Cette méthode permet la facilité de création de plasmides d’expression arn guide pour les expériences facilitées par CRISPR. Le principal avantage de cette technique est que le clonage peut être entrepris en une seule étape et que des ARN guides jumelés peuvent être créés à l’aide de plasmides à expression ARN à guide unique. Pour commencer ce protocole, diluer les amorces lyophilisées dans le tampon 1X TE à une concentration finale de 100 micromolaires.
Aliquot une quantité égale d’amorce avant et inverse dans les tubes de bouchon de bande PCR. Vortex à mélanger. Ensuite, faites tourner les mélanges d’oligonucléotide d’ARN guide à 100 fois G pendant 15 secondes.
Incuber la réaction à température ambiante pendant cinq minutes avant de mettre en place la ligature. Ajouter entre un et cinq microgrammes du vecteur d’expression du guide PSB700 sélectionné à BSNB1 à l’aide de 0,5 microlitres de BSNB1 par microgramme de vecteur. Ajouter l’eau distillée jusqu’à ce que le volume total soit de 40 microlitres et effectuer la digestion pendant une heure à 55 degrés Celsius.
Exécutez les produits de digestion sur un gel d’agarose fondant de 1,5 %. Découpez la bande dorsale vectorielle digérée qui correspond à un fragment d’environ 9 kilobases de taille. Transférer cette tranche de gel dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 millilitre.
À l’aide d’un kit commercial de purification du gel, extraire l’ADN du gel agarose selon les instructions du fabricant. Ensuite, diluer l’ADN en 10-15 microlitres de tampon TE pour obtenir un élitute concentré. Lorsque vous êtes prêt à effectuer la ligature ajouter 15 microlitres d’eau distillée à un flacon.
Ajouter 1 microlitre des oligonucléotides d’ARN précédemment annelés, un microlitre du vecteur d’expression de guide PSB700 digéré de BSNB1 et 2 microlitres du tampon de réaction de ligase d’ADN de 10XT4. Mélangez ensuite cette solution par vortex. Ajouter un microlitre de ligase d’ADN et vortex à nouveau.
Faites tourner la solution à 100 fois G pendant 15 secondes. Incuber les réactions à température ambiante pendant la nuit en s’assurant d’inclure une réaction de contrôle négative sans insert qui a un vecteur digéré BSNB1 seul sans un insert annealed guide ARN oligote. Pour commencer, retirez E.coli de l’entreposage à moins 80 degrés Celsius et décongelez-le sur la glace pendant 5 à 10 minutes.
Ajouter 0,5 microlitres du mélange de réaction préparé à huit microlitres d’E.coli compétent. Garder le mélange sur la glace pendant 30 minutes. Chauffer le mélange à 42 degrés Celsius pendant 45 secondes.
Ensuite, laisser reposer le mélange sur la glace pendant deux minutes. À l’aide d’un shaker rotatif, récupérez la culture de 250 microlitres de supports SOC en utilisant les conditions énumérées ici pour les écuries NEB DH5a ou NEB. Après cela, plaque 80 microlitres de la culture sur une plaque appropriée de bouillon de lysogeny de résistance aux antibiotiques.
Incuber toute la nuit à 37 degrés Celsius pour le DH5a de l’ONÉ ou à 30 degrés Celsius pour les écuries de l’ONÉ. Pour commencer, utilisez le protocole PCR spécial Phusion GC pour créer le fragment nécessaire tel qu’il est décrit dans le protocole texte. Exécutez ce produit PCR sur un gel agarose de 1 % et vérifiez qu’une bande est vue à environ 490 paires de base.
À l’aide d’un kit d’extraction de gel coupé et extraire ce produit PCR. Puis aliquot un mélange de maître 1X préparé dans des tubes PCR. Utilisation d’une pipette multicanal pour ajouter un microlitre du produit PCR à une concentration de 40 femtomoles par microlitre.
Dans un microlitre du vecteur PSB700 ajouter une concentration de 40 femtomoles par microlitre. Inclure un contrôle sans insertion en utilisant un microlitre d’eau au lieu des oligonucléotides d’ARN guide. Digérer le vecteur et ligate les inserts en une seule réaction en utilisant le protocole Golden Gate décrit dans le protocole de texte.
Après la réaction initiale de porte d’or ajouter un supplément de 0,5 microlitres de l’enzyme BSNB1 à chaque réaction. Continuez la réaction à 55 degrés Celsius pendant une heure. Lorsque la réaction de la porte d’or est terminée, procédez au processus de transformation d’E.coli décrit précédemment.
Dans cette étude, des vecteurs d’expression d’ARN guide unique sont créés avec succès à l’aide de deux méthodes. Dans la première méthode, l’épine dorsale vectorielle est pré-digérée et ligatée dans une série d’oligonucléotides courts. La deuxième méthode a employé le clonage d’or de barrière pour digérer et ligate simultanément dans une seule réaction.
L’ARN de guide jumelé exprimant des vecteurs, chacun conduit par son propre promoteur indépendant sont avec succès créés en clonageant un fragment pcr personnalisé. Le clonage réussi pour l’une ou l’autre de ces méthodes entraînera l’apparition de colonies beaucoup plus nombreuses pour les transformations avec l’ADN d’insert approprié par rapport à la plaque de contrôle sans insertion. Tout en essayant cette procédure, il est important de se rappeler d’inclure aucun contrôle d’insertion dans votre étape de clonage.
Après cette procédure, d’autres méthodes comme l’ingénierie épigénome peuvent être effectuées afin de répondre à des questions comme les effets des signatures de chromatine sur l’expression des gènes.
