体内研究 使用酵母中的生物发光报告基因监测代谢转变过程中的转录活性

摘要

该方案采用生物发光报告基因，允许测量 Saccharomyces eubayanus 中的转录活性以监测葡萄糖到麦芽糖的转变，从而能够实时分析代谢适应并支持不同条件下工业发酵的菌株优化。

摘要

从首选的糖源到不太首选的糖源，连续消耗糖代表了酵母中的关键代谢适应，这与在波动环境中的生存尤其相关，例如在啤酒发酵中发现的环境。然而，糖转变是一个难以预测和检测的环境变量，会影响啤酒发酵的结果。该方案描述了一种体内系统，用于监测与适用于不同野生酵母菌株的 Saccharomyces eubayanus 中的葡萄糖到麦芽糖代谢转变相关的转录激活。

该系统采用游离型生物发光转录报告基因进行麦芽糖代谢，专注于 MAL32，因为它为代谢变化提供了良好的读数，如在酿酒酵母中研究的那样。为此，用含有来自欧巴亚单胞菌的 MAL32 调节区的质粒转化酵母菌株，控制编码不稳定版本的萤火虫荧光素酶¹ 的基因的表达，以及仅在转化过程中使用的潮霉素抗性基因的表达，以确保质粒的获取。选择后，转化的酵母细胞可以在非选择性条件下培养，因为游离型质粒在培养条件下保持稳定长达 7 天。

该系统在复杂的糖环境中进行了微发酵测定的验证，证实了荧光素酶报告基因在通知代谢转变方面的有效性。定期收集样品并使用发光计进行分析，从而持续了解酵母反应。虽然适用范围广泛，但该方案对于评估发酵条件下的酵母性能特别有价值，其中代谢变化构成了重大挑战。此外，该方法可以通过选择替代启动子来适应，以探索对环境变化的更广泛的响应，从而允许为不同的工业应用表征和优化野生酵母菌株。

引言

酵母等微生物必须不断适应动态环境条件，以保持健康和生存¹。这些适应通常涉及复杂的基因调控回路，整合多个细胞外信号以协调精确的代谢反应 ^2,3。在工业环境中，这些代谢转变的效率至关重要，尤其是在发酵过程中，中断可能导致次优产量或不完全发酵³。需要克服的一个关键代谢挑战是细胞从首选碳源转变为次级碳源时，例如葡萄糖到麦芽糖的转变。这个过程引入了一个滞后阶段，在此期间，次生碳源代谢所需的基因被去抑制，从而能够恢复生长 ^4,5。

在酿造过程中，酵母菌必须有效地从葡萄糖过渡到麦芽糖代谢。特别是，S. eubayanus 是贮藏啤酒酵母的耐寒亲本物种，在适应这种转变的能力方面表现出很大的表型变异^{性 6}。与驯化菌株相比，野生分离株（例如来自巴塔哥尼亚的分离株）通常表现出较长的滞后阶段和较慢的麦芽糖消耗速度，驯化菌株因其优化的发酵能力而被选中 ^7,8。虽然驯化菌株已经有效地适应了发酵混合糖环境，但野生菌株通常表现出较慢的代谢转变，这可能是由于更强的葡萄糖抑制和 MAL 基因座的可变调节 ^6,9。

本研究利用 S. eubayanus 的自然变异性作为模型，研究葡萄糖到麦芽糖条件下的代谢适应，利用游离型不稳定的荧光素酶报告基因通过追踪发光¹ 来监测体内的基因表达。选定的报告基因 MAL32 编码麦芽糖酶蛋白，这是葡萄糖到麦芽糖转变期间麦芽糖分解代谢的关键酶^10,11。值得注意的是，MAL32 启动子代表了评估葡萄糖耗竭后麦芽糖代谢诱导的成功标志物¹²。通过整合这个报告基因系统，我们旨在阐明菌株特异性适应机制并确定优化发酵性能的潜在靶点。此外，该协议可以扩展到酿造之外，在复杂糖环境起重要作用的生物技术和环境研究中提供应用。了解 S. eubayanus 波动环境反应的遗传和调控决定因素增强了我们对酵母生理学的了解，支持为各种工业和研究应用开发稳健菌株。

研究方案

1. Episomal Reporters 的构建

注：我们根据酵母文献选择了一个报告调控区域来构建用于监测麦芽糖消耗的游离型质粒 ^6,11,12。候选报告基因的启动子被定义为从候选 ORF 上游到相邻上游 ORF 侧翼核苷酸的调节序列。该区域是从 S. eubayanus CBS12357^T 参考菌株¹⁰ 的基因组 DNA 中扩增的。这种方法确保了适用于下游应用的游离型质粒的高保真构建，包括研究酵母中的其他有趣条件。

1. 设计 DNA 片段和重叠引物，使其在片段之间包含 30 个核苷酸配对序列，以便通过酵母重组克隆¹³ 进行无缝组装（图 1）。引物序列见 补充表 S1 。
2. 为避免突变，使用高保真 DNA 聚合酶扩增启动子区域（见上文），以及不稳定的荧光素酶 （LUC-PEST） 和 hphMX 盒¹ （有关方案详细信息，请咨询聚合酶制造商）。将热循环仪设置为 98 °C 10 分钟进行初始变性，然后进行 30 次 98 °C 变性、60 °C 退火和 72 °C 延伸循环;在 72 °C 下完成最终延伸 10 分钟。
   注：当使用酵母穿梭质粒作为 PCR 模板时，建议对扩增子反应进行 DpnI 消化（参见酶制造商的方案），以消除任何可能干扰酵母转化的模板质粒痕迹。
3. 用 EcoRI 和 XhoI 限制性内切酶消化 pRS426 质粒¹⁴ 骨架以线性化载体，在多克隆位点切割，并准备重组（请参阅酶制造商的方案）。
4. 将线性化的 pRS426 骨架与扩增的 DNA 片段混合，并使用酵母重组克隆^13,15 将混合物转化到酿酒酵母 BY4741 中，以使酵母的同源重组机制在体内组装质粒构建体。
5. 将转化的酵母接种在缺乏尿嘧啶 （SC-URA） 的合成完全 （SC） 培养基上，以选择含有新型构建载体 pRS426-MAL32-LUC-hphMX 质粒的营养缺陷型转化体。
6. 根据制造商的说明，使用酵母小量制备试剂盒从酵母中提取质粒，并将提取的质粒转化到 大肠杆菌 DH5α 中以扩增构建体以进行进一步分析。
7. 通过 PCR 筛选细菌菌落，以确认构建体的正确组装。
8. 使用标准质粒纯化试剂盒纯化质粒 DNA，并进行 Sanger 测序以验证组装质粒的完整性和序列。

2. 酵母菌株的转化

注：酵母转化方案改编自先前建立的 S. eubayanus¹⁶ 方法，并成功应用于其他 酵母 菌物种和发酵酵母菌株。该方案源自 Gietz Lab¹⁵ 的传统酵母转化方法。这种方法能够在不同的实验条件下实现高效的质粒整合和选择，为转化不同的酵母菌株提供了一种稳健而灵活的方法。它确保在潮霉素压力下可靠地选择和维持游离质粒。

1. 在 20 °C 下以 200 rpm 的搅拌作用，在 5 mL YPD（1% w/v 酵母提取物、2% w/v 蛋白胨、2% w/v 葡萄糖）中预培养单个新鲜生长的酵母菌落过夜。
2. 在新鲜的 YPD 培养基中将培养物稀释至 OD₆₂₀ 为 0.2，并在 20 °C 下以 200 rpm 搅拌直至对数中期 （OD₆₂₀ 0.4-0.6）。根据酵母菌株，这通常需要 3-4 小时。
3. 通过在室温下以 21,380 × g 离心 1 分钟收获细胞，弃去上清液，并用无菌水洗涤沉淀 3 次。
4. 将洗涤后的细胞重悬于 100 μL 的 0.1 M 乙酸锂中，按照步骤 2.3 中的说明离心，然后重复该过程 2 次。
5. 按此顺序向细胞中添加以下组分：240 μL 50% w/v PEG-4000、35 μL 1 M LiAc、5 μL 质粒 DNA （100 ng/μL）、20 μL 单链载体 DNA （ssDNA） 预先在 98 °C 下加热 10 分钟。轻轻混合以均质化转化混合物。
6. 将混合物在 20 °C 下孵育 30 分钟，然后在 34 °C 下热休克 55 分钟。热休克后，加入 38 μL 100% 乙醇至终浓度接近 0.1%，并在 34 °C 下再孵育 5 分钟。
   注意：本协议中使用的温度针对 Saccharomyces eubayanus 进行了优化，这是一种从温带森林中分离的耐低温菌株。
   需要使用 100% 乙醇来诱导细胞应激，从而提高转化方案的效率。
7. 向转化的细胞中加入 600 μL YPD，按照步骤 2.3 离心，弃去上清液。
8. 将细胞沉淀重悬于 600 μL 新鲜 YPD 中，并在 4 °C 下无搅拌地孵育悬液过夜以进行回收。
9. 将转化的细胞接种在补充有 200 μg/mL 潮霉素的 YPD 琼脂上，并在 20 °C-30 °C 下孵育 48-72 小时。
10. 从转化板中选择 10-12 个菌落，并将它们重新划线到含有 200 μg/mL 潮霉素的 YPD 琼脂上，以确保质粒的存在并生成所选菌落的混合片段以供进一步使用。

3. 发光验证

注：为了验证发光报告基因的功能，在旨在诱导荧光素酶报告基因差异表达的条件下测试了转化的菌株。这种逐步验证允许在波动的糖分条件下评估报告基因功能，利用发光分析的稳健性来捕获实时代谢反应。

1. 从转化的酵母菌株贴片中挑选样品，并将其接种到含有 5% w/v 葡萄糖和 200 μM 潮霉素的 YP 培养基（1% w/v 酵母提取物，2% w/v 蛋白胨）中。在 25 °C 下孵育 24 小时，不要摇晃。在新鲜培养基中以 1：10 稀释度刷新培养物，并在相同条件下再孵育 24 小时。
2. 用不含糖的 YP 培养基洗涤细胞，并以 1：10 的稀释度将它们接种到测试培养基中。测试培养基补充有荧光素，终浓度为 3 mM，并含有 200 μM 潮霉素以维持质粒稳定性。
3. 对于混合糖生长测试，使用以下浓度 （% w/v） 的葡萄糖-麦芽糖基质：葡萄糖（0%、0.5%、1%、2%）和麦芽糖（0%、2%、5%、10%、20%、30%）在 YP 培养基中。每种条件都补充有荧光素（3 mM 终浓度）和 200 μM 潮霉素。将 200 μL 培养物分配到 96 孔板的每个孔中（图 2）。
4. 使用光度计读板器每 30 分钟测量发光和 OD₆₂₀ ，持续 72 小时，无衰减和 1 s 积分时间，确保连续的报告基因活性和细胞密度监测。

4. 发酵采样和发光监测

注：将转化的菌株置于受控的微发酵条件下，以评估发酵过程中的发光激活。这使得能够比较不同发酵条件下的发光激活，从而深入了解延长发酵期间的酵母代谢反应。

1. 通过将麦芽提取物溶解在水中来制备麦芽提取物培养基 （12 °Plato），并在 100 °C 下消毒 20 分钟。接种前让培养基冷却至室温。
2. 在 20 °C 下，在 5 mL YPD（1% w/v 酵母提取物、2% w/v 蛋白胨、2% w/v 葡萄糖）中预培养转化酵母菌株，并以 200 rpm 搅拌 24 小时。将预培养物转移至 50 mL 麦芽提取物培养基中。将培养物在 20 °C 下以 200 rpm 搅拌孵育 24 小时。
3. 通过在室温下以 21,380 × g 离心 1 分钟来收获细胞，然后重悬它们以在 12 °Plato 麦芽提取物培养基⁹ 中制备一式三份的 50 mL 微发酵。为了提高发酵性能，在培养基中补充 0.3 mg/L ZnCl₂。
4. 为确保重复之间的细胞密度一致，请使用以下公式计算接种量：
   接种量 = （1.5 × 10⁶） × 体积 （mL） × 柏拉图
5. 接种制备的培养基，并在 20 °C 下孵育培养物，不要摇晃 14 天。通过每天记录 CO₂ 损失来监测发酵进度。每天同时称量容器，以测量累积失重量，作为 CO₂ 产生的指标。
6. 对于发光监测，定期从每个微发酵中取样 200 μL。向样品中加入荧光素以达到 3 mM 的最终浓度，并使用光度计读板器测量发光和 OD₆₂₀ ，无衰减和 1 s 积分时间。在整个发酵期间按规定的时间间隔进行测量（图 3）。

结果

以下结果表明，新构建的发光报告基因可用于监测发酵过程中酵母细胞中葡萄糖到麦芽糖的转变。报告质粒最初使用酵母重组克隆¹³ 组装，以生成游离型报告基因构建体。这个过程需要不同扩增子之间至少 30 个核苷酸的核苷酸序列重叠，如图 1 所示。使用 S. eubayanus 菌株^T7 从基因组 DNA 中扩增包含 <...

讨论

本研究证明了游离型生物发光报告基因在代谢转变下监测 S. eubayanus 转录激活的有效性。通过使用 MAL32 作为转录报告基因¹¹，我们可以实时跟踪关键的代谢转变，为理解菌株特异性适应提供了一个强大的框架。该报告基因因其在麦芽糖代谢中的作用而被选中，在评估酵母的代谢灵活性方面具有明显的优势，例如体内监测、代谢变化的?...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001