Im lebenden Organismus Überwachung der transkriptionellen Aktivität während des metabolischen Übergangs mit einem biolumineszierenden Reporter in Hefe

Zusammenfassung

Dieses Protokoll verwendet einen biolumineszierenden Reporter, der Messungen der transkriptionellen Aktivität in Saccharomyces eubayanus ermöglicht, um den Übergang von Glukose zu Maltose zu überwachen, eine Echtzeitanalyse metabolischer Anpassungen zu ermöglichen und die Stammoptimierung für die industrielle Fermentation unter verschiedenen Bedingungen zu unterstützen.

Zusammenfassung

Der sequentielle Zuckerkonsum, von einer bevorzugten Zuckerquelle zu einer weniger bevorzugten Zuckerquelle, stellt eine kritische metabolische Anpassung der Hefe dar, die besonders relevant für das Überleben in schwankenden Umgebungen ist, wie sie bei der Bierfermentation zu finden sind. Zuckerübergänge sind jedoch eine Umweltvariable, die schwer vorherzusagen und zu erkennen ist und sich auf das Ergebnis der Biergärung auswirkt. Dieses Protokoll beschreibt ein in vivo System zur Überwachung der transkriptionellen Aktivierung, die mit der metabolischen Verschiebung von Glukose zu Maltose in Saccharomyces eubayanus verbunden ist, die für verschiedene wilde Saccharomyces-Hefestämme gilt.

Das System verwendet einen episomalen biolumineszenten Transkriptionsreporter für den Maltosestoffwechsel, wobei der Schwerpunkt auf MAL32 liegt, da er eine gute Auslesung für metabolische Verschiebungen liefert, wie sie in S. cerevisiae untersucht wurden. Zu diesem Zweck wurden Hefestämme mit Plasmiden transformiert, die die MAL32-regulatorische Region von S. eubayanus enthielten, wobei die Expression eines Gens kontrolliert wurde, das für eine destabilisierte Version der Glühwürmchen-Luciferase¹ kodiert, und eines Hygromycin-Resistenzgens, das ausschließlich während der Transformation verwendet wurde, um den Plasmiderwerb sicherzustellen. Nach der Selektion können transformierte Hefezellen unter nicht-selektiven Bedingungen kultiviert werden, da das episomale Plasmid unter Kulturbedingungen bis zu 7 Tage stabil bleibt.

Dieses System wurde in Mikrofermentationsassays unter einer komplexen Zuckerumgebung validiert und bestätigte die Wirksamkeit des Luciferase-Reporters bei der Information über metabolische Übergänge. Die Proben wurden regelmäßig entnommen und mit einem Luminometer analysiert, was einen kontinuierlichen Einblick in die Reaktionen der Hefen ermöglichte. Obwohl dieses Protokoll breit anwendbar ist, ist es besonders wertvoll für die Beurteilung der Hefeleistung unter Fermentationsbedingungen, bei denen metabolische Veränderungen eine erhebliche Herausforderung darstellen. Darüber hinaus kann diese Methodik durch die Auswahl alternativer Promotoren angepasst werden, um ein breiteres Spektrum von Reaktionen auf Umweltveränderungen zu untersuchen und so die Charakterisierung und Optimierung von Wildhefestämmen für verschiedene industrielle Anwendungen zu ermöglichen.

Einleitung

Mikroorganismen wie Hefen müssen sich ständig an dynamische Umweltbedingungen anpassen, um fit zu bleiben und zu überleben¹. Diese Anpassungen beinhalten oft komplexe genregulatorische Schaltkreise, die mehrere extrazelluläre Signale integrieren, um präzise metabolische Reaktionen zu orchestrieren ^2,3. In industriellen Umgebungen ist die Effizienz dieser Stoffwechselübergänge von entscheidender Bedeutung, insbesondere bei Fermentationsprozessen, bei denen Störungen zu suboptimalen Ausbeuten oder unvollständigen Fermentationen führen können³. Eine zentrale metabolische Herausforderung, die es zu bewältigen gilt, besteht darin, dass Zellen von einer bevorzugten zu einer sekundären Kohlenstoffquelle übergehen, wie z. B. die Verschiebung von Glukose zu Maltose. Dieser Prozess leitet eine Verzögerungsphase ein, in der Gene, die für den Stoffwechsel der sekundären Kohlenstoffquellen benötigt werden, unterdrückt werden, was eine Wiederaufnahme des Wachstums ermöglicht ^4,5.

Beim Brauen müssen Saccharomyces-Hefen effizient vom Glukose- in den Maltosestoffwechsel übergehen. Insbesondere S. eubayanus, die kältetolerante Elternart der Lagerhefen, weist eine erhebliche phänotypische Variabilität in ihrer Fähigkeit auf, sich an solche Übergänge anzupassen⁶. Wildisolate, wie z. B. aus Patagonien, weisen im Vergleich zu domestizierten Stämmen, die aufgrund ihrer optimierten Fermentationskapazitäten ausgewählt wurden, häufig verlängerte Verzögerungsphasen und einen langsameren Maltoseverbrauch auf ^7,8. Während domestizierte Stämme sich an die effiziente Fermentation von Mischzuckerumgebungen angepasst haben, weisen wilde Stämme oft einen langsameren metabolischen Übergang auf, was möglicherweise auf eine stärkere Glukoseunterdrückung und eine variable Regulation des MAL-Locus^{zurückzuführen ist 6,9}.

Diese Studie nutzt die natürliche Variabilität von S. eubayanus als Modell, um metabolische Anpassungen unter Glukose-zu-Maltose-Bedingungen zu untersuchen, indem ein episomaler destabilisierter Luciferase-Reporter genutzt wird, um die Genexpression in vivo zu überwachen, indem Lumineszenz^{verfolgt wird 1}. Der ausgewählte Reporter MAL32 kodiert für ein Maltase-Protein, ein zentrales Enzym für den Maltose-Katabolismus während des Übergangs von Glukose zu Maltose^10,11. Bemerkenswert ist, dass der MAL32-Promotor einen erfolgreichen Marker für die Beurteilung der Induktion des Maltosestoffwechsels nach Glukosemangel darstellt¹². Durch die Einbeziehung dieses Reportersystems wollten wir stammspezifische adaptive Mechanismen aufklären und potenzielle Ziele für die Optimierung der Fermentationsleistung identifizieren. Darüber hinaus kann dieses Protokoll über das Brauen hinaus erweitert werden und bietet Anwendungen in der Biotechnologie und in Umweltstudien, bei denen komplexe Zuckerumgebungen eine wichtige Rolle spielen. Das Verständnis der genetischen und regulatorischen Determinanten fluktuanter Umweltreaktionen in S. eubayanus erweitert unser Wissen über die Hefephysiologie und unterstützt die Entwicklung robuster Stämme für verschiedene Industrie- und Forschungsanwendungen.

Protokoll

1. Konstruktion episomaler Reporter

HINWEIS: Wir wählten eine Reporter-Regulationsregion auf der Grundlage der Hefeliteratur aus, um das episomale Plasmid zur Überwachung des Maltoseverbrauchs^{zu konstruieren 6,11,12}. Der Promotor des Kandidaten-Reportergens wurde definiert als die regulatorische Sequenz unmittelbar stromaufwärts vom ORF-Kandidaten-Kandidaten bis zu dem Nukleotid, das den angrenzenden stromaufwärts gelegenen ORF flankiert. Diese Region wurde aus der genomischen DNA von S. eubayanus CBS12357^T Referenzstamm¹⁰ amplifiziert. Dieser Ansatz gewährleistet die High-Fidelity-Konstruktion von episomalen Plasmiden, die für nachgelagerte Anwendungen geeignet sind, einschließlich der Untersuchung anderer interessanter Bedingungen in Hefe.

1. Entwerfen Sie die DNA-Fragmente und überlappenden Primer so, dass sie 30 Nukleotidpaarungssequenzen zwischen den Fragmenten enthalten, um einen nahtlosen Zusammenbau durch rekombinatorische Klonierung von Hefen^{zu ermöglichen 13} (Abbildung 1). Siehe Ergänzende Tabelle S1 für Primersequenzen.
2. Um Mutationen zu vermeiden, amplifizieren Sie die Promotorregion (siehe oben) sowie die destabilisierte Luciferase (LUC-PEST) und die hphMX-Kassetten ¹ mit einer High-Fidelity-DNA-Polymerase (Einzelheiten zum Protokoll finden Sie beim Polymerasehersteller). Stellen Sie den Thermocycler für 10 Minuten auf 98 °C für die erste Denaturierung, gefolgt von 30 Zyklen mit 98 °C Denaturierung, 60 °C Glühen und 72 °C Verlängerung; Vervollständigen Sie das Protokoll mit einer abschließenden Verlängerung bei 72 °C für 10 Minuten.
   HINWEIS: Bei der Verwendung von Hefe-Shuttle-Plasmiden als Templates für die PCR wird empfohlen, Amplikonreaktionen einem DpnI-Verdau zu unterziehen (siehe Protokoll des Enzymherstellers), um alle Spuren von Template-Plasmid zu beseitigen, die die Hefetransformation beeinträchtigen könnten.
3. Verdauen Sie das Rückgrat des pRS426-Plasmids¹⁴ mit EcoRI- und XhoI-Restriktionsenzymen, um den Vektor zu linearisieren, ihn an der multiplen Klonierungsstelle zu schneiden und für die Rekombination vorzubereiten (siehe Protokoll des Enzymherstellers).
4. Mischen Sie das linearisierte pRS426-Rückgrat mit den amplifizierten DNA-Fragmenten und transformieren Sie das Gemisch in Saccharomyces cerevisiae BY4741 unter Verwendung der Hefe-Rekombinationskolonierung^13,15, damit die homologe Rekombinationsmaschinerie der Hefe das Plasmidkonstrukt in vivo zusammensetzen kann.
5. Die transformierte Hefe wird auf ein synthetisches vollständiges (SC) Medium ohne Uracil (SC-URA) aufgebracht, um auxotrophe Transformanten auszuwählen, die das neuartige konstruierte Vektor pRS426-MAL32-LUC-hphMX-Plasmid enthalten.
6. Extrahieren Sie Plasmide aus Hefe mit einem Hefe-Mini-Prep-Kit gemäß den Anweisungen des Herstellers und wandeln Sie das extrahierte Plasmid in Escherichia coli DH5α um, um das Konstrukt für weitere Analysen zu amplifizieren.
7. Screening von Bakterienkolonien mittels PCR, um den korrekten Zusammenbau der Konstrukte zu bestätigen.
8. Reinigen Sie die Plasmid-DNA mit einem Standard-Plasmid-Aufreinigungskit und führen Sie eine Sanger-Sequenzierung durch, um die Integrität und Sequenz der assemblierten Plasmide zu überprüfen.

2. Transformation von Hefestämmen

HINWEIS: Das Hefeumwandlungsprotokoll wurde von einer zuvor etablierten Methode für S. eubayanus¹⁶ angepasst und erfolgreich auf andere Saccharomyces-Spezies und fermentative Hefestämme angewendet. Dieses Protokoll wurde von der traditionellen Hefetransformationsmethode aus dem Gietz Lab¹⁵ abgeleitet. Dieser Ansatz ermöglicht eine effiziente Plasmidintegration und -selektion unter verschiedenen experimentellen Bedingungen und bietet eine robuste und flexible Methode zur Transformation verschiedener Hefestämme. Es gewährleistet eine zuverlässige Selektion und Aufrechterhaltung des episomalen Plasmids unter Hygromycindruck.

1. Eine einzelne Kolonie frisch gewachsener Hefe in 5 mL YPD (1 % w/v Hefeextrakt, 2 % w/v Pepton, 2 % w/v Glukose) bei 20 °C bei 200 U/min Rührwerk über Nacht vorkultivieren.
2. Die Kultur wird auf einen OD₆₂₀ von 0,2 in frischem YPD-Medium verdünnt und bei 20 °C unter Rühren bei 200 U/min bis zur Mitte der logarithmischen Phase (OD₆₂₀ 0,4-0,6) inkubiert. Je nach Hefestamm dauert dies typischerweise 3-4 h.
3. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 21.380 × g für 1 min bei Raumtemperatur, entsorgen Sie den Überstand und waschen Sie das Pellet 3x mit sterilem Wasser.
4. Die gewaschenen Zellen werden in 100 μl 0,1 M Lithiumacetat resuspendiert, wie in Schritt 2.3 beschrieben zentrifugiert und der Vorgang 2x wiederholt.
5. Fügen Sie den Zellen in dieser Reihenfolge die folgenden Komponenten hinzu: 240 μl 50 % w/v PEG-4000, 35 μl 1 M LiAc, 5 μl Plasmid-DNA (100 ng/μl), 20 μl einzelsträngige Träger-DNA (ssDNA), die zuvor 10 Minuten lang auf 98 °C erhitzt wurde. Vorsichtig mischen, um die Transformationsmischung zu homogenisieren.
6. Die Mischung wird 30 Minuten lang bei 20 °C inkubiert, gefolgt von einem Hitzeschock bei 34 °C für 55 Minuten. Nach dem Hitzeschock 38 μl 100 % Ethanol auf eine Endkonzentration von fast 0,1 % zugeben und weitere 5 Minuten bei 34 °C inkubieren.
   HINWEIS: Die in diesem Protokoll verwendeten Temperaturen sind für Saccharomyces eubayanus optimiert, einen kryotoleranten Stamm, der aus gemäßigten Wäldern isoliert wurde.
   Die Verwendung von 100% Ethanol ist erforderlich, um zellulären Stress zu induzieren und die Effizienz des Transformationsprotokolls zu erhöhen.
7. Geben Sie 600 μl YPD zu den transformierten Zellen, zentrifugieren Sie wie in Schritt 2.3 und verwerfen Sie den Überstand.
8. Das Zellpellet wird in 600 μl frischem YPD resuspendiert und die Suspension ohne Rühren über Nacht bei 4 °C inkubiert, um eine Wiederherstellung zu ermöglichen.
9. Die transformierten Zellen werden auf YPD-Agar mit 200 μg/ml Hygromycin gefüllt und bei 20 °C-30 °C für 48-72 h inkubiert.
10. Wählen Sie 10-12 Kolonien aus den Transformationsplatten aus und streichen Sie sie erneut auf YPD-Agar mit 200 μg/ml Hygromycin, um das Vorhandensein des Plasmids sicherzustellen und ein gemischtes Pflaster der ausgewählten Kolonien für die weitere Verwendung zu erzeugen.

3. Validierung der Lumineszenz

HINWEIS: Um die Funktionalität der lumineszierenden Reporter zu validieren, wurden transformierte Stämme unter Bedingungen getestet, die eine differentielle Expression des Luciferase-Reporters induzieren. Diese schrittweise Validierung ermöglicht die Bewertung der Reporterfunktionalität unter schwankenden Zuckerbedingungen, wobei die Robustheit von Lumineszenz-Assays genutzt wird, um metabolische Reaktionen in Echtzeit zu erfassen.

1. Entnehmen Sie eine Probe aus einem transformierten Hefestammpflaster und inokulieren Sie sie in YP-Medium (1 % w/v Hefeextrakt, 2 % w/v Pepton) mit 5 % w/v Glucose und 200 μM Hygromycin. 24 h lang bei 25 °C ohne Schütteln inkubieren. Die Kulturen werden in frischem Medium in einer Verdünnung von 1:10 aufgefrischt und unter den gleichen Bedingungen weitere 24 Stunden inkubiert.
2. Waschen Sie die Zellen mit YP-Medium ohne Zucker und inokulieren Sie sie in einer Verdünnung von 1:10 in das Testmedium. Das Testmedium wird mit Luciferin bis zu einer Endkonzentration von 3 mM ergänzt und enthält 200 μM Hygromycin, um die Plasmidstabilität zu erhalten.
3. Verwenden Sie für Wachstumstests mit Mischzucker eine Glukose-Maltose-Matrix mit den folgenden Konzentrationen (% w/v): Glukose (0 %, 0,5 %, 1 %, 2 %) und Maltose (0 %, 2 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %) in YP-Medium. Jede Bedingung wird mit Luciferin (3 mM Endkonzentration) und 200 μM Hygromycin ergänzt. Geben Sie 200 μl Kultur in jede Vertiefung einer 96-Well-Platte (Abbildung 2).
4. Messen Sie die Lumineszenz und OD₆₂₀ alle 30 Minuten für 72 Stunden mit einem Luminometer-Plattenlesegerät, ohne Dämpfung und mit einer Integrationszeit von 1 s, um eine kontinuierliche Überwachung der Reporteraktivität und der Zelldichte zu gewährleisten.

4. Fermentationsprobenahme und Lumineszenzüberwachung

HINWEIS: Transformierte Stämme wurden kontrollierten Mikrofermentationsbedingungen unterzogen, um die Lumineszenzaktivierung während der Fermentation zu bewerten. Dies ermöglicht den Vergleich der Lumineszenzaktivierung unter verschiedenen Fermentationsbedingungen und gibt Einblicke in die Stoffwechselreaktionen der Hefe während längerer Fermentationsperioden.

1. Malzextraktmedium (12 °Plato) herstellen, indem Malzextrakt in Wasser aufgelöst und bei 100 °C für 20 min sterilisiert wird. Lassen Sie das Medium vor der Inokulation auf Raumtemperatur abkühlen.
2. Vorkultivierte transformierte Hefestämme in 5 mL YPD (1 % w/v Hefeextrakt, 2 % w/v Pepton, 2 % w/v Glucose) bei 20 °C mit Rühren bei 200 U/min für 24 h. Die Vorkultur wird auf 50 ml Malzextraktmedium umgefüllt. Inkubieren Sie die Kultur bei 20 °C und rühren Sie sie bei 200 U/min für 24 h.
3. Ernten Sie die Zellen durch Zentrifugation bei 21.380 × g für 1 min bei Raumtemperatur und resuspendieren Sie sie, um dreifache 50 mL Mikrofermentationen in 12 °Plato Malzextrakt Medium⁹ vorzubereiten. Um die Fermentationsleistung zu verbessern, ergänzen Sie das Medium mit 0,3 mg/L ZnCl₂.
4. Um eine konsistente Zelldichte über alle Replikate hinweg zu gewährleisten, berechnen Sie das Inokulumvolumen mit der folgenden Formel:
   Inokulumvolumen = (1,5 × 10⁶) × Volumen (ml) × Grad Plato
5. Das vorbereitete Medium wird beimpft und die Kulturen werden 14 Tage lang bei 20 °C ohne Schütteln inkubiert. Überwachen Sie den Fermentationsfortschritt, indem Sie täglich den CO_{2 -} Verlust aufzeichnen. Wiegen Sie die Gefäße jeden Tag gleichzeitig, um den kumulativen Gewichtsverlust als Indikator für die CO₂ -Produktion zu messen.
6. Für die Lumineszenzüberwachung nehmen Sie regelmäßig eine Probe von 200 μl von jeder Mikrofermentation. Geben Sie Luciferin zu den Proben, um eine Endkonzentration von 3 mM zu erreichen, und messen Sie die Lumineszenz und OD₆₂₀ mit einem Luminometer-Plattenlesegerät ohne Dämpfung und 1 s Integrationszeit. Führen Sie Messungen in definierten Intervallen während der gesamten Fermentationszeit durch (Abbildung 3).

Ergebnisse

Die folgenden Ergebnisse zeigen die Eignung des neu konstruierten lumineszierenden Reporters zur Überwachung des Glukose-zu-Maltose-Übergangs in Hefezellen in einem fermentativen Prozess. Die Reporterplasmide werden zunächst unter Verwendung der Hefe-Rekombinationskolonierung¹³ assembliert, um episomale Reporterkonstrukte zu erzeugen. Dieser Prozess erfordert eine Überlappung der Nukleotidsequenz von mindestens 30 Nukleotiden zwischen den verschiedenen Ampliko...

Diskussion

Diese Studie zeigt die Wirksamkeit eines episomalen biolumineszierenden Reporters zur Überwachung der transkriptionellen Aktivierung in S. eubayanus unter metabolischen Übergängen. Durch die Verwendung von MAL32 als transkriptioneller Reporter¹¹ konnten wir wichtige metabolische Übergänge in Echtzeit verfolgen und so einen robusten Rahmen für das Verständnis stammspezifischer Anpassungen bieten. Dieser Reporter, der aufgrund seiner Rolle i...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001