ב Vivo ניטור פעילות שעתוק במהלך מעבר מטבולי באמצעות מדווח ביולומינסנט בשמרים

Summary

פרוטוקול זה משתמש במדווח ביולומינסנט המאפשר מדידות של פעילות השעתוק ב-Saccharomyces eubayanus כדי לנטר את המעבר מגלוקוז למלטוז, מה שמאפשר ניתוח בזמן אמת של התאמות מטבוליות ותומך באופטימיזציה של זנים לתסיסה תעשייתית בתנאים מגוונים.

Abstract

צריכת סוכר רציפה, ממקור סוכר מועדף למקור פחות מועדף, מייצגת הסתגלות מטבולית קריטית בשמרים, הרלוונטית במיוחד להישרדות בסביבות משתנות כמו אלה שנמצאות בתסיסת בירה. עם זאת, מעברי סוכר הם משתנה סביבתי שמאתגר לחזות ולזהות, המשפיע על התוצאה של תסיסת בירה. פרוטוקול זה מתאר מערכת in vivo לניטור הפעלת שעתוק הקשורה לשינוי המטבולי מגלוקוז למלטוז ב-Saccharomyces eubayanus החלה על זני שמרי בר שונים של Saccharomyces .

המערכת משתמשת במדווח שעתוק ביולוגי אפיזומלי למטבוליזם של מלטוז, תוך התמקדות ב-MAL32, מכיוון שהוא מספק קריאה טובה לשינויים מטבוליים, כפי שנחקר ב-S. cerevisiae. לשם כך, זני שמרים עברו טרנספורמציה עם פלסמידים המכילים את אזור הרגולציה MAL32 מ- S. eubayanus, השולטים בביטוי של גן המקודד לגרסה לא יציבה של גחלילית^{לוציפראז 1}, וגן עמידות להיגרומיצין המשמש אך ורק במהלך הטרנספורמציה כדי להבטיח רכישת פלסמיד. לאחר הברירה, ניתן לתרבית תאי שמרים שעברו טרנספורמציה בתנאים לא סלקטיביים, שכן הפלסמיד האפיזומלי נשאר יציב בתנאי תרבית עד 7 ימים.

מערכת זו אומתה בסביבת סוכר מורכבת במבחני מיקרו-תסיסה, המאשרת את יעילותו של מדווח הלוציפראז במידע על מעברים מטבוליים. הדגימות נאספו באופן קבוע ונותחו באמצעות לומינומטר, מה שמספק תובנות מתמשכות לגבי תגובות השמרים. למרות שהוא ישים באופן נרחב, פרוטוקול זה הוא בעל ערך מיוחד להערכת ביצועי שמרים בתנאי תסיסה, שבהם שינויים מטבוליים מהווים אתגר משמעותי. בנוסף, ניתן להתאים מתודולוגיה זו על ידי בחירת מקדמים חלופיים כדי לחקור מגוון רחב יותר של תגובות לשינויים סביבתיים, המאפשרים אפיון כמו גם אופטימיזציה של זני שמרי בר ליישומים תעשייתיים מגוונים.

Introduction

מיקרואורגניזמים כמו שמרים חייבים להסתגל כל הזמן לתנאי סביבה דינמיים כדי לשמור על כושר ולשרוד¹. התאמות אלה כוללות לעתים קרובות מעגלי ויסות גנים מורכבים המשלבים אותות חוץ-תאיים מרובים כדי לתאם תגובות מטבוליות מדויקות ^2,3. במסגרות תעשייתיות, היעילות של מעברים מטבוליים אלה היא קריטית, במיוחד בתהליכי תסיסה שבהם שיבושים יכולים להוביל לתשואות לא אופטימליות או לתסיסה לא שלמה³. אתגר מטבולי מרכזי שיש להתגבר עליו הוא כאשר תאים עוברים ממקור פחמן מועדף למקור פחמן משני, כגון מעבר גלוקוז למלטוז. תהליך זה מציג שלב פיגור שבמהלכו מדוכאים הגנים הדרושים לחילוף החומרים של מקורות הפחמן המשניים, מה שמאפשר חידוש גדילה ^4,5.

בבישול, שמרי Saccharomyces חייבים לעבור ביעילות ממטבוליזם של גלוקוז למלטוז. בפרט, S. eubayanus, מין ההורים העמיד לקור של שמרי לאגר, מציג שונות פנוטיפית משמעותית ביכולתו להסתגל למעברים כאלה⁶. מבודדים פראיים, כמו אלה מפטגוניה, מציגים לעתים קרובות שלבי פיגור ממושכים וצריכת מלטוז איטית יותר בהשוואה לזנים מבויתים, שנבחרו בשל יכולות התסיסה האופטימליות שלהם ^7,8. בעוד שזנים מבויתים הסתגלו לתסיסה יעילה של סביבות סוכר מעורבב, זני בר מציגים לעתים קרובות מעבר מטבולי איטי יותר, אולי בגלל דיכוי גלוקוז חזק יותר וויסות משתנה של לוקוס MAL ^6,9.

מחקר זה משתמש בשונות הטבעית של S. eubayanus כמודל לחקירת התאמות מטבוליות בתנאי גלוקוז למלטוז, תוך מינוף מדווח לוציפראז לא יציב אפיזומלי כדי לנטר את ביטוי הגנים in vivo, על ידי מעקב אחר זוהר¹. המדווח הנבחר MAL32 מקודד חלבון מלטאז, אנזים מרכזי לקטבוליזם מלטוז במהלך מעברים מגלוקוז למלטוז^10,11. למרבה הפלא, מקדם MAL32 מייצג סמן מוצלח להערכת אינדוקציה של חילוף החומרים של מלטוז לאחר דלדול גלוקוז¹². על ידי שילוב מערכת דיווח זו, מטרתנו הייתה להבהיר מנגנוני הסתגלות ספציפיים לזן ולזהות יעדים פוטנציאליים לאופטימיזציה של ביצועי התסיסה. יתר על כן, ניתן להרחיב פרוטוקול זה מעבר לבישול, ולהציע יישומים בביוטכנולוגיה ובמחקרים סביבתיים שבהם סביבות סוכר מורכבות ממלאות תפקיד משמעותי. הבנת הגורמים הגנטיים והרגולטוריים של תגובות סביבתיות תנודתיות ב- S. eubayanus משפרת את הידע שלנו בפיזיולוגיה של שמרים, ותומכת בפיתוח זנים חזקים ליישומים תעשייתיים ומחקריים מגוונים.

Protocol

1. בניית מדווחים אפיזומליים

הערה: בחרנו אזור רגולטורי מדווח על סמך ספרות שמרים לבניית הפלסמיד האפיזומלי לניטור צריכת מלטוז ^6,11,12. המקדם של גן המדווח המועמד הוגדר כרצף הרגולטורי מיד במעלה הזרם מה-ORF המועמד עד לנוקלאוטיד המאגף את ה-ORF הסמוך במעלה הזרם. אזור זה הוגבר מה-DNA הגנומי של S. eubayanus CBS12357 זן ייחוס^{T 10}. גישה זו מבטיחה בנייה בנאמנות גבוהה של פלסמידים אפיזומליים המתאימים ליישומים במורד הזרם, כולל חקר תנאים מעניינים אחרים בשמרים.

1. תכנן את שברי ה-DNA והפריימרים החופפים כך שיכללו 30 רצפי זיווג נוקלאוטידים בין שברים להרכבה חלקה באמצעות שיבוט רקומבינציה של שמרים¹³ (איור 1). ראה טבלה משלימה S1 לרצפי פריימר.
2. כדי להימנע ממוטציות, הגבירו את אזור המקדם (ראה לעיל), כמו גם את קלטות הלוציפראז הלא יציבות (LUC-PEST) ו-hphMX ¹ באמצעות DNA פולימראז בנאמנות גבוהה (עיין ביצרן הפולימראז לפרטי פרוטוקול). הגדר את התרמו-סייקלר ל-98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות לדנטורציה ראשונית, ואחריה 30 מחזורים של דנטורציה של 98 מעלות צלזיוס, חישול של 60 מעלות צלזיוס והארכה של 72 מעלות צלזיוס; השלם את הפרוטוקול עם הארכה סופית ב-72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: בעת שימוש בפלסמידים של מעבורת שמרים כתבניות ל-PCR, מומלץ להכפיף תגובות אמפליקון לעיכול DpnI (ראה פרוטוקול יצרן האנזים) כדי לחסל כל עקבות של פלסמיד תבנית שעלולים להפריע לטרנספורמציה של השמרים.
3. עכל את עמוד השדרה של פלסמיד pRS426¹⁴ עם אנזימי הגבלה EcoRI ו-XhoI כדי להפוך את הווקטור ליניארי, לחתוך אותו באתר השיבוט המרובה ולהכין אותו לרקומבינציה (עיין בפרוטוקול של יצרן האנזים).
4. מערבבים את עמוד השדרה הליניארי pRS426 עם שברי ה-DNA המוגברים והופכים את התערובת ל-Saccharomyces cerevisiae BY4741 באמצעות שיבוט רקומבינציה של שמרים^13,15 כדי לאפשר למכונות הרקומבינציה ההומולוגיות של השמרים להרכיב את מבנה הפלסמיד in vivo.
5. צלח את השמרים שעברו טרנספורמציה על מדיום שלם סינתטי (SC) חסר אוראציל (SC-URA) כדי לבחור טרנספורמציות אוקסוטרופיות המכילות את הפלסמיד הווקטורי הבנוי החדש pRS426- MAL32-LUC-hphMX.
6. חלץ פלסמידים משמרים באמצעות ערכת מיני הכנה לשמרים על פי הוראות היצרן והפוך את הפלסמיד המופק ל-Escherichia coli DH5α כדי להגביר את המבנה לניתוחים נוספים.
7. סנן מושבות חיידקים באמצעות PCR כדי לאשר את ההרכבה הנכונה של המבנים.
8. טהר את ה-DNA של הפלסמיד באמצעות ערכת טיהור פלסמיד סטנדרטית ובצע ריצוף סנגר כדי לאמת את תקינותם ורצף הפלסמידים המורכבים.

2. טרנספורמציה של זני שמרים

הערה: פרוטוקול טרנספורמציה של שמרים הותאם משיטה שנקבעה בעבר עבור S. eubayanus¹⁶ ויושם בהצלחה על מינים אחרים של Saccharomyces וזני שמרים מותססים. פרוטוקול זה נגזר משיטת טרנספורמציה מסורתית של שמרים ממעבדת גיץ¹⁵. גישה זו מאפשרת אינטגרציה ובחירה יעילה של פלסמידים בתנאי ניסוי מגוונים, ומציעה שיטה חזקה וגמישה להפיכת זני שמרים שונים. זה מבטיח בחירה ותחזוקה אמינה של הפלסמיד האפיזומלי בלחץ היגרומיצין.

1. תרבית מוקדמת של מושבה אחת של שמרים טריים שגדלו ב-5 מ"ל של YPD (1% משקל/נפח תמצית שמרים, 2% משקל/נפח פפטון, 2% משקל/נפח גלוקוז) ב-20 מעלות צלזיוס ב-200 סל"ד של ערבול למשך הלילה.
2. לדלל את התרבית ל-OD₆₂₀ של 0.2 במדיום YPD טרי ולדגור ב-20 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב-200 סל"ד עד לשלב אמצע העץ (OD₆₂₀ 0.4-0.6). בהתאם לזן השמרים, זה בדרך כלל דורש 3-4 שעות.
3. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בחום של 21,380 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר, השליכו את הסופרנטנט ושטפו את הגלולה פי 3 במים סטריליים.
4. השעו מחדש את התאים השטופים ב-100 מיקרוליטר של 0.1 M ליתיום אצטט, צנטריפוגה כמתואר בשלב 2.3, וחזור על התהליך פי 2.
5. הוסף את הרכיבים הבאים לתאים בסדר זה: 240 מיקרוליטר של 50% w/v PEG-4000, 35 מיקרוליטר של 1 M LiAc, 5 מיקרוליטר של DNA פלסמיד (100 ננוגרם/מיקרוליטר), 20 מיקרוליטר של DNA נשא חד-גדילי (ssDNA) שחומם בעבר ב-98 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות. מערבבים בעדינות כדי להומוגניזציה של תערובת הטרנספורמציה.
6. דגרו את התערובת ב-20 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות, ולאחר מכן הלם חום ב-34 מעלות צלזיוס למשך 55 דקות. לאחר הלם חום, הוסף 38 מיקרוליטר של 100% אתנול לריכוז סופי של כמעט 0.1% ודגירה למשך 5 דקות נוספות ב-34 מעלות צלזיוס.
   הערה: הטמפרטורות המשמשות בפרוטוקול זה מותאמות ל-Saccharomyces eubayanus, זן קריוטולנטי המבודד מיערות ממוזגים.
   השימוש ב-100% אתנול נדרש כדי לגרום ללחץ תאי, ולשפר את יעילות פרוטוקול הטרנספורמציה.
7. הוסף 600 מיקרוליטר של YPD לתאים שעברו טרנספורמציה, צנטריפוגה כמו בשלב 2.3, והשליך את הסופרנטנט.
8. השעו מחדש את גלולת התא ב-600 מיקרוליטר של YPD טרי ודגרו על התרחיף ללא תסיסה למשך הלילה ב-4 מעלות צלזיוס כדי לאפשר התאוששות.
9. צלחת התאים המותמרים על אגר YPD בתוספת 200 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין ודגירה בטמפרטורה של 20-30 מעלות צלזיוס למשך 48-72 שעות.
10. בחר 10-12 מושבות מלוחות הטרנספורמציה ופס אותן מחדש על אגר YPD המכיל 200 מיקרוגרם/מ"ל היגרומיצין כדי להבטיח את נוכחות הפלסמיד וליצור טלאי מעורב של המושבות שנבחרו לשימוש נוסף.

3. אימות לומינסנציה

הערה: כדי לאמת את הפונקציונליות של המדווחים הזוהרים, זנים שעברו טרנספורמציה נבדקו בתנאים שנועדו לגרום לביטוי דיפרנציאלי של מדווח הלוציפראז. אימות מדורג זה מאפשר להעריך את פונקציונליות המדווח בתנאי סוכר משתנים, תוך מינוף החוסן של מבחנים זוהרים כדי ללכוד תגובות מטבוליות בזמן אמת.

1. בחר דגימה ממדבקת זן שמרים שעבר טרנספורמציה וחסן אותה למדיום YP (1% w/v תמצית שמרים, 2% w/v פפטון) המכיל 5% w/v גלוקוז ו-200 מיקרומטר היגרומיצין. יש לדגור בטמפרטורה של 25 מעלות צלזיוס מבלי לנער במשך 24 שעות. רעננו את התרביות במדיום טרי בדילול של 1:10 ודגרו באותם תנאים למשך 24 שעות נוספות.
2. שטפו את התאים במדיום YP ללא סוכר וחסנו אותם למדיית הבדיקה בדילול של 1:10. אמצעי הבדיקה מתווסף עם לוציפרין לריכוז סופי של 3 מ"מ ומכיל 200 מיקרומטר היגרומיצין לשמירה על יציבות הפלסמיד.
3. לבדיקת צמיחת סוכר מעורב, השתמש במטריצת גלוקוז-מלטוז עם הריכוזים הבאים (% w/v): גלוקוז (0%, 0.5%, 1%, 2%) ומלטוז (0%, 2%, 5%, 10%, 20%, 30%) במדיום YP. כל מצב מתווסף לוציפרין (ריכוז סופי של 3 מ"מ) ו-200 מיקרומטר היגרומיצין. להוציא 200 מיקרוליטר של תרבית לכל באר של צלחת של 96 בארות (איור 2).
4. מדוד זוהר ו-OD₆₂₀ כל 30 דקות למשך 72 שעות באמצעות קורא לוחות לומינומטר, ללא הנחתה ו-1 שניות של זמן אינטגרציה, תוך הבטחת פעילות מדווח רציפה וניטור צפיפות תאים.

4. דגימת תסיסה וניטור זוהר

הערה: זנים שעברו טרנספורמציה היו נתונים לתנאי מיקרו-תסיסה מבוקרים כדי להעריך את הפעלת הזוהר במהלך התסיסה. זה מאפשר השוואה של הפעלת זוהר על פני תנאי תסיסה שונים, ומספק תובנות לגבי תגובות מטבוליות של שמרים במהלך תקופות תסיסה ממושכות.

1. מכינים מדיום תמצית מאלט (12 מעלות אפלטון) על ידי המסת תמצית לתת במים ומעקרים ב-100 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות. הניחו למדיום להתקרר לטמפרטורת החדר לפני החיסון.
2. טרום-תרבית טרנספורמציה של זני שמרים ב-5 מ"ל של YPD (1% w/v תמצית שמרים, 2% w/v פפטון, 2% w/v גלוקוז) ב-20 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב-200 סל"ד למשך 24 שעות. העבירו את התרבות המוקדמת ל -50 מ"ל של מדיום תמצית לתת. דגרו את התרבית בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס עם תסיסה ב -200 סל"ד למשך 24 שעות.
3. קצרו את התאים על ידי צנטריפוגה בטמפרטורה של 21,380 × גרם למשך דקה אחת בטמפרטורת החדר והשעו אותם מחדש להכנת תסיסה מיקרו משולשת של 50 מ"ל במדיום תמצית מאלט אפלטון^{12 מעלות 9}. כדי לשפר את ביצועי התסיסה, השלם את המדיום עם 0.3 מ"ג/ליטר ZnCl₂.
4. כדי להבטיח צפיפות תאים עקבית על פני שכפולים, חשב את נפח החיסון באמצעות הנוסחה:
   נפח חיסון = (1.5 × 10⁶) נפח × (מ"ל) × מעלות אפלטון
5. לחסן את המדיום המוכן ולדגור את התרבויות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס מבלי לנער למשך 14 יום. עקוב אחר התקדמות התסיסה על ידי רישום אובדן_CO2 מדי יום. שקלו את הכלים בו זמנית בכל יום כדי למדוד ירידה מצטברת במשקל כאינדיקטור לייצור_CO2 .
6. לניטור זוהר, דגימה מעת לעת של 200 מיקרוליטר מכל מיקרו-תסיסה. הוסף לוציפרין לדגימות כדי להשיג ריכוז סופי של 3 מ"מ ולמדוד זוהר ו-OD₆₂₀ באמצעות קורא לוחות לומינומטר ללא הנחתה ו-1 שניות של זמן אינטגרציה. בצע מדידות במרווחי זמן מוגדרים לאורך תקופת התסיסה (איור 3).

תוצאות

התוצאות הבאות מדגימות את השימושיות של המדווח הזוהר החדש שנבנה לניטור המעבר מגלוקוז למלטוז בתאי שמרים בתהליך תסיסה. הפלסמידים המדווחים מורכבים בתחילה באמצעות שיבוט רקומבינציה של שמרים¹³ כדי ליצור מבני מדווח אפיזומליים. תהליך זה דורש חפיפה של רצף נוקלאוטידי...

Discussion

מחקר זה מדגים את היעילות של מדווח ביולומינסנט אפיזומלי לניטור הפעלת שעתוק ב- S. eubayanus תחת מעברים מטבוליים. על ידי שימוש ב-MAL32 כמדווח שעתוק¹¹, יכולנו לעקוב אחר מעברים מטבוליים מרכזיים בזמן אמת, ולספק מסגרת חזקה להבנת התאמות ספציפיות לזנים. מדווח זה, שנב...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ampicillin, sodium salt	ThermoFisher Scientific	11593027
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
DpnI	New England Biolabs	R0176S
EcoRI	New England Biolabs	R0101S
Hygromycine B	Gold Biotechnology	H-270-1
L-Luciferine	Gold Biotechnology	L-127-10
Maltose monohydrate	Sigma-Aldrich	47288
Phusion Plus PCR Master Mix	ThermoFisher Scientific	F631S
Tecan Infinite 200 PRO M	Tecan
Wizard Plus SV Minipreps DNA Purirfication System	Promega	A1330
XhoI	New England Biolabs	R0146S
Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep I	Zymo Research	D2001