Ce travail est financé par le Wellcome Trust, le Medical Research Council, The Royal Society, Birmingham Science City et La Fiducie recherche sur l&#39;infertilité. Nous tenons à souligner l&#39;aide d&#39;experts de la recherche Cairn dans la construction et l&#39;intégration des plates-formes d&#39;imagerie.

Spermatozoïdes de mâles fertiles saine, avec une analyse de sperme normal, sont normalement préparés pour l&#39;imagerie comme suit. <ol><li> Des échantillons de sperme sont stockés à 37 ° C pendant plus de 30 min. Les cellules sont isolées du plasma séminal par nager jusqu&#39;à en solution de Earle sel complété équilibré (SEBS; mM: 1,8 CaCl 2 .2 H 2 O, 5,37 KCl, 0,81 MgSO 4 .7 H 2 O, 26,2 NaHCO 3, 1,0 NaH 2 PO 4. 2H 2 O, 116,4 NaCl, 55,6 D-glucose, 2,73 Na pyruvate, le lactate de Na 41,8) complémenté avec 0,3% d&#39;acide charbon de-lipidated/fatty gratuitement Fraction V BSA (qualité de la BSA est crucial pour réussir capacitation du sperme). 1 ml de sEBBS est pipeté dans chaque d&#39;une série de tubes de 5 ml et doucement underlayered avec 0,3 ml de sperme. Après une incubation de 1 heure (37 ° C, 6% de CO 2) au sommet de 0,7 ml est doucement retiré de chaque tube et mis en commun. 10 ul de la suspension du sperme est dilué avec 90 ul de 1% (v / v) de formol pour immobiliser les cellules, puis de sperme sont comptées dans une chambre de Neubauer. La densité des cellules dans la suspension est ensuite ajusté (avec SEBS) à 6 millions de cellules / ml. </li><li> L&#39;échantillon est ensuite divisé en aliquotes de 200 pl dans des tubes faiblement recouvertes et incubées (37 ° C, 6% de CO 2) dans pour les 5-6 h pour permettre capacitation. </li><li> Lamelles (22x50 mm) ont été préalablement traités avec de la poly-D-lysine. 10 pl de poly-D-lysine solution (10% p / v) est appliqué comme un certain nombre de petites gouttes vers le centre de la lamelle. Le poly-D-lysine est ensuite sécher à l&#39;air. Cela peut être sur une scène chauffée et devrait être de compléter la sécheresse. Une lamelle est attaché avec de la graisse à vide pour un espace clos, construite à cet effet, pleins, chambre de polycarbonate imagerie (dimensions 35 mm x 20 mm x 5 mm, capacité ≈ 180 pl.) Similaire à la chambre Warner RC20 La poly-D-lysine lamelle revêtement constitue la base de la chambre lorsque les cellules sont visualisés sur un microscope inversé et une circulaire de 12 mm de diamètre lamelle forme la surface supérieure de la chambre, ce qui permet la transmission de la lumière. </li><li> Oregon Green BAPTA1-AM (OGB) ou de calcium vert 1-AM sont utilisés pour les cellules de l&#39;étiquetage. OGB est préparé par dissolution dans le DMSO. Pluronic F127 acide (un détergent) est inclus dans le DMSO pour empêcher «l&#39;agglutination» de la teinture. Ceci peut être préparé en laboratoire (100 Pluronic mg dans 0,5 ml de DMSO), immédiatement avant l&#39;utilisation, ou peuvent être achetés pré-préparés. 20 ul est ajouté à une aliquote de 50 mg de l&#39;OGB (2,5 mg / ml). Le flacon peut être conservé congelé et décongelé pour utilisation ultérieure. </li><li> Après capacitation du sperme (5-6 h en sEBBS, 37 ° C; 6% de CO 2) d&#39;un tube est sélectionné pour l&#39;imagerie et de 1,2 pi de solution de OGB est ajouté, donnant une concentration finale de 10 pM. Le tube est ensuite incubée pendant encore de 40 minutes, après quoi la suspension cellulaire est doucement injecté dans le port d&#39;entrée de la chambre de l&#39;imagerie avec un P1000 (bleu) pointe de la pipette. La chambre est placée dans le côté lamelle incubateur, la poly-D-lysine vers le bas, pendant 20 min. Les cellules ont tendance à nager le long des surfaces de la chambre et va adhérer à la zone de la poly-D-lysine. </li><li> La chambre est maintenant montée sur le microscope, relié à l&#39;appareil de perfusion et perfusé à environ 0,5 ml / min. Une pompe à rouleaux nourrit une solution saline dans la chambre et le débordement de l&#39;orifice de sortie est éliminé par une pompe d&#39;aspiration avec piège. La préparation est laissé dans l&#39;obscurité pendant au moins 10 min, tout en vrac et les cellules de colorant extracellulaire sont enlevés par une perfusion de la chambre. Stabilité de la température est extrêmement important parce que de petites fluctuations peuvent non seulement affecter la cellule de Ca 2 + homéostasie, mais peut également affecter Kd de la teinture. Des expériences sont normalement effectuées à 25 ° C, obtenue en maintenant la température de la pièce sombre à ce niveau. Nous avons trouvé que le maintien de la température ambiante au niveau requis fournit une plus grande stabilité en température et se concentrer que d&#39;utiliser une phase à température contrôlée ou d&#39;un chauffage thermostaté sur l&#39;afflux saline. </li><li> Les cellules sont considérées sous contraste de phase (40x 60x ou immersion dans l&#39;huile) objective et une zone pour l&#39;imagerie est sélectionné. La portion de la zone de poly-D-lysine enduit qui est près du port d&#39;entrée est préférable, lorsque le flux est laminaire salée et cohérente. Il est également important d&#39;utiliser une zone où la densité des cellules est appropriée (densité excessive affecte la qualité et l&#39;intégrité des données grâce ramassage du signal à partir des cellules adjacentes) et où les cellules sont suffisamment attachés, mais l&#39;activité est perceptible flagellaire. Une image en contraste de phase est sauvé. Le microscope est alors commuté en mode de fluorescence (excitation 480 nm; émission de 540 nm) et temps d&#39;exposition est réduite au minimum nécessaire pour obtenir une image claire de fluorescence (généralement de 50 à 200 ms). </li><li> L&#39;expérience est lancée en activant le logiciel de séries temporelles d&#39;acquisition d&#39;image (IQ). Généralement les images sont acquises à raison de 0,1 Hz et d&#39;éclairage est limité à des périodes d&#39;acquisition des images en utilisant uniquement une logire d&#39;obturation contrôlée. Beaucoup des taux plus élevés d&#39;acquisition des images peut être utilisé mais il faut tenir compte des problèmes de blanchiment et de la production d&#39;artefacts dus à la photo-dommages aux cellules (voir la discussion). QI (et la plupart des autres plates-formes de logiciels d&#39;acquisition) permettra en temps réel graphique de la fluorescence lors de l&#39;expérience. </li><li> Après une période de contrôle de 3-5 minutes la durée de manipulation des constituants salins (comme [Ca 2 +] o) et l&#39;application de médicaments est réalisée par le remplacement d&#39;une solution saline dans l&#39;entête de la perfusion. Moment de l&#39;addition de chaque stimulus est noté afin que le temps d&#39;arrivée dans la chambre de l&#39;imagerie peut être calculée, offrant une précision suffisante pour l&#39;évaluation des réponses lentes décrit ici (échantillonnés à 0,1 Hz). Pour des réponses plus rapides plus grande précision peut être obtenue en ajoutant des stimuli directement au flux salin à travers un port afflux secondes comme prévu dans la chambre de Warner RC20. </li><li> Les images sont analysées hors ligne en utilisant le QI. Régions d&#39;intérêt (ROI) sont dessinés autour de chaque cellule (ou une partie de la cellule) et aussi une zone de cellules libres est sélectionné (pour soustraction de fond automatique par le logiciel. La série d&#39;images est ensuite vérifiée pour enlever les cellules qui sont morts ou ont subi la réaction acrosomique ( qui apparaît comme une augmentation importante et rapide de la fluorescence suivie par la perte de colorant cytoplasmique) pendant l&#39;expérience et ceux qui ont montré un mouvement suffisant pour causer des artefacts lors analysés comme une série chronologique. </li><li> Une série d&#39;intensité de fluorescence du temps est alors obtenue pour chaque ROI et ces données sont analysées hors ligne dans Excel. Initialement fluorescence est normalisée à la valeur moyenne obtenue durant la période de contrôle, en utilisant l&#39;équation R = [(reste FF) / F repos] x 100%, où R est le changement de la fluorescence% par rapport à la période de contrôle, F est l&#39;intensité de fluorescence à un instant t et de repos F est la moyenne d&#39;au moins 30 déterminations de F obtenue durant la période de contrôle. </li></ol> Les résultats représentatifs La figure 1 montre une série d&#39;images à partir d&#39;une expérience dans laquelle les cellules ont été stimulées avec 3 progestérone uM. La rangée supérieure et le film 1 montrent les images de fluorescence en échelle de gris et les mages mêmes sont présentés ci-dessous (et dans le film 2) en pseudo (lookup &#39;16_colors table »dans l&#39;image J), ​​où« cool »couleurs indiquent une faible intensité fluorescente et «chaudes» couleurs indiquent haute intensité de fluorescence. Les cellules peuvent être consultés dans les pseudo-cours de l&#39;expérience, en utilisant les tables de recherche dans le QI, mais en utilisant une échelle de gris est généralement plus informative pour évaluer. Si les cellules sont bien étiquetés. Les deux premières images ont été recueillies à 0 s et 100 s après le début de l&#39;enregistrement. Fluorescence doit être stable et tend à être plus forte dans l&#39;espace post acrosomique des spermatozoïdes et le cou. La progestérone est entré dans la chambre d&#39;imagerie à environ 175 s et le 3 ème et 4 ème images (180 s et 220 s) montre une augmentation rapide de la [Ca 2 +] i (fluorescence), originaires de la tête et du cou postérieure de la cellule. Après les images sont à 290, 360, 740, 990 et 1440 s, montrant la décomposition de la première [Ca 2 +] i transitoire et le développement d&#39;une élévation secondaire soutenue. La figure 2 montre une analyse de tableur, de convertir les valeurs brutes de fluorescence pour chaque ROI à la fluorescence normalisée (variation en% de la fluorescence par rapport à la période de contrôle) La figure 3 montre le temps normalisé parcelles de fluorescence pour 3 cellules montrant «typique» des réponses à trois progestérone uM. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig1.jpg" alt="Figure 1" /> Figure 1. Exemple de données à partir d&#39;un cellulaire stimulée par la progestérone. Une série d&#39;images de fluorescence en échelle de gris (rangée du haut) et pseudo (rangée du bas) sont affichés. Points de temps sont de 0, 180, 220, 290, 360 et 990. 3 progestérone uM entra dans la chambre d&#39;imagerie à 175 s. ROIs sont présentés dans le premier panneau. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig2.jpg" alt="Figure 2" /> Figure 2. Analyse de données unique de fluorescence de cellules dans Excel. Les chiffres en noir sont des séries chronologiques de données de fluorescence, disposées verticalement. Les chiffres en rouge (ci-dessous) sont des données normalisées obtenues en utilisant l&#39;équation donnée dans le texte. Le graphique montre la fluorescence en temps normalisé parcelle pour 64 cellules dans cette expérience qui, lors de la stimulation, montre une augmentation transitoire de la fluorescence suivie d&#39;une lente montée et une série de petites oscillations. <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig3.jpg" alt="Figure 3" /> Figure 3. Fluorescence en temps des traces de 3 cellules individuelles, exprimée en% de changement par rapport à la valeur de contrôle .. 3 progestérone uM a été ajouté à l&#39;heure indiquée par la flèche. La ligne pointillée montre fluorescence moyenne de commande.

<ol>
	<li>Haughland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Handbook of Fluorescent Probes and Research Products. , (2002).</li><li>Nishigaki, T., Wood, C. D., Shiba, K., Baba, S. A., Darszon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stroboscopic+illumination+using+light-emitting+diodes+reduces+phototoxicity+in+fluorescence+cell+imaging.">Stroboscopic illumination using light-emitting diodes reduces phototoxicity in fluorescence cell imaging.</a> Biotechniques. 41, 191-197 (2006).</li></ol>

Lorsqu&#39;elles sont menées avec succès, cette technique permet l&#39;enregistrement de la distribution et la cinétique de spontané et induit des signaux Ca 2 + dans le sperme humain. Les réponses peuvent être obtenues à partir d&#39;un grand nombre de cellules (jusqu&#39;à 200) qui est important car le sperme humain peut montrer beaucoup de variation dans leurs spontanée et stimulée de signaux Ca 2 +. Étiquetage réussie et la survie des cellules pendant l&#39;enregistrement sont très dépendants de la qualité de l&#39;échantillon. Échantillons pauvres donnent mauvais étiquetage, les réponses pauvres et les cellules peuvent mourir pendant l&#39;enregistrement. Le sperme de l&#39;homme sont très sensibles à la photo-dommages et nous avons donc utiliser l&#39;éclairage minimal nécessaire (à la fois l&#39;intensité et la durée d&#39;exposition) afin de maximiser la survie des cellules et de minimiser les artefacts dus à la mort cellulaire. Une caméra à haute sensibilité (permettant l&#39;utilisation de faible intensité d&#39;éclairage) est un grand avantage puisque la caméra va ramasser la fluorescence est faible. Rétro-éclairé, EM-CCD sont particulièrement bien adaptée, bien que très coûteux. L&#39;éclairage par DEL (au lieu d&#39;utiliser une lampe au xénon ou au mercure avec filtre d&#39;excitation améliore également la survie cellulaire (Nishigaki et al, 2006). Nous n&#39;utilisons pas de Fura-2, malgré les avantages évidents de ratio-métrique d&#39;imagerie, car Fura nécessite excitation avec une lumière UV et parce qu&#39;il est nécessaire de prendre deux images pour chaque rapport. Pour les données obtenues avec seule longueur d&#39;onde, les colorants de la lumière visible, la normalisation de l&#39;intensité de fluorescence compense largement la différence dans le colorant de charge entre les cellules, mais pas pour la distribution colorant dans une cellule individuelle, et cela doit être pris en compte. Bien que les colorants seule longueur d&#39;onde peut, en principe, être calibré, la précision de la technique est mauvaise et nous ne tentons pas de faire cela. Considérant que les données obtenues avec rapport de Fura-2 (ou l&#39;émission ratio de colorant Indo), même sans calibration, donner une représentation fidèle de manière acceptable les changements relatifs dans [Ca 2 +] i, l&#39;intensité de fluorescence des colorants seule longueur d&#39;onde est loin d&#39;être linéaire liées à [Ca 2 +] i. Plus de la partie la plus utile de la courbe de saturation de la relation pour les teintures seule longueur d&#39;onde se rapproche généralement logarithmique. Nous utilisons actuellement Oregon Green BAPTA-1 (figure 4) parce qu&#39;il est sensible aux petits changements de [Ca 2 +] i près de repos au niveau de l (50-100 nM). Lorsque [Ca 2 +] i monte au dessus de 1 uM réponses seront sous-représentés en termes de changement de fluorescence et le colorant peut saturer. Une option pour l&#39;amélioration de la technique sans recourir à une excitation UV est de doubler les cellules de charge avec un colorant tel que Fluo-3 et Fura rouge. Les deux peuvent être excités à 488 nm mais simultanées leurs réponses sont très différentes. Enregistrement de l&#39;émission à 540 et 650 nm offre un rapport qui peut fournir une meilleure méthode pour un suivi précis de [Ca 2 +] i (Haughland, 2002) et peut être applicable aux spermatozoïdes (Nisigaki et al, 2006). <img src="/files/ftp_upload/1996/1996fig4.jpg" alt="Figure 4" /> Figure 4. Relation entre libre [Ca 2 +] (nm) et émission de fluorescence à pic de longueur d&#39;onde (environ 525 nm) pour Oregon Green BAPTA-1 et Oregon Green BAPTA-2. OGB1 donne plus de fluorescence à se reposer [Ca 2 +], mais sature à des niveaux inférieurs et donc a une plus petite plage utilisable. Les données de ces parcelles ont été obtenues à partir des sondes moléculaires manuel (Haughland, 2002).

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		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Low light level Camera</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>QImaging</td>
<td>Rolera XR</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Oregon Green BAPTA-1</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>06807</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Andor</td>
<td>IQ</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Imaging Software</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>National Institues of Health</td>
<td>Image J</td>
<td>Public domain software</td>
</tr>
<tr>
<td>LED illumination system</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Cairn Research</td>
<td>Opto LED</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pluronic F-127 (20% solution in DMSO)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>P3000MP</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

techniques for imaging ca2+ signaling in human sperm

La microscopie à fluorescence des cellules chargées avec fluorescentes, Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Colorants sensibles est utilisé pour la mesure des aspects spatiaux et temporels de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; De signalisation dans les cellules vivantes. Nous décrivons ici la méthode utilisée dans nos laboratoires pour le chargement des suspensions de sperme humain avec le Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Déclaration des colorants et de mesure du signal de fluorescence lors de la stimulation physiologique. Cellules mobiles sont isolés par directe swim-up et incubés dans des conditions de capacitation 0-24 h, selon l&#39;expérience. La forme des cellules perméants AM ester (ester méthylique d&#39;acétoxy) du Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;-Déclaration colorant est ensuite ajouté à un aliquot de cellules et une durée de 1 h est autorisé pour le chargement de la teinture dans le cytoplasme. Nous utilisons des colorants longueur d&#39;onde visible pour minimiser la photo-dommages aux cellules, mais cela signifie que l&#39;enregistrement ratiométrique n&#39;est pas possible. Avantages et inconvénients de cette approche sont discutés. Pendant la période de chargement cellules sont introduits dans une chambre d&#39;imagerie et admises à adhérer à une lamelle de poly-D-lysine couché. A la fin de l&#39;excès de colorant période de chargement et de cellules lâches sont enlevés par raccordement de la chambre à l&#39;appareil de perfusion. La chambre est perfusé en continu, des stimuli et des Salines modifiés sont ensuite ajoutés à la tête de la perfusion. Des expériences sont enregistrées par time-lapse acquisition d&#39;images de fluorescence et analysés en détail déconnecté, par dessinant manuellement des régions d&#39;intérêt. Les données sont normalisées à pré-relance des niveaux tels que, pour chaque cellule (ou une partie d&#39;une cellule), un graphique montrant le Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Réponse que le changement% en fluorescence est obtenue.

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Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

Stimulation évoqués [Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt;] I signaux de sperme humain individuelles sont évaluées. Cellules mobiles sont chargés avec du Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Sensibles colorant fluorescent (AM-ester méthode) et immobilisé dans une chambre perfusable. Les cellules sont imagées par time-lapse de microscopie par fluorescence et stimulé via le milieu de perfusion. Les réponses des cellules simples (ou régions) sont analysés hors ligne en utilisant Excel.

Techniques d&#39;imagerie Ca 2 + Signalisation dans le sperme humain

Fluorescence microscopy of cells loaded with fluorescent, Ca2+-sensitive dyes is used for measurement of spatial and temporal aspects of Ca2+ signaling in ...

techniques-for-imaging-ca2-signaling-in-human-sperm

Research

JoVE Journal

Biology

Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

17.0K vues.  University of Birmingham. Stimulation évoqués [Ca 2 +] I signaux de sperme humain individuelles sont évaluées. Cellules mobiles sont chargés avec du Ca 2 + Sensibles colorant fluorescent (AM-ester méthode) et immobilisé dans une chambre perfusable. Les cellules sont imagées par time-lapse de microscopie par fluorescence et stimulé via le milieu de perfusion. Les réponses des cellules simples (ou régions) sont analysés hors ligne en utilisant Excel.

Vidéo: Techniques for Imaging Ca2+ Signaling in Human Sperm

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to measure odor evoked activity in the antennal lobe1. From then on, it has been continuously refined and applied to different neuropiles in the bee brain. Here, we describe the preparation currently used in the lab to measure activity in mushroom body neurons using a dextran coupled calcium-sensitive dye (Fura-2). We retrogradely stain mushroom body neurons by injecting dye into their axons or soma region. We focus on reducing the invasiveness, to achieve a preparation in which it is still possible to train the bee using PER conditioning. We are able to monitor and quantify the behavioral response by recording electro-myograms from the muscle which controls the PER (M17)2.
After the physiological experiment the imaged structures are investigated in greater detail using confocal scanning microscopy to address the identity of the neurons.

In vivo Ca2+- Imaging of Mushroom Body Neurons During Olfactory Learning in the Honey Bee

Bees can be conditioned in an appetitive olfactory learning paradigm (PER-conditioning). Using odors as stimuli, we established a method in which behavior is recorded while simultaneously Calcium Imaging is used to measure odor evoked activity in mushroom body neurons in vivo.

In vivo Ca 2 + - Imagerie des neurones du corps champignons Pendant l&#39;apprentissage olfactif dans le Honey Bee

The in vivo and semi-in vivo preparation for Calcium imaging has been developed in our lab by Joerges, K&uuml;ttner and Galizia over ten years ago, to ...

Recherche

Biologie

Fluorescence in situ hybridization (FISH) Protocol in Human Sperm

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic process in the parents. In human males, these errors can lead to the production of spermatozoa with numerical chromosome abnormalities which represent an increased risk of transmitting these anomalies to the offspring.
For this reason, the technique of fluorescence in situ hybridization (FISH) on sperm nuclei has become a protocol widely incorporated in the context of clinical diagnosis. This practice provides an estimate of the frequencies of numerical chromosome abnormalities in the gametes of the patients that seek for genetic reproductive advice.
To date, the chromosomes most frequently included in sperm FISH analysis are chromosomes X, Y, 13, 18 and 21.
This video-article describes, step by step, how to process and fix a human semen sample, how to decondense and denature the sperm chromatin, how to proceed to obtain sperm FISH preparations, and how to visualize the results at the microscope. Special remarks of the most relevant steps are given to achieve the best results.

Fluorescence in situ hybridization FISH Protocol in Human Sperm

This video-article describes, step by step, how to process a semen sample to achieve good-quality fluorescence in situ hybridization on human spermatozoa. Preparations obtained can be used for aneuploidy screening in the context of clinical diagnosis.

Fluorescence In situ</emL&#39;hybridation> (FISH) du Protocole dans le sperme humain

Aneuploidies are the most frequent chromosomal abnormalities in humans. Most of these abnormalities result from meiotic errors during the gametogenic ...

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may also be used to study the structure-function relationship for other ion channels and neurotransmitter receptors1. BK channels are widely expressed in different tissues and have been implicated in many physiological functions, including regulation of smooth muscle contraction, frequency tuning of inner hair cells and regulation of neurotransmitter release2-6. BK channels are activated by membrane depolarization and by intracellular Ca2+ and Mg2+ 6-9. Therefore, the protocol is designed to control both the membrane voltage and the intracellular solution. In this protocol, messenger RNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes (stage V-VI) followed by 2-5 days of incubation at 18&deg;C10-13. Membrane patches that contain single or multiple BK channels are excised with the inside-out configuration using patch clamp techniques10-13. The intracellular side of the patch is perfused with desired solutions during recording so that the channel activation under different conditions can be examined. To summarize, the mRNA of BK channels is injected into Xenopus laevis oocytes to express channel proteins on the oocyte membrane; patch clamp techniques are used to record currents flowing through the channels under controlled voltage and intracellular solutions.

Patch Clamp and Perfusion Techniques for Studying Ion Channels Expressed in Xenopus oocytes

Ionic current of BK channels is recorded using patch clamp techniques. BK channels are expressed in Xenopus oocytes by injecting messenger RNA. The intracellular solution during patch clamp recordings is controlled by a perfusion system.

Patch Clamp et des techniques de perfusion pour étudier les canaux ioniques Exprimé en Xenopus Ovocytes

The protocol presented here is designed to study the activation of the large conductance, voltage- and Ca2+-activated K+ (BK) channels. The protocol may ...

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative stress refers to the aberrant formation of ROS (reactive oxygen species), which include O2&bull;-, H2O2, and hydroxyl radicals. Reactive oxygen species influences a multitude of cellular processes including signal transduction, cell proliferation and cell death1-6. ROS have the potential to damage vascular and organ cells directly, and can initiate secondary chemical reactions and genetic alterations that ultimately result in an amplification of the initial ROS-mediated tissue damage. A key component of the amplification cascade that exacerbates irreversible tissue damage is the recruitment and activation of circulating inflammatory cells. During inflammation, inflammatory cells produce cytokines such as tumor necrosis factor-&alpha; (TNF&alpha;) and IL-1 that activate endothelial cells (EC) and epithelial cells and further augment the inflammatory response7. Vascular endothelial dysfunction is an established feature of acute inflammation. Macrophages contribute to endothelial dysfunction during inflammation by mechanisms that remain unclear. Activation of macrophages results in the extracellular release of O2&bull;- and various pro-inflammatory cytokines, which triggers pathologic signaling in adjacent cells8. NADPH oxidases are the major and primary source of ROS in most of the cell types. Recently, it is shown by us and others9,10 that ROS produced by NADPH oxidases induce the mitochondrial ROS production during many pathophysiological conditions. Hence measuring the mitochondrial ROS production is equally important in addition to measuring cytosolic ROS. Macrophages produce ROS by the flavoprotein enzyme NADPH oxidase which plays a primary role in inflammation. Once activated, phagocytic NADPH oxidase produces copious amounts of O2&bull;- that are important in the host defense mechanism11,12. Although paracrine-derived O2&bull;- plays an important role in the pathogenesis of vascular diseases, visualization of paracrine ROS-induced intracellular signaling including Ca2+ mobilization is still hypothesis. We have developed a model in which activated macrophages are used as a source of O2&bull;- to transduce a signal to adjacent endothelial cells. Using this model we demonstrate that macrophage-derived O2&bull;- lead to calcium signaling in adjacent endothelial cells.

Visualization of Vascular Ca2+ Signaling Triggered by Paracrine Derived ROS

An efficient method to gain insights into visualizing the paracrine-derived ROS induction of endothelial Ca2+ signaling is described. This method takes advantage of measuring paracrine derived ROS triggered Ca2+ mobilization in vascular endothelial cells in a co-culture model.

Visualisation des vasculaire Ca 2 + Signalisation Déclenchée par paracrine Dérivé ROS

Oxidative stress has been implicated in a number of pathologic conditions including ischemia/reperfusion damage and sepsis. The concept of oxidative ...

A High-content Imaging Workflow to Study Grb2 Signaling Complexes by Expression Cloning

Signal transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain proliferation and differentiation and requires tight control. Signal transduction is initiated by binding of an external ligand to a transmembrane receptor and activation of downstream signaling cascades. A key regulator of mitogenic signaling is Grb2, a modular protein composed of an internal SH2 (Src Homology 2) domain flanked by two SH3 domains that lacks enzymatic activity. Grb2 is constitutively associated with the GTPase Son-Of-Sevenless (SOS) via its N-terminal SH3 domain. The SH2 domain of Grb2 binds to growth factor receptors at phosphorylated tyrosine residues thus coupling receptor activation to the SOS-Ras-MAP kinase signaling cascade. In addition, other roles for Grb2 as a positive or negative regulator of signaling and receptor endocytosis have been described. The modular composition of Grb2 suggests that it can dock to a variety of receptors and transduce signals along a multitude of different pathways1-3.
	Described here is a simple microscopy assay that monitors recruitment of Grb2 to the plasma membrane. It is adapted from an assay that measures changes in sub-cellular localization of green-fluorescent protein (GFP)-tagged Grb2 in response to a stimulus4-6. Plasma membrane receptors that bind Grb2 such as activated Epidermal Growth Factor Receptor (EGFR) recruit GFP-Grb2 to the plasma membrane upon cDNA expression and subsequently relocate to endosomal compartments in the cell. In order to identify in vivo protein complexes of Grb2, this technique can be used to perform a genome-wide high-content screen based on changes in Grb2 sub-cellular localization. The preparation of cDNA expression clones, transfection and image acquisition are described in detail below. Compared to other genomic methods used to identify protein interaction partners, such as yeast-two-hybrid, this technique allows the visualization of protein complexes in mammalian cells at the sub-cellular site of interaction by a simple microscopy-based assay. Hence both qualitative features, such as patterns of localization can be assessed, as well as the quantitative strength of the interaction.

A high-content screening method for the identification of novel signaling competent transmembrane receptors is described. This method is amenable to large-scale automation and allows predictions about in vivo protein binding and the sub-cellular localization of protein complexes in mammalian cells.

Un workflow d&#39;imagerie à haute teneur pour étudier Grb2 complexes de signalisation par clonage d&#39;expression

Signal  transduction by growth factor receptors is essential for cells to maintain  proliferation and differentiation and requires tight control. Signal  ...

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

The study of electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ handling abnormalities requires isolated cardiomyocytes. In addition, the possibility to investigate myocytes from patients using these techniques is an invaluable requirement to elucidate the molecular basis of cardiac diseases such as atrial fibrillation (AF).1 Here we describe a method for isolation of human atrial myocytes which are suitable for both patch-clamp studies and simultaneous measurements of intracellular Ca2+ concentrations. First, right atrial appendages obtained from patients undergoing open heart surgery are chopped into small tissue chunks ("chunk method") and washed in Ca2+-free solution. Then the tissue chunks are digested in collagenase and protease containing solutions with 20 &mu;M Ca2+. Thereafter, the isolated myocytes are harvested by filtration and centrifugation of the tissue suspension. Finally, the Ca2+ concentration in the cell storage solution is adjusted stepwise to 0.2 mM. We briefly discuss the meaning of Ca2+ and Ca2+ buffering during the isolation process and also provide representative recordings of action potentials and membrane currents, both together with simultaneous Ca2+ transient measurements, performed in these isolated myocytes.

Isolation of Human Atrial Myocytes for Simultaneous Measurements of Ca2+ Transients and Membrane Currents

We describe the isolation of human atrial myocytes which can be used for intracellular Ca2+ measurements in combination with electrophysiological patch-clamp studies.

Isolation des myocytes auriculaires humaines pour la mesure simultanée de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Transitoires et courants membranaires

The study of  electrophysiological properties of cardiac ion channels with the patch-clamp  technique and the exploration of cardiac cellular Ca2+ ...

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Spermatozoa are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be prepared to face a constantly changing environment and to overcome several physical barriers. Being in essence transcriptionally and translationally silent, these motile cells rely profoundly on diverse signaling mechanisms to orient themselves and swim in a directed fashion, and to contend with challenging environmental conditions during their journey to find the egg. In particular, Ca2+-mediated signaling is pivotal for several sperm functions: activation of motility, capacitation (a complex process that prepares sperm for the acrosome reaction) and the acrosome reaction (an exocytotic event that allows sperm-egg fusion). The use of fluorescent dyes to track intracellular fluctuations of this ion is of remarkable importance due to their ease of application, sensitivity, and versatility of detection. Using one single dye-loading protocol we utilize four different fluorometric techniques to monitor sperm Ca2+ dynamics. Each technique provides distinct information that enables spatial and/or temporal resolution, generating data both at single cell and cell population levels.

Measuring Intracellular Ca2+ Changes in Human Sperm using Four Techniques: Conventional Fluorometry, Stopped Flow Fluorometry, Flow Cytometry and Single Cell Imaging

Intracellular Ca2+ dynamics are very important in sperm physiology and Ca2+-sensitive fluorescent dyes constitute a versatile tool to study them. Population experiments (fluorometry and stopped flow fluorometry) and single cell experiments (flow cytometry and single cell imaging) are used to track spatio-temporal [Ca2+] changes in human sperm cells.

Mesure intracellulaire de Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; Les changements dans le sperme humain à l&#39;aide de quatre techniques: FLUOROMETRIE conventionnel, s&#39;est arrêté Fluorimétrie du flux, la cytométrie en flux et l&#39;imagerie cellulaire unique

Spermatozoa  are male reproductive cells especially designed to reach, recognize and fuse  with the egg. To perform these tasks, sperm cells must be ...

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, electrical excitability and cell proliferation. The diversity and specificity of Ca2+ signaling derives from mechanisms by which Ca2+ signals are generated to act over different time and spatial scales, ranging from cell-wide oscillations and waves occurring over the periods of minutes to local transient Ca2+ microdomains (Ca2+ puffs) lasting milliseconds. Recent advances in electron multiplied CCD (EMCCD) cameras now allow for imaging of local Ca2+ signals with a 128 x 128 pixel spatial resolution at rates of &#62;500 frames sec-1 (fps). This approach is highly parallel and enables the simultaneous monitoring of hundreds of channels or puff sites in a single experiment. However, the vast amounts of data generated (ca. 1 Gb per min) render visual identification and analysis of local Ca2+ events impracticable. Here we describe and demonstrate the procedures for the acquisition, detection, and analysis of local IP3-mediated Ca2+ signals in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators using both wide-field epi-fluorescence (WF) and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. Furthermore, we describe an algorithm developed within the open-source software environment Python that automates the identification and analysis of these local Ca2+ signals. The algorithm localizes sites of Ca2+ release with sub-pixel resolution; allows user review of data; and outputs time sequences of fluorescence ratio signals together with amplitude and kinetic data in an Excel-compatible table.

Imaging Local Ca2+ Signals in Cultured Mammalian Cells

Here we present techniques for imaging local IP3-mediated Ca2+ events using fluorescence microscopy in intact mammalian cells loaded with Ca2+ indicators together with an algorithm that automates identification and analysis of these events.

Imagerie Ca locale<sup&gt; 2+</sup&gt; Signaux de cellules de mammifères cultivées

Cytosolic Ca2+ ions regulate numerous aspects of cellular activity in almost all cell types, controlling processes as wide-ranging as gene transcription, ...

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on changes in intracellular calcium ([Ca2+]i) and nitric oxide (NO). In order to understand how [Ca2+]i, NO and downstream molecules are handled by a blood vessel in response to vasoconstrictors and vasodilators, we developed a novel technique that applies calcium-labeling (or NO-labeling) dyes with two photon microscopy to measure calcium handling (or NO production) in isolated blood vessels. Described here is a detailed step-by-step procedure that demonstrates how to isolate an aorta from a rat, label calcium or NO within the endothelial or smooth muscle cells, and image calcium transients (or NO production) using a two photon microscope following physiological or pharmacological stimuli. The benefits of using the method are multi-fold: 1) it is possible to simultaneously measure calcium transients in both endothelial cells and smooth muscle cells in response to different stimuli; 2) it allows one to image endothelial cells and smooth muscle cells in their native setting; 3) this method is very sensitive to intracellular calcium or NO changes and generates high resolution images for precise measurements; and 4) described approach can be applied to the measurement of other molecules, such as reactive oxygen species. In summary, application of two photon laser emission microscopy to monitor calcium transients and NO production in the endothelial and smooth muscle cells of an isolated blood vessel has provided high quality quantitative data and promoted our understanding of the mechanisms regulating vascular function.

Two-photon Imaging of Intracellular Ca2+ Handling and Nitric Oxide Production in Endothelial and Smooth Muscle Cells of an Isolated Rat Aorta

Vascular cell functiondepends on activity of intracellular messengers. Described here is an ex vivo two photon imaging method that allows the measurement of intracellular calcium and nitric oxide levels in response to physiological and pharmacological stimuli in individual endothelial and smooth muscle cells of an isolated aorta.

Deux photons imagerie intracellulaire de Ca<sup&gt; 2+</sup&gt; Manipulation et production d&#39;oxyde nitrique endothélial et en cellules de muscle lisse d&#39;un Rat aorte isolée

Calcium is a very important regulator of many physiological processes in vascular tissues. Most endothelial and smooth muscle functions highly depend on ...

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The study of chromosome behavior in oocytes from model organisms holds much promise to uncover the molecular basis of the susceptibility of human oocytes to aneuploidy. Drosophila melanogaster is amenable to genetic manipulation, with over 100 years of research, community, and technique development. Visualizing chromosome behavior and spindle assembly in Drosophila oocytes has particular challenges, however, due primarily to the presence of membranes surrounding the oocyte that are impenetrable to antibodies. We describe here protocols for the collection, preparation, and imaging of meiosis I spindle assembly and chromosome behavior in Drosophila oocytes, which allow the molecular dissection of chromosome segregation in this important model organism.

Techniques for Imaging Prometaphase and Metaphase of Meiosis I in Fixed Drosophila Oocytes

We present protocols for the collection, preparation, and imaging of mature Drosophila oocytes. These methods allow the visualization of chromosome behavior and spindle assembly and function during meiosis.

Techniques for Imaging Prométaphase et Metaphase de méiose I fixe<em&gt; Drosophila</em&gt; ovocytes

Chromosome segregation in human oocytes is error prone, resulting in aneuploidy, which is the leading genetic cause of miscarriage and birth defects. The ...