Wellcome Trust sağlanan mali destek (VIP JSY ve KLB için 074.128 Araştırma Bursu Ödülü). Tıbbi Araştırma Konseyi Bursu RJA için Leica_SP2_Stacker, TIFF &#39;yeniden yapılanma&#39; için bir dizi içine almak için kullanılan bir algoritma, Leica_tiff_sequence onun izni ile Tony Collins tarafından geliştirilen ve kullanılan ImageJ Leica SP2, TIFF, okumak için bir eklenti dayanmaktadır. ( <a href="http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html">http://www.uhnres.utoronto.ca/facilities/wcif/software/Plugins/LeicaTIFF.html</a> ) StackReg ve TurboReg, doku hareketi düzeltmek için kullanılan algoritmalar, Pe venaz ve arkadaşları (1998) 9 dayanmaktadır. Excel_writer.jar Kurt De Vos (http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html) tarafından yazılmıştır. JNCT0.08JoVE.ijm, parçacık algılama algoritması, KL Beyin tarafından yazılmış ve daha önce 5 detaylı bir algoritma dayanmaktadır.

Bölüm 1: Hazırlık Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) <ol><li> Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 AM toz (50 mg) gibi küçük bir miktar 500 ul flakonlarda geliyor. Toz F-127 çözümü, 30 saniye hafifçe sallayarak 40 ul Pluronic ekleyin, daha sonra 460 ul PSS ve 30 saniye hafifçe çalkalanır Nihai çözüm, 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00, 4 x 125 ul alikotları sağlar. -20 C&#39;de saklamak için ışık ve maruz kalmaktan kaçınınız. </li></ol> Bölüm 2: Ca 2 + yükleme <ol><li> Dondurucuda (-20 C) Ca 2 + göstergesi (Oregon Yeşil 488 BAPTA 01:00) çıkarın ve oda sıcaklığında çözünme sağlar. </li><li> 1 ml bir tüp ve su banyosu yer PSS alın. % 95 O% 2 / 5 saniyede yaklaşık 1 görünen kabarcık bir oranda CO 2 ile Kabarcık. Bubbler kapamak veya Parafilm ile örneğin tüp içine güvenli olması gerekir. </li><li> Hayvan doku inceleyin ve Sylgard çizgili bir Petri kabındaki, bağ dokusu dikkatli bir şekilde kaldırın. Düz kas organ türü ne olursa olsun, PSS her 10 dakikada yerini olmalı ve doku (PSS üç kez yerine örneğin) ve aşağıdaki diseksiyonu yıkanmalıdır. Vas deferens: doku bir levha üretmek uzunluğu yönlü kesme organ düşünün. Mesane için: kubbenin üst (ön) (arka) mesane boynu boyuna açık. 8 uzun mm ve 1 - baskın kas demetlerinin yönünü kesme detrüsör dorsal yüzeyi boyunca 2 mm genişliğinde, dört şeritler, 6 hazırlayın. </li><li> Place &#39;önceden ısıtılmış ve kabarmış&#39; PSS doku disseke. </li><li> 10 mcM Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 tüp PM 125 ul ekleyin ve biraz sallamak vermek, elle karıştırmak için. </li><li> Folyo kaplı köpürme ve izin, devam edin. Yeterli doku Ca 2 + göstergesi doku ve düz kas tabakasının kalınlığı boyutu ile değişir almak için zaman alır. Örneğin: 120 dakika (sıçan detrüsör, fare vas deferens) 70 dakika (detrüsör fare, sıçan anococcygeus). </li></ol> Bölüm 3: mikroskopi için &#39;Ca 2 + yüklü&#39; doku hazırlanması Dikkatli doku bağlantılarını doku spontan hareket (nispeten sağlam doku düz kas hücrelerinin görüntüleme bir özelliği) en aza indirmek ve görüntüleme için uygun bir sitenin konumu (düz bir doku parçası gibi olabilir kolaylaştırmak amacıyla gerekli iki boyut yerine üç) inceledi. <ol><li> En az 5 dakika süreyle doku kabarmış PSS durulayın. </li><li> Uzanan düz bir levha şeklinde doku (biraz), çizgili Sylgard hazırlık çanak monte edin. Amacı çizebilir uzun &#39;pimleri&#39; kullanmaktan kaçının; &#39;pimleri&#39; olarak 25-50 mikron çaplı gümüş tel yerine kısa uzunluklarda ve bir açıyla yerleştirin. </li><li> (Bu superfusion başlar PSS kaplı geniş bir alana yol) PSS Sylgard astarlı çanak alanından kaçmak değildir ki emin olmak için dikkatli olmak, mikroskop sahne hazırlık tabağına yerleştirin. </li><li> PSS ile hazırlık superfuse amacıyla pompa açın. Saatte 100 ml &#39;lik bir oranı genellikle istihdam edilmektedir. </li><li> Isıtıcı ünitesi açın. </li><li> Hazırlık çanak (tabanı üzerinde mıknatıs metal şerit her iliştirilmesi) giriş ve çıkış tüpleri ve sıcaklık probu yerleştirin. Çıkış tüpünün ucu yüksekliği, derinliği PSS belirleyecektir. Çıkış aslında (bazen başlangıçta olduğu gibi) PSS kaldırıyor sağlamak için dikkatli olun. </li><li> Istenilen sıcaklığa, örneğin 33-35 C ulaşmak için ısıtıcı ünitesi sıcaklığı ayarlayın </li><li> En az 10 dakika süreyle doku gelmesini sağlayınız. </li></ol> Bölüm 4: site Seçim görüntü Uyarma aydınlatma maruz kalma göstergesi photobleach, böylece bir seferde birkaç saniye daha fazla kullanmaktan kaçının. <ol><li> Düşük güç bir hedef (10x ya da 20x) düz kas görüntülemek ve izlemek için uygun bir bölge belirlemek için, mavi bir ışık ile Epifloresans, heyecan verici kullanın. Hareketi (en az olmalı) ve düz kas hücrelerinin sayısı alanında dayalı bir site almak için deneyin. Parlak &#39;yapılar&#39;, görüntü algılama algoritması &#39;yanlış pozitif&#39;, yüksek bir sayı neden olabilir, bu nedenle çok sayıda (örneğin) serpiştirilmiş epitel hücreleri ve fibroblastlar siteleri kaçının. </li><li> Yüksek bir güç objektif (40x) geçin. </li><li> Düz kas hücre (ler) yatay yalanlar o kadar (yani hızlı tarama eksenine paralel) veya optik eksen sahne döndürün. </li></ol> Bölüm 5: mikroskopisi Ayrıntıları konfokal mikroskop &#39;kurmak&#39; nasıl her mikroskop türü için özeldir, amaen önemli hususlar şunlardır: hızı (en Ca 2 + transientler için gerekli minimum 5 Hz); alan çözünürlüğü ve boyutu (her ikisi de ticareti-hız). Bazı aşağıdaki protokol Leica SP2 dik konfokal mikroskop özel. Tipik bir protokol: 5 Hz (256 x 256 piksel, yaklaşık 100 x 100 mm.) Elde edilen 100 çerçeve serisi, 13.5 Hz (256 x 64 piksel, yaklaşık 100 x 25 mm). Tarama kafası iki yönlü hareket (toplama hızı en üst düzeye çıkarmak için) ve 1000 Hz&#39;de satır başına elde etmek için ayarlayın. <ol><li> Bir &#39;havadar diske&#39; iğne deliği kapatın. </li><li> Bu değeri, parlaklık ve photobleaching arasında bir trade-off; AOTF 25 ve% 35 arasında Lazer (488 nm) güç ayarlayın. (Ikincisi uzun kayıtları sırasında belirli bir sorun.) </li><li> &#39;Tedavi&#39; başına altı siteleri - site başına altı serisi, ve dört edinin. Önemli photobleaching deneyci bu sapmasına neden olsa da, aynı altı siteleri ön-ilaç (örneğin, &#39;kontrol&#39;) ve post-ilaç izlemek amacı yaygındır. </li><li> &#39;Zamanı denetimleri yapılmaktadır Ca 2 + görüntüleme gereklidir. </li></ol> Bölüm 6: analiz için hazırlanması <ol><li> Http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html: Resim J indirin ve kurun. Platforma özgü versiyonunu indirin ve sonra, http://rsb.info.nih.gov/ij/upgrade/ij.jar son imageJ.jar dosya indirirken, eski dosya yerine en son sürümüne güncelleme. Apple Mac kullanıcıları: yavaş çalışıyorsa, Apple (http://www.apple.com/macosx/features/java/) java sanal makinesi (JVM) en son sürümünü kullandığınızdan emin olun. </li><li> Excel_writer.jar indirin: http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/excel-writer.html ve Eklentiler [dizin]&gt; kavanoza dizin içine yüklemek. </li><li> JNCT0.08Release.ijm Leica_SP2_Stacker.class: Aşağıdaki dosyaları Eklentiler dizine kopyalayın. Eklentiler kullanarak bu scriptleri her yükleyin [Menü]&gt; Makrolar&gt; Yükle ... ImageJ fonksiyonu. </li><li> Biz yazılım görüntülenebilir içinde tek bir &#39;film&#39; gibi her serisi üretir Leica SP2 konfokal mikroskop, yazılım (Leica LCS) kullanabilirsiniz, ancak tek tek kare olarak kaydeder. Diziye çerçeveleri yeniden kurmak için: (i) &#39;kare&#39; tek bir klasörü (örneğin, &#39;DataFolder&gt; TIFF&#39;) olarak yeniden inşa için emin olun. (Ii) Eklentileri [Menü]&gt; Makrolar&gt; Leica_SP2_Stacker seçin. Kök dizini seçin (örneğin, &#39;DataFolder&#39;). Açılan listesinde (örneğin, &#39;TIFF /&#39;) istediğiniz klasörü seçiniz. Bir çıkış dizini seçin veya yeni bir (örneğin, &#39;DataFolder&gt; Yığınları&#39;) oluşturur. Komut dosyası daha sonra tek tek kareleri serisi yeniden. </li></ol> Bölüm 7: hareket için düzeltme Iyi çivileme ile görüntülü sitenin hareketini en aza indirilmeli ve eşit gergin doku olabilir rağmen, bazı düz kas organları yalnız bağlantılarını dikkatli kaldırıldı olamaz spontan kasılmaları sergilerler. Burada bir dizi içinde kare hizalar ya da eşleşen bir serbestçe kullanılabilir algoritma kullanımı açıklanmaktadır. <ol><li> &#39;StackReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) ve &#39;TurboReg&#39; (http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/turboreg/). </li><li> Eklentiler Eklentiler dizine her yükleyin&gt; Makrolar&gt; Kur ... </li><li> (Dosya&gt; Aç ...) işlenmek üzere bir yığın yükleyin ve daha sonra ilgi alanına açıkça gösteren bir çerçeve taşımak. Diğer çerçeveler bu referans çerçevesi aynı hizada olacak. </li><li> Eklentiler&gt; Yığınları&gt; StackReg. Her biri farklı &#39;Dönüşümler&#39; (yani Çeviri, Katı Cisim, Ölçekli Rotasyon, Afin) en etkili olduğunu belirlemek deneyin. (Daha fazla detay: http://bigwww.epfl.ch/thevenaz/stackreg/) </li></ol> Bölüm 8: Parçacık algılama algoritması Her bir &#39;site&#39; görüntülü faktörler Ca 2 + transientler algılama etkileyen değişecektir. Her sitenin belirli özellikleri (&#39;parçacık parametreleri&#39; - detaylı aşağıda) ölçerek, algılama sürecini kolaylaştırdı. Ve &#39;hücre kenar eşiği&#39; Böylece her site için bir hesaplar için eşik çıkarılır &#39;,&#39; oranı için eşik &#39;. <ol><li> Eklentileri [Menü]&gt; Makrolar&gt; Kur ... ve &#39;JNCT0.08Release.ijm&#39; seçeneğini seçin. </li><li> Eklentileri [Menü]&gt; Makrolar&gt; yük yığını (kısayol: l). Bir dizi seçin ve parçacık parametreleri hesaplamak: <ol style="list-style:none;"><li> a. Için eşik çıkarılır (= arka plan) </li></ol></li><li> &#39;Arka plan&#39; olarak inandığımız üzerinde dikdörtgen bir ROI seçin. </li><li> Ölçü (kısayol: m). Aşağı Not ORTALAMA. <ol style="list-style:none;"><li> b. Oranının hesaplanması eşik </li></ol></li><li> Bir dikdörtgen seçinHücre (ler) optik düz bir alanı çevresinde ROI. </li><li> Ölçü (kısayol: m). Aşağı ortalama ve standart sapma unutmayın. </li><li> Bir iki kez daha tekrarlayın VEYA &#39;kayması&#39; tuşuna basarak bir kerede üç kutu çizebilirsiniz. </li><li> Hesaplayın ve eşik oranı için bir yere not = ortalama üç değerleri (1 + SD / ortalama) x 32 / siteler çoğaltır. <ol style="list-style:none"><li> c. Hücre kenar eşiği </li></ol></li><li> Image&gt; Yığınları&gt; Z proje ... Projeksiyon tipi seçin: &#39;Ortalama yoğunluğu&#39; </li><li> Image&gt;&gt; Eşik ayarlayın. </li><li> Siyah ve beyaz seçin. </li><li> &#39;Altında&#39; tanımlayın (üst kaydırıcıyı) limit ve karşılık gelen değeri (kaydırıcıyı sağa) bir yere not edin. Sadece siyah bölgelerde meydana gelen olaylar sayılabilir. </li><li> &#39;Reset&#39; düğmesini tıklayın. </li><li> Yığınları (2 kısayol) analiz </li><li> Bu aşamada sadece bir seri seçin, yani &#39;ilk dosya&#39; ve &#39;son dosya ile aynı olmalıdır. </li><li> &#39;Çıkarılır için eşik&#39; ve &#39;hücre kenar eşiği&#39;, &#39;oranı için eşik değerleri girin. Diğer ayarları varsayılan değerlerine bırakın. </li><li> Algoritma işlenmiş serisi sol tarafta görülen ve sağda orijinal olduğu bir çift bölmeli pencere üretecektir. Yanlış pozitif ve gözle görünür olaylar, tespit edilmemiş olduğu durumlarda sayısını dikkatli bir şekilde değerlendirmek için bu geçmesi. Ca 2 daha doğru bir algılama almak için + transientler biraz &#39;parçacık parametreleri&#39; bazı ayarlamak için gerekli olabilir. Sürecin bir &#39;küçük isabet ve kaçırmak&#39; gibi ilk girişimi olsa da, hangi parametreleri temel olarak bir hızla hissediyorum alır. </li><li> Algoritması her bir serisi için, bir Excel dosyasını üretir, tespit edilen olayın ayrıntıları özellikleri (genlik, alan ve pozisyon gibi). &#39;Yanlış&#39; - Bu Excel dosyası, el kaldırılır olabilir algoritma çıkışları (örneğin adım 8.17) bu görüntü dosyalarını inceleyerek tespit. </li></ol>

<ol>
	<li>Haugland, R. P., Gregory, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Indicators+for+Ca2+,+Mg2+,+Zn2++and+other+metal+ions.">Indicators for Ca2+, Mg2+, Zn2+ and other metal ions.</a> Handbook of fluorescent probes and research products. , 771-826 (2002).</li><li>Boland, B., Himpens, B., Gillis, J. M., Casteels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationship+between+force+and+Ca2++in+anococcygeal+and+vas+deferens+smooth+muscle+cells+of+the+mouse.">Relationship between force and Ca2+ in anococcygeal and vas deferens smooth muscle cells of the mouse.</a> Pflugers Arch. 421, 43-51 (1992).</li><li>Hashitani, H., Fukuta, H., Takano, H., Klemm, M. F., Suzuki, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Origin+and+propagation+of+spontaneous+excitation+in+smooth+muscle+of+the+guinea-pig+urinary+bladder.">Origin and propagation of spontaneous excitation in smooth muscle of the guinea-pig urinary bladder.</a> J Physiol. 150, 273-286 (2001).</li><li>Heppner, T. J., Bonev, A. D., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elementary+purinergic+Ca2++transients+evoked+by+nerve+stimulation+in+rat+urinary+bladder+smooth+muscle.">Elementary purinergic Ca2+ transients evoked by nerve stimulation in rat urinary bladder smooth muscle.</a> J. Physiol. 564, 201-212 (2005).</li><li>Brain, K. L., Jackson, V. M., Trout, S. J., Cunnane, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intermittent+ATP+release+from+nerve+terminals+elicits+focal+smooth+muscle+Ca2++transients+in+mouse+vas+deferens.">Intermittent ATP release from nerve terminals elicits focal smooth muscle Ca2+ transients in mouse vas deferens.</a> J. Physiol. 541, 849-862 (2002).</li><li>Fleichman, M., Schneider, T., Fetscher, C., Michel, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Signal+transduction+underlying+carbachol-induced+contraction+of+rat+urinary+bladder+II.+Protein+kinases.">Signal transduction underlying carbachol-induced contraction of rat urinary bladder II. Protein kinases.</a> J. Pharmacol. Exp. Ther. 308, 54-58 (2004).</li><li>Young, J. S., Meng, E., Cunnane, T. C., Brain, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spontaneous+purinergic+neurotransmission+in+the+mouse+urinary+bladder.">Spontaneous purinergic neurotransmission in the mouse urinary bladder.</a> J. Physiol. 586, 5743-5755 (2008).</li><li>Nelson, M. T., Cheng, H., Rubart, M., Santana, L. F., Bonev, A. D., Knot, H. J., Lederer, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation+of+arterial+smooth+muscle+by+calcium+sparks.">Relaxation of arterial smooth muscle by calcium sparks.</a> Science. 270, 633-637 (1995).</li><li>Th&#233;venaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+pyramid+approach+to+subpixel+registration+based+on+intensity.">A pyramid approach to subpixel registration based on intensity.</a> IEEE Trans. Image Process. 7, 27-41 (1998).</li></ol>

Kullanılan hayvanların sayısı ve onların acıları en aza indirmek için çalışmalar yapıldı; tüm deneyler, Birleşik Krallık Animals (Scientific Procedures) Act 1986 ve Avrupa Toplulukları Konseyi Direktifi 86/09/EEC uyarınca yapılmıştır.

Seçimi floresan Ca 2 + göstergesi Oregon Yeşil 488 BAPTA-1 (i) diğer göstergeleri (örneğin Fluo-4 ve Kalsiyum Yeşil) 1 ile karşılaştırıldığında, parlak, çünkü AM Ca 2 + göstergesi seçildi, (ii) Ca 2 fizyolojik değişimlere duyarlıdır + konsantrasyonu (iii) yükleri çok sayıda düz kas hücreleri, düz kas hücre izlenebilir Kaplin sağlayan, hücre içi Ca 2 + konsantrasyonu [Ca 2 +] i (örneğin, vaz deferens 2) benzer büyüklükte 1 K d Ancak, Oregon Yeşil 488 BAPTA 1:00 olmayan bir ratioable Ca 2 + göstergesi, gibi kolayca mutlak belirlemek için kullanılan olamaz [Ca 2 +]. Ayrıca, Ca 2 + mevcut ise yüksek konsantrasyonlarda tampon ve [Ca 2 +] yüksek genlik değişiklikleri ile doymuş olur. Spontan kontraktilite inhibisyonu Ca 2 + kanalları + L-tipi Ca 2 üzerinden (nifedipin 3 diltiazem 4 örneğin) hareketini engelleyerek düz kas organların kendiliğinden kontraktilite gibi, farmakolojik azaltılmış olabilir. Not bu ilaçların tam hücreli Ca 2 + yanıp söner / transientler genlik büyük ölçüde azaltacaktır . Vaz daralma öncelikle purinerjik ve noradrenerjik sinir iletiminin bir arada deferens. Ancak, bu doku Odak Ca 2 + transientler noradrenerjik reseptör blokajı (örn. α 1 adrenoseptör, prazosin 5) hareketinin odak Ca 2 + transientler etkilemeden azalabilir duyarsız. Alternatif olarak, daralma wortmannin 6 miyozin hafif zincir kinaz örneğin inhibisyonu yoluyla &#39;downstream&#39; önlenmiş olabilir. Sonuçlar Mikronaltı çözünürlük Ca 2 + floresan İzleme nörotransmitter sürüm 5,7 post-junctional etkilerini incelemek ve Ca 2 + iç depolar (örneğin, &#39;kıvılcım&#39; 8) serbest bırakılması için güçlü bir tekniktir. Ca 2 + metodoloji kullanarak transientler burada özetlenen analizi piyasada bulunan görüntü analiz paketler ile karşılaştırıldığında maliyet-etkin ve ImageJ için özel yazılmış Java eklentileri yoluyla ısmarlama analiz sağlar.

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Oregon Green 488 BAPTA-1 AM</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>O6807</td>
<td>10 x 50 &mu;g</td>
</tr>
<tr>
<td>Pluronic F-127 solution</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>20% solution in DMSO</td>
</tr>
<tr>
<td>Leica SP2 upright confocal microscope</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Leica</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Air table (&#x2018;vibration isolated workstation&#x2019;)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Newport</td>
<td>M-VW-3046-OPT-012140</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Sylgard 184 elastomer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Dow Corning</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

focal ca2+ transient detection in smooth muscle

Ca 2 + görüntüleme düz kas membran potansiyeli değişiklikleri, iç mağazalardan Ca 2 + gibi serbest bırakılması gibi neden olmayabilir hücresel mekanizmaları içine fikir verir ve birden fazla hücreyi aynı anda izlenebilir, örneğin, değerlendirmek için izin , kaplin sinsityal doku. Hücre içi Ca 2 + transientler düz kas yaygındır, ama doğru bir şekilde ölçmek için zor bir organ bakış genellikle geniş bir alan üzerinde, kendi stokastik oluşumu kaynaklanan sorunlar nedeniyle bu sözleşme eğilimli. Bu sorunu aşmak için, biz, otomatik bir biçimde, bu tür olayların sıklığı, yeri ve genlik kazanmak ve daha sonra analiz etmek için bir dizi görüntüleme protokolleri ve analiz rutinleri geliştirdik. Bu yaklaşım, başka bağlamlarda uygulanabilir olsa da, kendi yerel purinerjik Ca 2 algılama içerir Mikronaltı çözünürlüğe sahip verici sürümü bulmak için transientler . ATP detrüsör ve vaz deferens düz kas P2X1 reseptörlerine bağlanır otonom sinirler, bir cotransmitter olarak yayınlandı. Ca 2 + purinerjik neuroeffector Ca 2 + transientler (NCTS), düz kas girer. Odak Ca 2 + transientler şekilde elektrofizyoloji üzerinden pek çok avantajı olan bir nörotransmitter serbest optik izleme izin verir. Büyük ölçüde geliştirilmiş uzaysal çözünürlük dışında, optik kayıt anda birçok ayırt sitelerinden verici sürümü kayıt sağlayan ek bir avantaja sahiptir. Ayrıca, optik odak düzlemine korumak ya da hücre içi bir keskin mikroelektrot yeniden daha uzun kayıt serisi sırasında doğru daha kolay. Özetle, bir görüntüleme Ca 2 + floresan yöntemi ana hatlarıyla hangi detaylar doku hazırlanması, veri toplama ve analizi. Biz böyle bir Ca 2 + transientler analiz için çeşitli scriptler kullanımı anahat.

Watch this Scientific Journal Video about Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle at JoVE.com

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları yöntemleri<sup&gt; 2 +</sup&gt; Görüntüleme: izole organları, içinde düz kas doku, görüntü toplama ve veri analizi hazırlanması.

Odak Ca 2 +</supDüz kas> Geçici Algılama

Ca2+ imaging of smooth muscle provides insight into cellular mechanisms that may not result in changes of membrane potential, such as the release of Ca2+ ...

focal-ca2-transient-detection-in-smooth-muscle

Research

JoVE Journal

Biology

Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

11.2K Görüntüleme.  University of Oxford. Yüksek çözünürlüklü Ca Detayları yöntemleri 2 + Görüntüleme: izole organları, içinde düz kas doku, görüntü toplama ve veri analizi hazırlanması.

Video: Focal Ca2+ Transient Detection in Smooth Muscle

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded and their collection does not imply any added risk to the newborn or mother s health. Moreover no ethical concerns are raised. The UC is composed by one vein and two arteries from which both endothelial cells (ECs) 1 and smooth muscle cells (SMCs) 2, two of the main cellular components of blood vessels, can be isolated. In this project the SMCs were obtained after enzymatic treatment of the UC arteries accordingly the experimental procedure previously described by Jaffe et al 3. After cell isolation they were kept in t-flash with DMEM-F12 supplemented with 5% of fetal bovine serum and were cultured for several passages. Cells maintained their morphological and other phenotypic characteristics in the different generations. The aim of this study was to isolate smooth muscle cells in order to use them as models for future assays with constrictor drugs, isolate and structurally characterize L-type calcium channels, to study cellular and molecular aspects of the vascular function 4 and to use them in tissue engineering.

Isolation of Human Umbilical Arterial Smooth Muscle Cells HUASMC

The umbilical cords are used to isolate smooth muscle cells by different ways. In this work we used the enzymatic treatment to isolated smooth muscle cells.

İnsan Umblikal Arter düz kas hücrelerinin izolasyonu (HUASMC)

The human umbilical cord (UC) is a biological sample that can be easily obtained just after birth. This biological sample is, most of the time, discarded ...

Biyoloji

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in live cells. Here we describe the method used in our laboratories for loading suspensions of human sperm with Ca2+-reporting dyes and measuring the fluorescence signal during physiological stimulation. Motile cells are isolated by direct swim-up and incubated under capacitating conditions for 0-24 h, depending upon the experiment. The cell-permeant AM (acetoxy methyl ester) ester form of the Ca2+-reporting dye is then added to a cell aliquot and a period of 1 h is allowed for loading of the dye into the cytoplasm. We use visible wavelength dyes to minimize photo-damage to the cells, but this means that ratiometric recording is not possible. Advantages and disadvantages of this approach are discussed. During the loading period cells are introduced into an imaging chamber and allowed to adhere to a poly-D-lysine coated coverslip. At the end of the loading period excess dye and loose cells are removed by connection of the chamber to the perfusion apparatus. The chamber is perfused continuously, stimuli and modified salines are then added to the perfusion header. Experiments are recorded by time-lapse acquisition of fluorescence images and analyzed in detail offline, by manually drawing regions of interest. Data are normalized to pre-stimulus levels such that, for each cell (or part of a cell), a graph showing the Ca2+ response as % change in fluorescence is obtained.

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulus-evoked [Ca2+]i signals of individual human sperm are assessed. Motile cells are loaded with Ca2+-sensitive fluorescent dye (AM-ester method) and immobilised in a perfusable chamber. Cells are imaged by time-lapse fluorescence microscopy and stimulated via the perfusing medium. Responses of single cells (or regions) are analysed offline using Excel.

Görüntüleme Ca Teknikleri 2 + İnsan Sperm sinyal

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

Patch Clamp Elektrofizyoloji ve Basınç kasılmaların kâğıda çizilmesi kullanarak arteriyel düz kas KV7 Potasyum Kanal Fonksiyon Exploring

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Isolation of Pulmonary Artery Smooth Muscle Cells from Neonatal Mice

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling pathways involved in vascular smooth muscle contraction in PASMC from fetal sheep. While sheep make an excellent model of term pulmonary hypertension, they are very expensive and lack the advantage of genetic manipulation found in mice. Conversely, the inability to isolate PASMC from mice was a significant limitation of that system. Here we described the isolation of primary cultures of mouse PASMC from P7, P14, and P21 mice using a variation of the previously described technique of Marshall et al.26 that was previously used to isolate rat PASMC. These murine PASMC represent a novel tool for the study of signaling pathways in the neonatal period. Briefly, a slurry of 0.5% (w/v) agarose + 0.5% iron particles in M199 media is infused into the pulmonary vascular bed via the right ventricle (RV). The iron particles are 0.2 &#956;M in diameter and cannot pass through the pulmonary capillary bed. Thus, the iron lodges in the small pulmonary arteries (PA). The lungs are inflated with agarose, removed and dissociated. The iron-containing vessels are pulled down with a magnet. After collagenase (80 U/ml) treatment and further dissociation, the vessels are put into a tissue culture dish in M199 media containing 20% fetal bovine serum (FBS), and antibiotics (M199 complete media) to allow cell migration onto the culture dish. This initial plate of cells is a 50-50 mixture of fibroblasts and PASMC. Thus, the pull down procedure is repeated multiple times to achieve a more pure PASMC population and remove any residual iron. Smooth muscle cell identity is confirmed by immunostaining for smooth muscle myosin and desmin.

We have developed a novel and reproducible technique to isolate primary cultures of pulmonary artery smooth muscle cells (PASMC) from mice as young as P7, thereby allowing better study of the signaling pathways involved in neonatal smooth muscle cell contraction and relaxation.

Yenidoğan fareler ile Pulmoner Arter Düz Kas Hücre İzolasyonu

Pulmonary hypertension is a significant cause of morbidity and mortality in infants. Historically, there has been significant study of the signaling ...

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ imaging data is time consuming and subject to bias. Automated signal analysis algorithms based on region of interest (ROI) detection have been implemented for one-dimensional line scan measurements, but there is no current algorithm which integrates optimized identification and analysis of ROIs in two-dimensional image sequences. Here an algorithm for rapid acquisition and analysis of ROIs in image sequences is described. It utilizes ellipses fit to noise filtered signals in order to determine optimal ROI placement, and computes Ca2+ signal parameters of amplitude, duration and spatial spread. This algorithm was implemented as a freely available plugin for ImageJ (NIH) software. Together with analysis scripts written for the open source statistical processing software R, this approach provides a high-capacity pipeline for performing quick statistical analysis of experimental output. The authors suggest that use of this analysis protocol will lead to a more complete and unbiased characterization of physiologic Ca2+ signaling.

Automated Analysis of Dynamic Ca2+ Signals in Image Sequences

Here a novel region of interest analysis protocol based on sorting best-fit ellipses assigned to regions of positive signal within two-dimensional time lapse image sequences is demonstrated. This algorithm may enable investigators to comprehensively analyze physiological Ca2+ signals with minimal user input and bias.

Dinamik Ca Otomatik Analizi<sup&gt; 2 +</supGörüntü Dizilerinde&gt; Sinyaller

Intracellular Ca2+ signals are commonly studied with fluorescent Ca2+ indicator dyes and microscopy techniques. However, quantitative analysis of Ca2+ ...

Measurement of Smooth Muscle Function in the Isolated Tissue Bath-applications to Pharmacology Research

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues. While this technique has been implemented for over 100 years, the versatility, simplicity and reproducibility of this assay helps it to remain an indispensable tool for pharmacologists and physiologists alike. Tissue bath systems are available in a wide array of shapes and sizes, allowing a scientist to evaluate samples as small as murine mesenteric arteries and as large as porcine ileum &#8211; if not larger. Central to the isolated tissue bath assay is the ability to measure concentration-dependent changes to isometric contraction, and how the efficacy and potency of contractile agonists can be manipulated by increasing concentrations of antagonists or inhibitors. Even though the general principles remain relatively similar, recent technological advances allow even more versatility to the tissue bath assay by incorporating computer-based data recording and analysis software. This video will demonstrate the function of the isolated tissue bath to measure the isometric contraction of an isolated smooth muscle (in this case rat thoracic aorta rings), and share the types of knowledge that can be created with this technique. Included are detailed descriptions of aortic tissue dissection and preparation, placement of aortic rings in the tissue bath and proper tissue equilibration prior to experimentation, tests of tissue viability, experimental design and implementation, and data quantitation. Aorta will be connected to isometric force transducers, the data from which will be captured using a commercially available analog-to-digital converter and bridge amplifier specifically designed for use in these experiments. The accompanying software to this system will be used to visualize the experiment and analyze captured data.

This protocol describes the measurement of isometric contraction in an isolated smooth muscle preparation, using an isolated tissue bath system and computer-based data acquisition.

Farmakoloji Araştırma İzole Doku Banyo-uygulamalarda Düz Kas Fonksiyon Ölçümü

Isolated tissue bath assays are a classical pharmacological tool for evaluating concentration-response relationships in a myriad of contractile tissues.  ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Hücre içi Ca İki foton Görüntüleme<sup&gt; 2+</sup&gt; Bir İzole Sıçan Aort Kullanım ve Endotel Nitrik Oksit Üretimi ve düz kas hücreleri

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Measurement of Calcium Fluctuations Within the Sarcoplasmic Reticulum of Cultured Smooth Muscle Cells Using FRET-based Confocal Imaging

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall health. A significant portion of intracellular Ca2+ content is found within the SR stores in VSMCs. As the only intracellular organelle with a close association to the surrounding extracellular space through plasma membrane-SR junctions, the SR can be considered to constitute the first line of response to any irregularity in Ca2+ transients, or stress experienced by the cell. Among its many functions, one of the most important is its role in the transmission of Ca2+-regulated signals throughout the cell to induce further cell-wide reactions downstream. The more common use of cytoplasmic Ca2+ indicators in this regard is overall insufficient for research into the highly dynamic changes to the intraluminal SR Ca2+ store that have yet to be fully characterized. Here, we provide a detailed protocol for the direct and clear measurement of luminal SR Ca2+. This tool is useful for investigation into the nuanced changes in SR Ca2+ that have significant subsequent effects on the normal function and health of the cell. Fluctuations in SR Ca2+ content specifically can provide us with a significant amount of information pertaining to cellular responses to disease or stress conditions experienced by the cell. In this method, a modified version of a SR-targeted Ca2+ indicator, D1SR, is used to detect Ca2+ fluctuations in response to the introduction of agents to cultured rat aortic smooth muscle cells (SMCs). Following incubation with the D1SR indicator, confocal fluorescence microscopy and fluorescence resonance energy transfer (FRET)-based imaging are used to directly observe changes to intraluminal SR Ca2+ levels under control conditions and with the addition of agonist agents that function to induce intracellular Ca2+ movement.

Currently, most available calcium indicators are used to quantify cytoplasmic calcium transients as indirect measures of calcium released from the sarcoplasmic reticulum in cultured smooth muscle cells. This protocol describes the use of a specific FRET-based indicator that allows direct measurement of calcium signals within the sarcoplasmic reticulum lumen.

Kullanımı Kültür düz kas hücrelerinin sarkoplazmik retikulum içinde Kalsiyum Değişiminin Ölçülmesi FRET tabanlı Konfokal Görüntüleme

Maintenance of steady-state calcium (Ca2+) levels in the sarcoplasmic reticulum (SR) of vascular smooth muscle cells (VSMCs) is vital to their overall ...

Isolation of Murine Coronary Vascular Smooth Muscle Cells

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs from the coronary circulation. Hearts with intact aortic arches were removed and perfused via retrograde Langendorff with digestion solution containing 300 Units/ml of collagenase type II, 0.1 mg/ml soybean trypsin inhibitor and 1 M CaCl2. The perfusates were collected at 15 min intervals for 90 min, pelleted by centrifugation, resuspended in plating media, and plated on tissue culture dishes. VSMCs were characterized by presence of SM22&#945;, &#945;-SMA, and vimentin. One of the main advantages of using this technique is the ability to isolate VSMCs from the coronary circulation of mice. Although the small number of cells obtained can limit some of the applications for which the cells can be utilized, isolated coronary VSMCs can be used in a variety of well-established cell culture techniques and assays. Studies investigating VSMCs from genetically modified mice can provide further information about structure-function and signaling processes associated with vascular pathologies.

The purpose of this protocol is to demonstrate the isolation and culture techniques of murine primary vascular smooth muscle cells (VSMCs) from the coronary circulation. Once VSMCs have been isolated, they can be used for many standard culture techniques.

Murin Koroner Damar düz kas hücrelerinin izolasyonu

While the isolation and culture of vascular smooth muscle cells (VSMCs) from large vessels is well established, we sought to isolate and culture VSMCs ...

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell (VSMC) proliferation. Common murine models study small vessels such as the carotid and femoral arteries. Herein we describe an in vivo system in which both VSMC proliferation and endothelial barrier function can be simultaneously assessed in a large vessel. We studied the infrarenal aortic response to injury in C57BL/6 mice. The aorta was injured from the left renal vein to the aortic bifurcation by 30 transmural crushes of 5-seconds duration with a cotton-tipped applicator. Morphological changes were assessed with conventional histology. Aorta wall thickness was measured from the luminal surface to the adventitia. EdU integration and counter staining with DAPI and alpha-actin was used to demonstrate VSMC proliferation. Activation of ERK1/2, a known moderator of intimal hyperplasia formation, was determined by Western Blot analysis. The effect of inflammation was determined by immunohistochemistry for B-cells, T-cells, and macrophages. En face sections of endothelium were visualized with scanning electron microscopy (SEM). Endothelial barrier function was determined with Evans Blue staining. Transmural injury resulted in aortic wall thickening. This injury induced VSMC proliferation, most prominently at 3 days after injury, and early activation of ERK1/2 and decreased p27kip1 expression. Injury did not result in increased B-cells, T-cells, or macrophages infiltration in the vessel wall. Injury caused partial endothelial cell denudation and loss of cell-cell contact. Injury resulted in a significant loss of endothelial barrier function, which returned to baseline after seven days. The murine transmural blunt aortic injury model provides an efficient system to simultaneously study both VSMC proliferation and endothelial barrier function in a large vessel.

Murine Aortic Crush Injury: An Efficient In Vivo Model of Smooth Muscle Cell Proliferation and Endothelial Function

Restenosis following cardiovascular procedures (bypass surgery, angioplasty, or stenting) is a significant problem reducing the durability of these procedures. An ideal therapy would inhibit smooth muscle cell (VSMC) proliferation while promoting regeneration of the endothelium. We describe a model for simultaneous assessment of VSMC proliferation and endothelial function in vivo.

Murin Aort Kırma Yaralanması: Verimli<emIn vivo</em&gt; Düz Kas Hücresi çoğalması ve Endotel Fonksiyon Modeli

Arterial reconstruction, whether angioplasty or bypass surgery, involves iatrogenic trauma causing endothelial disruption and vascular smooth muscle cell ...

Odak Ca 2 + Geçici Algılama

Odak Ca^{2 + Geçici Algılama}