Diese Methode ermöglicht die einfache Erstellung von Guide-RNA-Expressionsplasmiden für CRISPR-erleichterte Experimente. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Klonen in einem einzigen Schritt durchgeführt werden kann und gepaarte Führungs-RNAs mit single-guide RNA-Expressionsplasmiden erstellt werden können. Um dieses Protokoll zu beginnen, verdünnen Sie die lyophilisierten Primer in 1X TE Puffer auf eine endgültige Konzentration von 100 Mikromolar.
Aliquot eine gleiche Menge an Vorwärts- und Rückwärtsgrundierungen in PCR-Streifenkappenrohre. Wirbel zu mischen. Als nächstes drehen Sie die Guide-RNA-Oligonukleotid-Mischungen bei 100-fach G für 15 Sekunden herunter.
Inkubieren Sie die Reaktion bei Raumtemperatur für fünf Minuten, bevor Sie die Ligation einrichten. Fügen Sie mit 0,5 Mikroliter BSNB1 pro Mikrogramm Vektor zwischen einem und fünf Mikrogramm des ausgewählten PSB700-Führungsexpressionsvektors zu BSNB1 hinzu. Fügen Sie destilliertes Wasser hinzu, bis das Gesamtvolumen 40 Mikroliter beträgt und führen Sie die Verdauung für eine Stunde bei 55 Grad Celsius durch.
Führen Sie die Verdauungsprodukte auf einem 1,5% niedrig schmelzenden Agarosegel. Schneiden Sie das verdauliche Vektor-Backbone-Band aus, das einem Fragment von etwa 9 Kilobasen entspricht. Übertragen Sie diese Gelscheibe in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.
Extrahieren Sie mit einem kommerziellen Gel-Reinigungskit die DNA aus dem Agarose-Gel gemäß den Anweisungen des Herstellers. Verdünnen Sie dann die DNA in 10-15 Mikroliter TE-Puffer, um eine konzentrierte Elute zu erhalten. Wenn bereit, Ligation durchführen 15 Mikroliter destilliertes Wasser in eine Durchstechflasche hinzufügen.
Fügen Sie 1 Mikroliter der zuvor geglühten Guide-RNA-Oligonukleotide, einen Mikroliter des bSNB1 verdauten PSB700-Führungsexpressionsvektors und 2 Mikroliter 10XT4 DNA-Ligase-Reaktionspuffer hinzu. Dann mischen Sie diese Lösung durch Wirbel. Fügen Sie einen Mikroliter DNA-Ligase und Wirbel wieder hinzu.
Drehen Sie die Lösung 15 Sekunden lang bei 100-fachm G herunter. Inkubieren Sie die Reaktionen bei Raumtemperatur über Nacht und stellen Sie sicher, dass sie eine negative Kontrollreaktion ohne Insert enthalten, die einen BSNB1-verdauten Vektor allein ohne einen geglühten RNA-Oligot-Einsatz hat. Zunächst entfernen Sie E.coli bei minus 80 Grad Celsius aus der Lagerung und tauen Sie es 5 bis 10 Minuten auf Eis auf.
0,5 Mikroliter des vorbereiteten Reaktionsgemisches zu acht Mikrolitern kompetenter E.coli hinzufügen. Halten Sie die Mischung 30 Minuten auf Eis. Hitze-Schock die Mischung bei 42 Grad Celsius für 45 Sekunden.
Dann lassen Sie die Mischung für zwei Minuten auf Eis ruhen. Mit einem Dreh-Shaker, erholen Sie die Kultur in 250 Mikroliter SOC-Medien unter den hier aufgeführten Bedingungen für NEB DH5a oder NEB Stables. Danach Platte 80 Mikroliter der Kultur auf eine geeignete Antibiotikaresistenz Lysogeny Brühe Platte.
Über Nacht bei 37 Grad Celsius für NEB DH5a oder bei 30 Grad Celsius für NEB Stables. Verwenden Sie zunächst das spezielle PCR-Protokoll Von Phusion GC, um das benötigte Fragment zu erstellen, wie im Textprotokoll beschrieben. Führen Sie dieses PCR-Produkt auf einem 1%agarose Gel aus und stellen Sie sicher, dass ein Band bei ca. 490 Basenpaaren zu sehen ist.
Mit einem Gel-Extraktions-Kit schneiden und extrahieren Sie dieses PCR-Produkt. Dann aliquot eine vorbereitete 1X Master-Mix in PCR-Röhren. Mit einer Mehrkanalpipette, um einen Mikroliter des PCR-Produkts bei einer Konzentration von 40 Femtomolen pro Mikroliter hinzuzufügen.
In einem Mikroliter des PSB700 Vektors eine Konzentration von 40 Femtomolen pro Mikroliter hinzufügen. Schließen Sie eine No-Insert-Steuerung ein, indem Sie einen Mikroliter Wasser anstelle der Führungs-RNA-Oligonukleotide verwenden. Verdauen Sie den Vektor und ligaten Sie die Inserts in einer Reaktion mit dem Golden Gate-Protokoll, das im Textprotokoll beschrieben ist.
Nach der ersten Golden Gate-Reaktion fügen Sie jeder Reaktion weitere 0,5 Mikroliter des BSNB1-Enzyms hinzu. Setzen Sie die Reaktion bei 55 Grad Celsius für eine Stunde fort. Wenn die Golden Gate-Reaktion abgeschlossen ist, fahren Sie mit dem zuvor beschriebenen E.coli-Transformationsprozess fort.
In dieser Studie werden single guide RNA Expressionsvektoren erfolgreich mit zwei Methoden erstellt. Bei der ersten Methode wird das Vektor-Rückgrat vorverdaut und in einer Reihe von kurzen Oligonukleotiden ligiert. Die zweite Methode verwendete goldenes Torklonen, um gleichzeitig zu verdauen und in einer einzigen Reaktion zu ligaten.
Gepaarte Führungs-RNA-Exzessizipiierende Vektoren, die jeweils von einem eigenen unabhängigen Promotor angetrieben werden, werden erfolgreich durch Klonen eines benutzerdefinierten PCR-Fragments erstellt. Ein erfolgreiches Klonen für eine dieser Methoden führt dazu, dass im Vergleich zur Kontrollplatte ohne Einsatz deutlich mehr Kolonien für Transformationen mit der entsprechenden Insert-DNA entstehen. Beim Versuch dieses Verfahrens ist es wichtig, daran zu denken, keine Insert-Steuerelemente in den Klonschritt einzuschließen.
Nach diesem Verfahren können andere Methoden wie Epigenom-Engineering durchgeführt werden, um Fragen wie die Auswirkungen von Chromatin-Signaturen auf die Genexpression zu beantworten.
