In vivo Monitoraggio dell'attività trascrizionale durante la transizione metabolica mediante un reporter bioluminescente nel lievito

Riepilogo

Questo protocollo utilizza un reporter bioluminescente, che consente di misurare l'attività trascrizionale in Saccharomyces eubayanus per monitorare la transizione da glucosio a maltosio, consentendo l'analisi in tempo reale degli adattamenti metabolici e supportando l'ottimizzazione del ceppo per la fermentazione industriale in diverse condizioni.

Abstract

Il consumo sequenziale di zucchero, da una fonte di zucchero preferita a una meno preferita, rappresenta un adattamento metabolico critico nel lievito, che è particolarmente rilevante per la sopravvivenza in ambienti fluttuanti come quelli che si trovano nella fermentazione della birra. Tuttavia, le transizioni zuccherine sono una variabile ambientale difficile da prevedere e rilevare, che influisce sull'esito delle fermentazioni della birra. Questo protocollo descrive un sistema in vivo per monitorare l'attivazione trascrizionale associata al cambiamento metabolico da glucosio a maltosio in Saccharomyces eubayanus che si applica a diversi ceppi di lievito selvatico Saccharomyces .

Il sistema impiega un reporter trascrizionale bioluminescente episomiale per il metabolismo del maltosio, concentrandosi su MAL32, poiché fornisce una buona lettura dei cambiamenti metabolici, come studiato in S. cerevisiae. Per questo, i ceppi di lievito sono stati trasformati con plasmidi contenenti la regione regolatoria MAL32 di S. eubayanus, controllando l'espressione di un gene che codifica per una versione destabilizzata della luciferasi 1 della lucciola^e di un gene di resistenza all'igromicina utilizzato esclusivamente durante la trasformazione per garantire l'acquisizione del plasmide. Dopo la selezione, le cellule di lievito trasformate possono essere coltivate in condizioni non selettive, poiché il plasmide episomiale rimane stabile in condizioni di coltura per un massimo di 7 giorni.

Questo sistema è stato convalidato in un ambiente zuccherino complesso in saggi di microfermentazione, confermando l'efficacia del reporter luciferasi nell'informare le transizioni metaboliche. I campioni sono stati raccolti regolarmente e analizzati con un luminometro, fornendo informazioni continue sulle risposte del lievito. Sebbene ampiamente applicabile, questo protocollo è particolarmente utile per valutare le prestazioni del lievito in condizioni di fermentazione, dove i cambiamenti metabolici rappresentano una sfida significativa. Inoltre, questa metodologia può essere adattata selezionando promotori alternativi per esplorare una gamma più ampia di risposte ai cambiamenti ambientali, consentendo la caratterizzazione e l'ottimizzazione dei ceppi di lievito selvatico per diverse applicazioni industriali.

Introduzione

I microrganismi come i lieviti devono adattarsi costantemente alle condizioni ambientali dinamiche per mantenere la forma fisica e sopravvivere¹. Questi adattamenti spesso coinvolgono complessi circuiti di regolazione genica che integrano più segnali extracellulari per orchestrare risposte metaboliche precise ^2,3. In ambito industriale, l'efficienza di queste transizioni metaboliche è fondamentale, in particolare nei processi di fermentazione in cui le interruzioni possono portare a rese non ottimali o fermentazioni incomplete³. Una sfida metabolica chiave da superare è quando le cellule passano da una fonte di carbonio preferita a una secondaria, come il passaggio dal glucosio al maltosio. Questo processo introduce una fase di ritardo durante la quale i geni necessari per il metabolismo delle fonti secondarie di carbonio vengono derepressi, consentendo la ripresa della crescita ^4,5.

Nella produzione della birra, i lieviti Saccharomyces devono passare in modo efficiente dal metabolismo del glucosio a quello del maltosio. In particolare, S. eubayanus, la specie parentale tollerante al freddo dei lieviti lager, mostra una sostanziale variabilità fenotipica nella sua capacità di adattarsi a tali transizioni⁶. Gli isolati selvatici, come quelli della Patagonia, mostrano spesso fasi di ritardo prolungate e un consumo di maltosio più lento rispetto ai ceppi domestici, che sono stati selezionati per le loro capacità fermentative ottimizzate ^7,8. Mentre i ceppi domestici si sono adattati a fermentare in modo efficiente gli ambienti di zucchero misto, i ceppi selvatici mostrano spesso una transizione metabolica più lenta, potenzialmente a causa di una maggiore repressione del glucosio e della regolazione variabile del locus^{MAL 6,9}.

Questo studio utilizza la variabilità naturale di S. eubayanus come modello per studiare gli adattamenti metabolici in condizioni di glucosio-maltosio, sfruttando un reporter di luciferasi destabilizzata episomiale per monitorare l'espressione genica in vivo, tracciando la luminescenza¹. Il reporter selezionato MAL32 codifica per una proteina maltasi, un enzima cardine per il catabolismo del maltosio durante le transizioni da glucosio a maltosio^10,11. Sorprendentemente, il promotore MAL32 rappresenta un marcatore di successo per valutare l'induzione del metabolismo del maltosio dopo la deplezione del glucosio¹². Incorporando questo sistema reporter, abbiamo mirato a chiarire i meccanismi adattativi specifici del ceppo e a identificare potenziali obiettivi per ottimizzare le prestazioni di fermentazione. Inoltre, questo protocollo può essere ampliato oltre la produzione di birra, offrendo applicazioni nelle biotecnologie e negli studi ambientali in cui gli ambienti zuccherini complessi svolgono un ruolo significativo. La comprensione dei determinanti genetici e regolatori delle risposte fluttuanti dell'ambiente in S. eubayanus migliora la nostra conoscenza della fisiologia del lievito, supportando lo sviluppo di ceppi robusti per diverse applicazioni industriali e di ricerca.

Protocollo

1. Costruzione di reporter episomiali

NOTA: Abbiamo selezionato una regione regolatoria reporter basata sulla letteratura sui lieviti per costruire il plasmide episomiale per il monitoraggio del consumo di maltosio ^6,11,12. Il promotore del gene reporter candidato è stato definito come la sequenza regolatoria immediatamente a monte dell'ORF candidato fino al nucleotide che fiancheggia l'ORF adiacente a monte. Questa regione è stata amplificata dal DNA genomico di S. eubayanus CBS12357 ceppo^{di riferimento T 10}. Questo approccio garantisce la costruzione ad alta fedeltà di plasmidi episomiali adatti per applicazioni a valle, compreso lo studio di altre condizioni interessanti nel lievito.

1. Progettare i frammenti di DNA e i primer sovrapposti in modo da includere 30 sequenze di accoppiamento nucleotidico tra i frammenti per un assemblaggio senza soluzione di continuità tramite clonazione ricombinante del lievito¹³ (Figura 1). Vedere la Tabella supplementare S1 per le sequenze di primer.
2. Per evitare mutazioni, amplificare la regione del promotore (vedi sopra), così come la luciferasi destabilizzata (LUC-PEST) e le cassette hphMX ¹ utilizzando una DNA polimerasi ad alta fedeltà (fare riferimento al produttore della polimerasi per i dettagli del protocollo). Impostare il termociclatore a 98 °C per 10 minuti per la denaturazione iniziale, seguita da 30 cicli di denaturazione a 98 °C, ricottura a 60 °C ed estensione a 72 °C; completare il protocollo con un'estensione finale a 72 °C per 10 min.
   NOTA: Quando si utilizzano plasmidi navetta di lievito come modelli per la PCR, si raccomanda di sottoporre le reazioni degli ampliconi a una digestione di DpnI (vedere il protocollo del produttore dell'enzima) per eliminare eventuali tracce di plasmide stampo che potrebbero interferire con la trasformazione del lievito.
3. Digerire la spina dorsale del plasmide¹⁴ pRS426 con gli enzimi di restrizione EcoRI e XhoI per linearizzare il vettore, tagliandolo nel sito di clonazione multipla, e prepararlo per la ricombinazione (fare riferimento al protocollo del produttore dell'enzima).
4. Mescolare la spina dorsale linearizzata di pRS426 con i frammenti di DNA amplificati e trasformare la miscela in Saccharomyces cerevisiae BY4741 utilizzando il clonaggio ricombinante del lievito^13,15 per consentire al meccanismo di ricombinazione omologa del lievito di assemblare il costrutto plasmidico in vivo.
5. Piastra del lievito trasformato su un terreno sintetico completo (SC) privo di uracile (SC-URA) per selezionare i trasformanti auxotrofici contenenti il nuovo vettore costruito pRS426- MAL32-LUC-hphMX plasmide.
6. Estrarre i plasmidi dal lievito utilizzando un mini-kit di preparazione del lievito secondo le istruzioni del produttore e trasformare il plasmide estratto in Escherichia coli DH5α per amplificare il costrutto per ulteriori analisi.
7. Screening delle colonie batteriche tramite PCR per confermare il corretto assemblaggio dei costrutti.
8. Purificare il DNA plasmidico utilizzando un kit standard di purificazione dei plasmidi ed eseguire il sequenziamento Sanger per verificare l'integrità e la sequenza dei plasmidi assemblati.

2. Trasformazione dei ceppi di lievito

NOTA: Il protocollo di trasformazione del lievito è stato adattato da un metodo precedentemente stabilito per S. eubayanus¹⁶ e applicato con successo ad altre specie di Saccharomyces e ceppi di lievito fermentativi. Questo protocollo è stato derivato dal tradizionale metodo di trasformazione del lievito del Gietz Lab¹⁵. Questo approccio consente un'efficiente integrazione e selezione dei plasmidi in diverse condizioni sperimentali, offrendo un metodo robusto e flessibile per trasformare diversi ceppi di lievito. Garantisce una selezione e un mantenimento affidabili del plasmide episomiale sotto pressione di igromicina.

1. Precoltura di una singola colonia di lievito appena coltivato in 5 mL di YPD (1% p/v estratto di lievito, 2% p/v peptone, 2% p/v glucosio) a 20 °C a 200 giri/min di agitazione durante la notte.
2. Diluire la coltura a un OD₆₂₀ di 0,2 in terreno YPD fresco e incubare a 20 °C con agitazione a 200 giri/min fino alla fase di metà log (OD₆₂₀ 0,4-0,6). A seconda del ceppo di lievito, questo richiede in genere 3-4 ore.
3. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 21.380 × g per 1 minuto a temperatura ambiente, scartare il surnatante e lavare il pellet 3 volte con acqua sterile.
4. Risospendere le celle lavate in 100 μl di acetato di litio 0,1 M, centrifugare come descritto al punto 2.3 e ripetere il processo 2 volte.
5. Aggiungere i seguenti componenti alle cellule in questo ordine: 240 μL di PEG-4000 al 50% p/v, 35 μL di 1 M LiAc, 5 μL di DNA plasmidico (100 ng/μL), 20 μL di DNA vettore a filamento singolo (ssDNA) precedentemente riscaldato a 98 °C per 10 minuti. Mescolare delicatamente per omogeneizzare la miscela di trasformazione.
6. Incubare la miscela a 20 °C per 30 minuti, seguita da shock termico a 34 °C per 55 minuti. Dopo lo shock termico, aggiungere 38 μL di etanolo al 100% a una concentrazione finale di quasi lo 0,1% e incubare per altri 5 minuti a 34 °C.
   NOTA: Le temperature utilizzate in questo protocollo sono ottimizzate per Saccharomyces eubayanus, un ceppo criotollerante isolato dalle foreste temperate.
   L'uso di etanolo al 100% è necessario per indurre lo stress cellulare, migliorando l'efficienza del protocollo di trasformazione.
7. Aggiungere 600 μl di YPD alle cellule trasformate, centrifugare come al punto 2.3 e scartare il surnatante.
8. Risospendere il pellet cellulare in 600 μL di YPD fresco e incubare la sospensione senza agitazione per una notte a 4 °C per consentire il recupero.
9. Piastra le cellule trasformate su agar YPD integrato con 200 μg/mL di igromicina e incubazione a 20 °C-30 °C per 48-72 ore.
10. Selezionare 10-12 colonie dalle piastre di trasformazione e riavvitarle su agar YPD contenente 200 μg/mL di igromicina per garantire la presenza del plasmide e generare un patch misto delle colonie selezionate per un ulteriore utilizzo.

3. Validazione della luminescenza

NOTA: Per convalidare la funzionalità dei reporter luminescenti, i ceppi trasformati sono stati testati in condizioni progettate per indurre l'espressione differenziale del reporter della luciferasi. Questa convalida graduale consente di valutare la funzionalità del reporter in condizioni di zucchero fluttuante, sfruttando la robustezza dei saggi luminescenti per acquisire risposte metaboliche in tempo reale.

1. Prelevare un campione da un cerotto di ceppo di lievito trasformato e inocularlo in un terreno YP (1% p/v di estratto di lievito, 2% p/v di peptone) contenente il 5% p/v di glucosio e 200 μM di igromicina. Incubare a 25 °C senza agitare per 24 ore. Rinfrescare le colture in terreno fresco a una diluizione 1:10 e incubare nelle stesse condizioni per altre 24 ore.
2. Lavare le cellule con terreno YP senza zucchero e inocularele nel terreno di prova a una diluizione di 1:10. Il terreno di prova è integrato con luciferina fino a una concentrazione finale di 3 mM e contiene 200 μM di igromicina per mantenere la stabilità del plasmide.
3. Per i test di crescita con zuccheri misti, utilizzare una matrice glucosio-maltosio con le seguenti concentrazioni (% p/v): glucosio (0%, 0,5%, 1%, 2%) e maltosio (0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) in terreno YP. Ogni condizione è integrata con luciferina (concentrazione finale di 3 mM) e 200 μM di igromicina. Erogare 200 μL di coltura in ciascun pozzetto di una piastra a 96 pozzetti (Figura 2).
4. Misura la luminescenza e l'OD₆₂₀ ogni 30 minuti per 72 ore utilizzando un lettore di piastre luminometro, senza attenuazione e 1 s di tempo di integrazione, garantendo l'attività continua del reporter e il monitoraggio della densità cellulare.

4. Campionamento delle fermentazioni e monitoraggio della luminescenza

NOTA: I ceppi trasformati sono stati sottoposti a condizioni di micro-fermentazione controllate per valutare l'attivazione della luminescenza durante la fermentazione. Ciò consente di confrontare l'attivazione della luminescenza in diverse condizioni di fermentazione, fornendo informazioni sulle risposte metaboliche del lievito durante periodi di fermentazione prolungati.

1. Preparare il terreno di estrazione di malto (12 °Plato) sciogliendo l'estratto di malto in acqua e sterilizzare a 100 °C per 20 min. Lasciare raffreddare il terreno a temperatura ambiente prima dell'inoculazione.
2. Ceppi di lievito trasformati in precoltura in 5 mL di YPD (1% p/v estratto di lievito, 2% p/v peptone, 2% p/v glucosio) a 20 °C con agitazione a 200 giri/min per 24 ore. Trasferire la precoltura in 50 ml di terreno di estrazione di malto. Incubare la coltura a 20 °C con agitazione a 200 giri/min per 24 ore.
3. Raccogliere le cellule per centrifugazione a 21.380 × g per 1 min a temperatura ambiente e risospenderle per preparare microfermentazioni triplicate da 50 mL in terreno estratto di malto Plato^{12 °Plato 9}. Per migliorare le prestazioni di fermentazione, integrare il terreno con 0,3 mg/L di ZnCl₂.
4. Per garantire densità cellulari coerenti tra le repliche, calcolare il volume dell'inoculo utilizzando la formula:
   Volume dell'inoculo = (1,5 × 10⁶) × Volume (mL) × gradi Plato
5. Inoculare il terreno preparato e incubare le colture a 20 °C senza agitare per 14 giorni. Monitora l'andamento della fermentazione registrando quotidianamente la perdita di CO₂ . Pesare i recipienti contemporaneamente ogni giorno per misurare la perdita di peso cumulativa come indicatore della produzione di CO₂ .
6. Per il monitoraggio della luminescenza, prelevare periodicamente 200 μl da ogni microfermentazione. Aggiungere luciferina ai campioni per ottenere una concentrazione finale di 3 mM e misurare la luminescenza e l'OD₆₂₀ utilizzando un lettore di piastre luminometrico senza attenuazione e 1 s di tempo di integrazione. Eseguire le misurazioni a intervalli definiti durante il periodo di fermentazione (Figura 3).

Risultati

I seguenti risultati dimostrano l'usabilità del reporter luminescente di nuova costruzione per monitorare la transizione da glucosio a maltosio nelle cellule di lievito in un processo fermentativo. I plasmidi reporter vengono inizialmente assemblati utilizzando il clonaggio ricombinante del lievito¹³ per generare costrutti reporter episomiali. Questo processo richiede la sovrapposizione di sequenze nucleotidiche di almeno 30 nucleotidi tra i diversi ampliconi, tu...

Discussione

Questo studio dimostra l'efficacia di un reporter bioluminescente episomiale per il monitoraggio dell'attivazione trascrizionale in S. eubayanus durante le transizioni metaboliche. Utilizzando MAL32 come reporter trascrizionale¹¹, abbiamo potuto tracciare le transizioni metaboliche chiave in tempo reale, fornendo un solido quadro per comprendere gli adattamenti specifici del ceppo. Questo reporter, selezionato per il suo ruolo nel metabolismo del...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001