생체 내 Monitoring of transcriptional activity during metabolic transition using a bioluminescent reporter in yeast(효모의 생물발광 리포터를 사용한 대사 전이 중 전사 활동 모니터링)

요약

이 프로토콜은 생물 발광 리포터를 사용하여 Saccharomyces eubayanus 의 전사 활성을 측정하여 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링함으로써 대사 적응의 실시간 분석을 가능하게 하고 다양한 조건에서 산업 발효를 위한 균주 최적화를 지원합니다.

초록

선호되는 설탕 공급원에서 덜 선호되는 설탕 공급원으로의 순차적인 설탕 소비는 효모의 중요한 대사 적응을 나타내며, 이는 맥주 발효에서 발견되는 것과 같이 변동하는 환경에서의 생존과 특히 관련이 있습니다. 그러나 설탕 전이는 예측 및 감지가 어려운 환경 변수이며 맥주 발효의 결과에 영향을 미칩니다. 이 프로토콜은 다양한 야생 사카로미세스 효모 균주에 적용되는 사카로미세스 유바야누스(Saccharomyces eubayanus)의 포도당-맥아당 대사 변화와 관련된 전사 활성화를 모니터링하기 위한 생체 내 시스템을 설명합니다.

이 시스템은 S. cerevisiae에서 연구된 바와 같이 대사 변화에 대한 좋은 판독값을 제공하기 때문에 MAL32에 초점을 맞춘 맥아당 대사에 대한 에피소드 생물 발광 전사 리포터를 사용합니다. 이를 위해 효모 균주를 S. eubayanus의 MAL32 조절 영역을 포함하는 플라스미드로 형질전환하여 반딧불이 루시페라제¹의 불안정한 버전에 대한 인코딩 유전자의 발현을 제어하고 플라스미드 획득을 보장하기 위해 형질전환 중에만 사용되는 하이그로마이신 내성 유전자의 발현을 제어했습니다. 선택 후, 형질전환된 효모 세포는 에피솜 플라스미드가 최대 7일 동안 배양 조건에서 안정적으로 유지되기 때문에 비선택적 조건에서 배양할 수 있습니다.

이 시스템은 미량 발효 분석의 복잡한 당 환경에서 검증되었으며, 대사 전이를 알리는 루시퍼라제 리포터의 효과를 확인했습니다. 샘플을 정기적으로 수집하고 광도계로 분석하여 효모 반응에 대한 지속적인 통찰력을 제공했습니다. 광범위하게 적용할 수 있지만, 이 프로토콜은 대사 변화가 심각한 문제를 제기하는 발효 조건에서 효모 성능을 평가하는 데 특히 유용합니다. 또한 이 방법론은 환경 변화에 대한 광범위한 반응을 탐색하기 위해 대체 프로모터를 선택하여 적용할 수 있으며, 이를 통해 다양한 산업 응용 분야를 위한 야생 효모 균주의 특성화 및 최적화를 수행할 수 있습니다.

서문

효모와 같은 미생물은 체력을 유지하고 생존하기 위해 역동적인 환경 조건에 지속적으로 적응해야 합니다¹. 이러한 적응은 종종 정확한 대사 반응을 조율하기 위해 여러 세포 외 신호를 통합하는 복잡한 유전자 조절 회로를 포함합니다 ^2,3. 산업 환경에서 이러한 대사 전환의 효율성은 매우 중요하며, 특히 중단으로 인해 최적이 아닌 수율 또는 불완전한 발효로 이어질 수 있는 발효 공정에서 매우 중요합니다³. 극복해야 할 주요 대사 과제는 세포가 포도당에서 맥아당으로의 전환과 같이 선호하는 탄소원에서 2차 탄소원으로 전환되는 경우입니다. 이 과정은 2차 탄소원의 대사에 필요한 유전자가 억제되어 성장 재개를 가능하게 하는 지연 단계를 도입합니다 ^4,5.

양조 과정에서 사카로마이세스 효모는 포도당에서 맥아당 대사로 효율적으로 전환해야 합니다. 특히, 라거 효모의 내한성 모종인 S. eubayanus는 이러한 전이에 적응하는 능력에서 상당한 표현형 변동성을 나타냅니다⁶. 파타고니아(Patagonia)에서 유래한 것과 같은 야생 분리물은 최적화된 발효 능력을 위해 선택된 길들여진 균주에 비해 장기간의 지연 단계와 느린 맥아당 소비를 보이는 경우가 많습니다 ^7,8. 가축화된 균주는 혼합 설탕 환경을 효율적으로 발효시키는 데 적응했지만, 야생 균주는 종종 더 느린 대사 전이를 보이는데, 이는 잠재적으로 더 강한 포도당 억제와 MAL 유전자 좌위 ^6,9의 가변 조절로 인해 가능합니다.

이 연구는 S. eubayanus의 자연적 변동성을 모델로 활용하여 포도당-맥아당 조건에서 대사 적응을 조사하고, 발광¹을 추적하여 생체 내 유전자 발현을 모니터링하기 위해 에피솜 불안정한 루시페라제 리포터를 활용합니다. 선택된 리포터 MAL32는 포도당에서 맥아당으로의 전이 동안 맥아당 이화작용의 중추적인 효소인 말타아제 단백질을 암호화합니다^10,11. 놀랍게도, MAL32 promoter는 포도당 고갈 후 maltose metabolism 유도를 평가하기 위한 성공적인 marker입니다¹². 이 리포터 시스템을 통합함으로써 우리는 균주별 적응 메커니즘을 규명하고 발효 성능을 최적화하기 위한 잠재적 목표를 식별하는 것을 목표로 했습니다. 또한 이 프로토콜은 양조를 넘어 확장될 수 있으며, 복잡한 설탕 환경이 중요한 역할을 하는 생명 공학 및 환경 연구에 응용 프로그램을 제공할 수 있습니다. S. eubayanus의 변동하는 환경 반응의 유전적 및 조절 결정 요인을 이해하면 효모 생리학에 대한 지식이 향상되어 다양한 산업 및 연구 응용 분야를 위한 강력한 균주 개발을 지원할 수 있습니다.

프로토콜

1. 에피소드 리포터 구축

참고: 맥아당 섭취를 모니터링하기 위한 에피솜 플라스미드를 구성하기 위해 효모 문헌을 기반으로 리포터 조절 영역을 선택했습니다 ^6,11,12. 후보 리포터 유전자의 프로모터는 후보 ORF로부터 인접한 업스트림 ORF의 측면에 있는 뉴클레오티드까지의 조절 서열로 정의되었습니다. 이 영역은 S. eubayanus ^{CBS12357 T} reference^{strain 10}의 게놈 DNA에서 증폭되었습니다. 이 접근법은 효모의 다른 흥미로운 조건 연구를 포함하여 다운스트림 응용 분야에 적합한 에피솜 플라스미드의 고충실도 구조를 보장합니다.

1. 효모 재조합 클로닝¹³ 을 통한 원활한 조립을 위해 단편 사이에 30개의 뉴클레오티드 쌍 서열을 포함하도록 DNA 단편과 겹치는 프라이머를 설계합니다(그림 1). 프라이머 서열에 대해서는 보충 표 S1 을 참조하십시오.
2. 돌연변이를 피하려면 high-fidelity DNA 중합효소를 사용하여 promoter 영역(위 참조)과 불안정화된 루시퍼라아제(LUC-PEST) 및 hphMX cassettes¹ 을 증폭합니다(프로토콜에 대한 자세한 내용은 polymerase 제조업체 참조). 초기 변성을 위해 thermocycler를 98 °C로 10 분 동안 설정 한 다음 98 ° C 변성, 60 ° C 어닐링 및 72 ° C 확장의 30 사이클을 설정합니다. 72°C에서 10분 동안 최종 확장으로 프로토콜을 완료합니다.
   참고: 효모 셔틀 플라스미드를 PCR용 템플릿으로 사용하는 경우, 효모 변형을 방해할 수 있는 템플릿 플라스미드의 흔적을 제거하기 위해 앰플리콘 반응을 DpnI 분해(효소 제조업체의 프로토콜 참조)에 적용하는 것이 좋습니다.
3. pRS426 plasmid¹⁴ backbone을 EcoRI 및 XhoI 제한 효소로 분해하여 벡터를 선형화하고, 다중 클로닝 부위에서 절단하고, 재조합을 위해 준비합니다(효소 제조업체의 프로토콜 참조).
4. 선형화된 pRS426 골격을 증폭된 DNA 단편과 혼합하고 효모 재조합 클로닝^13,15를 사용하여 혼합물을 Saccharomyces cerevisiae BY4741로 변환하여 효모의 상동 재조합 기계가 생체 내에서 플라스미드 구조를 조립할 수 있도록 합니다.
5. 규범적으로 구축된 벡터 pRS426-MAL32-LUC-hphMX 플라스미드를 함유하는 보조영양 형질전환체를 선택하기 위해 우라실(SC-URA)이 결핍된 합성 완전(SC) 배지에 형질전환된 효모를 플레이트화한다.
6. 제조업체의 지침에 따라 효모 mini-prep 키트를 사용하여 효모에서 플라스미드를 추출하고 추출된 플라스미드를 대장균 DH5α로 변환하여 추가 분석을 위해 구조체를 증폭합니다.
7. PCR을 통해 박테리아 집락을 스크리닝하여 구조체의 올바른 조립을 확인합니다.
8. 표준 플라스미드 정제 키트를 사용하여 플라스미드 DNA를 정제하고 Sanger 염기서열분석을 수행하여 조립된 플라스미드의 무결성과 염기서열을 검증합니다.

2. 효모 균주의 형질전환

참고: 효모 형질전환 프로토콜은 S. eubayanus¹⁶ 에 대해 이전에 확립된 방법을 채택하여 다른 사카로미세스 종 및 발효 효모 균주에 성공적으로 적용되었습니다. 이 프로토콜은 Gietz Lab¹⁵의 전통적인 효모 형질전환 방법에서 파생되었습니다. 이 접근법은 다양한 실험 조건에서 효율적인 플라스미드 통합 및 선택을 가능하게 하여 다양한 효모 균주를 변형시키기 위한 강력하고 유연한 방법을 제공합니다. 이는 hygromycin 압력 하에서 에피솜 플라스미드의 신뢰할 수 있는 선택 및 유지를 보장합니다.

1. 갓 자란 효모의 단일 콜로니를 5mL의 YPD(1% w/v 효모 추출물, 2% w/v 펩톤, 2% w/v 포도당)에서 20°C에서 하룻밤 동안 교반하여 전배양합니다.
2. 배양액을 신선한 YPD 배지에서 0.2의 OD₆₂₀ 으로 희석하고 20 °C에서 200 rpm에서 교반하여 중간 로그 단계 (OD₆₂₀ 0.4-0.6)까지 배양한다. 효모 균주에 따라 일반적으로 3-4시간이 소요됩니다.
3. 실온에서 1분 동안 21,380 × g 에서 원심분리하여 세포를 수확하고 상층액을 버리고 펠릿을 멸균수로 3x 세척합니다.
4. 세척된 세포를 100μL의 0.1M 리튬 아세테이트에 재현탁하고 2.3단계에서 설명한 대로 원심분리하고 이 과정을 2회 반복합니다.
5. 다음 성분을 이 순서로 세포에 추가합니다: 50% w/v PEG-4000 240 μL, 1 M LiAc 35 μL, 5 μL의 플라스미드 DNA(100 ng/μL), 20 μL의 단일 가닥 캐리어 DNA(ssDNA)를 98°C에서 10분 동안 가열했습니다. 형질전환 혼합물을 균질화하기 위해 부드럽게 혼합합니다.
6. 혼합물을 20°C에서 30분 동안 배양한 다음 34°C에서 55분 동안 열 충격을 가합니다. 열 충격 후 38μL의 100% 에탄올을 거의 0.1%의 최종 농도에 첨가하고 34°C에서 추가로 5분 동안 배양합니다.
   참고: 이 프로토콜에 사용된 온도는 온대림에서 분리된 극저온 내성 균주인 Saccharomyces eubayanus에 최적화되어 있습니다.
   세포 스트레스를 유발하기 위해서는 100% 에탄올을 사용해야 하며, 이를 통해 형질전환 프로토콜의 효율성을 높일 수 있습니다.
7. 형질전환된 세포에 600μL의 YPD를 첨가하고 2.3단계와 같이 원심분리한 후 상층액을 버립니다.
8. 세포 펠릿을 600μL의 신선한 YPD에 재현탁시키고 4°C에서 밤새 교반 없이 현탁액을 배양하여 회복을 가능하게 합니다.
9. 200 μg/mL 하이그로마이신이 보충된 YPD 한천에 형질전환된 세포를 플레이트화하고 20 °C-30 °C에서 48-72시간 동안 배양합니다.
10. 형질전환 플레이트에서 10-12개의 콜로니를 선택하고 200 μg/mL hygromycin을 함유한 YPD 한천에 다시 줄무늬를 만들어 플라스미드의 존재를 확인하고 추가 사용을 위해 선택한 콜로니의 혼합 패치를 생성합니다.

3. 발광의 검증

참고: 발광 리포터의 기능을 검증하기 위해 루시퍼라제 리포터의 차등 발현을 유도하도록 설계된 조건에서 변형된 균주를 테스트했습니다. 이 단계적 검증을 통해 변동하는 당 조건에서 리포터 기능을 평가할 수 있으며, 발광 분석법의 견고성을 활용하여 실시간 대사 반응을 포착할 수 있습니다.

1. 형질전환된 효모 균주 패치에서 샘플을 선택하고 5% w/v 포도당과 200μM 하이그로마이신을 함유한 YP 배지(1% w/v 효모 추출물, 2% w/v 펩톤)에 접종합니다. 24시간 동안 흔들지 않고 25°C에서 배양합니다. 1:10 희석으로 신선한 배지에서 배양물을 새로 고치고 동일한 조건에서 24시간 더 배양합니다.
2. 설탕이 없는 YP 배지로 세포를 세척하고 1:10 희석으로 테스트 배지에 접종합니다. 테스트 매체에는 최종 농도 3mM까지 루시페린이 보충되고 플라스미드 안정성을 유지하기 위해 200μM 하이그로마이신이 포함되어 있습니다.
3. 혼합당 성장 테스트의 경우, YP 배지에서 포도당(0%, 0.5%, 1%, 2%) 및 맥아당(0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) 농도(% w/v)의 포도당-맥아당 매트릭스를 사용합니다. 각 조건에는 루시페린(3mM 최종 농도) 및 200μM 하이그로마이신이 보충됩니다. 96웰 플레이트의 각 웰에 200μL의 배양액을 분배합니다(그림 2).
4. 발광계 플레이트 리더를 사용하여 감쇠 및 1초의 통합 시간 없이 72시간 동안 30분마다 발광 및 OD₆₂₀ 을 측정하여 지속적인 리포터 활동 및 세포 밀도 모니터링을 보장합니다.

4. 발효작용 표본 추출과 발광 감시

참고: 변형된 균주는 발효 중 발광 활성화를 평가하기 위해 제어된 미세 발효 조건에 적용되었습니다. 이를 통해 다양한 발효 조건에서 발광 활성화를 비교할 수 있으며, 연장된 발효 기간 동안 효모 대사 반응에 대한 통찰력을 얻을 수 있습니다.

1. 맥아 추출물을 물에 녹여 맥아 추출물 배지 (12 °Plato)를 준비하고 100 °C에서 20 분 동안 살균합니다. 접종하기 전에 배지를 실온으로 식히십시오.
2. 20°C에서 5mL의 YPD(1% w/v 효모 추출물, 2% w/v 펩톤, 2% w/v 포도당)에서 24시간 동안 200rpm에서 교반하면서 전배양 변형된 효모 균주를 변형시켰습니다. 사전 배양을 맥아 추출물 배지 50mL로 옮깁니다. 20 ° C에서 200 rpm에서 24 시간 동안 교반하면서 배양물을 배양합니다.
3. 실온에서 1분 동안 21,380 × g 에서 원심분리하여 세포를 수확하고 재현탁시켜 12°Plato malt extract 배지⁹에서 50mL 마이크로 발효를 3회 준비합니다. 발효 성능을 향상시키려면 배지에 0.3 mg/L ZnCl₂를 보충하십시오.
4. 반복 실험 전반에 걸쳐 일관된 세포 밀도를 보장하려면 다음 공식을 사용하여 접종물 부피를 계산하십시오.
   접종 부피 = (1.5 × 10⁶) × 부피 (mL) ×도 플라토
5. 제조된 배지를 접종하고 14일 동안 흔들지 않고 20°C에서 배양물을 배양합니다. 매일 CO₂ 손실을 기록하여 발효 진행 상황을 모니터링합니다. CO₂ 생산의 지표로 누적 중량 감소를 측정하기 위해 매일 동시에 용기의 무게를 측정합니다.
6. 발광 모니터링을 위해 각 미세발효에서 200μL를 주기적으로 샘플링하십시오. 샘플에 루시페린을 추가하여 3mM의 최종 농도를 달성하고 감쇠 없이 발광계 플레이트 리더를 사용하여 발광 및 OD₆₂₀ 을 측정하고 1초의 통합 시간을 측정합니다. 발효 기간 동안 정의된 간격으로 측정을 수행합니다(그림 3).

결과

다음 결과는 발효 공정에서 효모 세포의 포도당에서 맥아당으로의 전이를 모니터링하기 위해 새로 구성된 발광 리포터의 유용성을 보여줍니다. 리포터 플라스미드는 초기에 효모 재조합 클로닝¹³을 사용하여 조립되어 에피솜 리포터 구조체를 생성합니다. 이 과정에는 서로 다른 앰플리콘 사이에 최소 30개의 뉴클레오티드가 중첩되는 뉴클레오티드 서?...

토론

이 연구는 대사 전이에서 S. eubayanus의 전사 활성화를 모니터링하기 위한 에피솜 생물 발광 리포터의 효과를 보여줍니다. MAL32를 전사 리포터¹¹로 사용함으로써 주요 대사 전환을 실시간으로 추적할 수 있어 균주별 적응을 이해하기 위한 강력한 프레임워크를 제공할 수 있습니다. 맥아당 대사에서의 역할을 위해 선정된 이 리포터는 생체 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001