedura, 2% p/v de peptona, 2% p/v de glicose) a 20 °C com agitação a 200 rpm por 24 h. Transfira a pré-cultura para 50 mL de meio de extrato de malte. Incubar a cultura a 20 °C com agitação a 200 rpm durante 24 h.
3. Colha as células por centrifugação a 21.380 × g por 1 min em temperatura ambiente e ressuspenda-as para preparar microfermentações triplicadas de 50 mL em meio de extrato de malte Plato^{12 ° 9}. Para melhorar o desempenho da fermentação, suplemente o meio com 0,3 mg/L de ZnCl₂.
4. Para garantir densidades celulares consistentes entre os replicados, calcule o volume do inóculo usando a fórmula:
   Volume de inóculo = (1.5 × 10⁶) × Volume (mL) × Graus Plato
5. Inocular o meio preparado e incubar as culturas a 20 °C sem agitar durante 14 dias. Monitore o progresso da fermentação registrando a perda diária de CO₂ . Pese os recipientes simultaneamente todos os dias para medir a perda de peso cumulativa como um indicador da produção de CO₂ .
6. Para monitoramento de luminescência, amostre periodicamente 200 μL de cada microfermentação. Adicione luciferina às amostras para atingir uma concentração final de 3 mM e meça a luminescência e OD₆₂₀ usando um leitor de placas de luminômetro sem atenuação e 1 s de tempo de integração. Efectuar medições em intervalos definidos ao longo do período de fermentação (figura 3).

Resultados

Os resultados a seguir demonstram a usabilidade do repórter luminescente recém-construído para monitorar a transição de glicose para maltose em células de levedura em um processo fermentativo. Os plasmídeos repórter são inicialmente montados usando clonagem recombinacional de levedura¹³ para gerar construções repórter episómicas. Este processo requer a sobreposição da sequência de nucleotídeos de pelo menos 30 nucleotídeos entre os diferentes amp...

Discussão

Este estudo demonstra a eficácia de um repórter bioluminescente epissomal para monitorar a ativação transcricional em S. eubayanus sob transições metabólicas. Ao empregar o MAL32 como repórter transcricional¹¹, pudemos rastrear as principais transições metabólicas em tempo real, fornecendo uma estrutura robusta para entender as adaptações específicas da cepa. Este repórter, selecionado por seu papel no metabolismo da maltose, ofere...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001