Este método permite facilitar a criação de plasmídeos de expressão RNA guia para experimentos facilitados pelo CRISPR. A principal vantagem desta técnica é que a clonagem pode ser realizada em uma única etapa e rnAs guia emparelhadas podem ser criadas usando plasmídeos de expressão de RNA de guia único. Para iniciar este protocolo, diluir os primers liofilizados no buffer 1X TE para uma concentração final de 100 micromolar.
Alíquotar uma quantidade igual de primers dianteiros e invertidos em tubos de tampa de tira PCR. Vórtice para misturar. Em seguida, gire as misturas de oligonucleotídeos guia RNA a 100 vezes G durante 15 segundos.
Incubar a reação à temperatura ambiente por cinco minutos antes de configurar a ligadura. Adicione entre um e cinco microgramas do vetor de expressão de guia PSB700 selecionado ao BSNB1 utilizando 0,5 microliters de BSNB1 por um micrograma de vetor. Adicione água destilada até que o volume total seja de 40 microlitadores e conduza a digestão por uma hora a 55 graus Celsius.
Execute os produtos de digestão em um gel de agarose de fusão 1,5%. Corte a faixa de espinha dorsal vetorial digerida que corresponde a um fragmento de aproximadamente 9 quilobases de tamanho. Transfira esta fatia de gel para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Usando um kit comercial de purificação de gel, extraia o DNA do gel de agarose de acordo com as instruções do fabricante. Em seguida, diluir o DNA em 10-15 microliters de tampão de TE para obter um elute concentrado. Quando estiver pronto para realizar a ligadura adicione 15 microliters de água destilada a um frasco.
Adicione 1 microliter do guia anteriormente enlatado RNA oligonucleotídeos, um microliter do BSNB1 digestido observador de expressão de guia PSB700 e 2 microliters de 10XT4 DNA ligase tampão de reação. Em seguida, misture esta solução por vórtice. Adicione um microliter de ligase de DNA e vórtice novamente.
Gire a solução a 100 vezes G durante 15 segundos. Incubar as reações à temperatura ambiente durante a noite, certificando-se de incluir uma reação de controle negativo sem inserção que tenha um vetor digerido BSNB1 sozinho sem uma inserção de oligote guia rna. Para começar, remova e.coli do armazenamento a menos 80 graus Celsius e descongele-o no gelo por 5 a 10 minutos.
Adicione 0,5 microliters da mistura de reação preparada a oito microliters de E.coli competente. Mantenha a mistura no gelo por 30 minutos. Choque térmico da mistura a 42 graus Celsius por 45 segundos.
Em seguida, deixe a mistura descansar no gelo por dois minutos. Usando um agitador rotativo, recupere a cultura em 250 microliters de mídia SOC usando as condições listadas aqui para os estábulos NEB DH5a ou NEB. Depois disso, a placa 80 microliters da cultura em uma placa de caldo de resistência a antibióticos apropriada.
Incubar durante a noite a 37 graus Celsius para NEB DH5a ou a 30 graus Celsius para os estábulos NEB. Para começar, use o protocolo PCR especial Phusion GC para criar o fragmento necessário conforme descrito no protocolo de texto. Execute este produto PCR em um gel de 1%agarose e verifique se uma banda é vista em aproximadamente 490 pares de base.
Usando um kit de extração de gel cortar e extrair este produto PCR. Em seguida, aliquot uma mistura mestre 1X preparada em tubos PCR. Usando uma pipeta multicanal para adicionar um microliter do produto PCR a uma concentração de 40 femtomoles por microliter.
Em um microliter do vetor PSB700 adicione uma concentração de 40 femtomoles por microliter. Inclua um controle de não inserção usando um microliter de água em vez dos oligonucleotídeos guia RNA. Digerir o vetor e ligar as pastilhas em uma reação usando o protocolo Golden Gate descrito no protocolo de texto.
Após a reação inicial do portão dourado adicione um adicional de 0,5 microliters da enzima BSNB1 a cada reação. Continue a reação a 55 graus Celsius por uma hora. Quando a reação do golden gate estiver completa, proceda ao processo de transformação de E.coli descrito anteriormente.
Neste estudo, vetores de expressão de RNA de guia único são criados com sucesso usando dois métodos. No primeiro método, a espinha dorsal vetorial é pré-digerida e ligada em uma série de oligonucleotídeos curtos. O segundo método usou clonagem de golden gate para digerir simultaneamente e ligadurar em uma única reação.
Guia emparelhado RNA expressando vetores, cada um impulsionado por seu próprio promotor independente são criados com sucesso clonando um fragmento PCR personalizado. A clonagem bem sucedida para qualquer um desses métodos resultará no aparecimento de significativamente mais colônias para transformações com o DNA de inserção apropriado quando comparado com a placa de controle sem inserção. Ao tentar este procedimento é importante lembrar de não incluir controles de inserção na sua etapa de clonagem.
Após este procedimento, outros métodos como a engenharia epigenome podem ser realizados a fim de responder a perguntas como quais efeitos as assinaturas de cromatina têm na expressão genética.
