يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في المجال العصبي العضلي، مثل دور إشارات الكالسيوم في العضلات أو خلايا شوان استجابة لتحفيز الأعصاب. والميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أن المرء يمكن صورة تنشيط أنواع محددة من الخلايا استجابة لتحفيز الأعصاب. للبدء ، والحصول على الفئران المعدلة وراثيا ، وgenotype لهم كما هو مفصل في بروتوكول النص.
بعد القتل الرحيم، مقطع عبر عرضية عبر الحيوان بأكمله فقط تحت الكبد وفوق القلب والرئتين مع مقص استئصال الرحم. تشريح بعيدا الكبد والقلب والرئتين. الحرص على الحفاظ على طول العصب فيرينيك الذي هو طويل بما فيه الكفاية بحيث يتم رسمها في قطب شفط.
إزالة مزيد من القفص الصدري وعمود العمود الفقري، باستثناء التلال رقيقة حول الحجاب الحاجز. ضع الحجاب الحاجز وعينة العصب فيرينيك في أنبوب ميكروفوج مع محلول كريبس-رينغر الذي يحتوي على ميكروغرام واحد لكل ملليلتر من البونغاروكسيوم ألفا المسمى بالفلورسنت. السماح للعينة لاحتضان في المحل لمدة 10 دقائق في الظلام.
باستخدام دبابيس minutien شل الحجاب الحاجز عن طريق تثبيته على طبق ستة سنتيمترات المغلفة مع هلام السيليكون عازلة ومليئة ما يقرب من ثمانية ملليلتر من محلول كريبس رينغر المؤكسج. ضع الطبق على مرحلة المجهر. ثم، perfuse الحجاب الحاجز مع أكثر كريبس-رينغر الحل في ثمانية ملليلتر في الدقيقة لمدة 30 دقيقة.
في التكبير أربع مرات، وذلك باستخدام ميكرومانبولاتور، تحريك القطب الشفط على العصب الظاهري الأيسر. تطبيق الشفط عن طريق سحب برميل من حقنة خمسة ملليلتر متصلة الأنابيب التي تعلق على القطب الشفط. تأكد من أن الحجاب الحاجز عقود استجابة لتحفيز هرتز واحد عن طريق فحص بصريا مع إضاءة برايتفيلد.
إذا لم يكن كذلك، ضبط الجهد عن طريق تحويل مقبض الجهد تدريجيا لتحقيق نبض فوقماكسيمال الذي يمكن التحقق من خلال الفحص البصري لانكماش العضلات. إذا لم تكن مرئية حتى الآن، تفجير العصب مع حقنة ومحاولة لرسم مرة أخرى عن طريق تطبيق الشفط. الآن، إيقاف perfusion لإضافة مثبطات الميوسين الخاصة بالعضلات BHC أو الجهد بوابة قناة الصوديوم خصم مو كونotoxin.
إعداد BHC قبل التخفيف عن طريق الأنابيب أربعة microliters من 200 ملليمولار الأسهم BHC في DMSO في ملليلتر واحد من حل كريبس رينجر. إزالة ملليلتر واحد من حل كريبس-رينجر من الطبق. ثم يضاف BHC المخففة مسبقا إلى الطبق.
بعد 30 دقيقة، قم بتشغيل تسريب محلول كريبس-رينغر الطازج لمدة 20 إلى 30 دقيقة أخرى. ارتداء القفازات، وإعداد القطب تسجيل عن طريق وضع الزجاج خيوط البورسليكات مع القطر الخارجي من ملليمتر واحد وقطر داخلي من 0.4 ملليمتر في سحب ميكروبليت. تشديد بطلب لتضييق عليه في الموقف وإغلاق باب السحب.
ثم قم ببرمجة الـ puller كما هو موضح في بروتوكول النص. بالنسبة للزنايات الجنينية، قم بقياس المقاومة باستخدام عناصر تحكم البرامج في مكبر الصوت. تأكد من أن المقاومة بالقرب من 60 ميغاهات، وللفراجات القديمة، 10 إلى 20 ميغاهات.
الآن، قم بتحميل قطب التسجيل بثلاثة كلوريد بوتاسيوم مُولّر. في 10 مرات التكبير، وانخفاض القطب في العضلات باستخدام ميكرومانيبولاتور الثاني على الجانب الآخر من المرحلة ككترود محفز. استخدام القدرة على الحصول على البيانات الكهربائية البرمجيات الانتظار حتى غشاء يستريح التغييرات المحتملة من صفر إلى ناقص 65 ملليفولت أو أقل.
تحفيز في هرتز واحد والتحقق من وجود العضلات العمل المحتملة عن طريق التحقق من إمكانات كبيرة التي معارض تجاوز متواضعة. لا تخلط بين التحف التحفيز مع إمكانية العمل. في 20 مرات التكبير تحديد موقع الفرقة لوحة نهاية في وسط العضلات من خلال البحث عن الفلورسنت المسمى البونغاروكسيين تقاطعات العصبية العضلية تحت الإثارة الضوء الأصفر الأخضر.
التحول إلى الإثارة الضوء الأزرق لاستجابات الكالسيوم صورة في العضلات, الخلايا العصبية الحركية, أو خلايا Schwann. في هذا المثال يتم التعبير عن 3 GCaMP في خلايا العضلات. إذا رغبت في ذلك، قم بإعداد مقسم الصورة مع مرشحات تمرير النطاق وتصفية حافة واحدة dichroic للتصوير الطول الموجي المزدوج.
إجراء التجارب مع شريط السطوع على شريط الجدول بحث تعيين إلى 110٪ من المستوى الذي مؤشر الكالسيوم المشفرة وراثيا التعبير عن الأنسجة معارض التشبع في 20 مرة التكبير دون binning استجابة لكلوريد البوتاسيوم. سجل في 20 لقطة في الثانية الواحدة حتى لا تفوت أي أحداث سريعة. تحفيز مع 1-45 ثانية من 20 إلى 40 هيرتز من تحفيز الأعصاب عن طريق تقديم قطار من النبضات باستخدام قطب شفط وجمع استجابات الكالسيوم الفلورسنت الديناميكية في خلية واحدة فرعية مع الفلورسنت المسمى الفلورسنت ألفا bungarin إشارة الوصل العصبية العضلية.
ويمكن أيضا أن تضاف ناهضات الدوائية عن طريق تطبيق حمام أو عن طريق التسريب ويمكن جمع ردود الكالسيوم الفلورسنت دينامية في نفس الطريق. عندما يتم الانتهاء من التصوير أو التجارب الكهربائية الفيزيولوجية لأنه تم تحقيق النتائج المرجوة، ضخ المياه من خلال خطوط القذف وامتصاص الماء مرتين إلى ثلاث مرات من خلال قطب شفط لضمان أن الأملاح لا تتراكم. خريطة مكانية لاستجابات الكالسيوم خلية شوان لتحفيز العصب فينية WNT واحد GCaMP ثلاثة غشاء الماوس في ما بعد الولادة اليوم السابع تظهر قيدا على خلايا Schwann الطفيلية في تقاطع عصبي عضلي.
تم تصوير نفس الحجاب الحاجز بعد وضع العلامات مع تسمية الفلورسنت ألفا بونغاروكسيتين، الذي يربط لتمكين مستقبلات أستيل من تقاطع عصبي عضلي. كما تم تصوير نفس الحجاب الحاجز تحت إضاءة برايتفيلد لتوجيه قطب تسجيل إلى منطقة ما بعد الاشتباك العصبي في العضلات عن طريق التقاطع العصبي العضلي. يظهر هنا هو الترسيم المكاني للخلايا الملونة المبرمجة أو المناطق ذات الاهتمام التي اتخذت لتحليل عابري الكالسيوم الفردية.
خريطة مكانية من استجابات الكالسيوم الخلية العضلية من mth 5 GCaMP ثلاثة الحجاب الحاجز الماوس في P أربعة لتحفيز العصب في القرنية في وجود مثبطات myosin BHC يظهر استجابة في جميع أنحاء المنطقة بأكملها من جميع خلايا العضلات الحجاب الحاجز. في المقابل, تحفيز الحجاب الحاجز نفسه في وجود mu-conotoxin يسبب استجابة الكالسيوم المقيدة مكانيا في منطقة الوسيط لجميع خلايا العضلات الحجاب الحاجز الذي يتوافق مع مستقبلات الأستيل كولين مجموعة المخصب نهاية الفرقة. بعد هذا الإجراء يمكن تنفيذ طرق أخرى مثل الكيمياء المناعية أو المناعة من أجل الإجابة على أسئلة إضافية مثل، ما هو الملف الشخصي الجزيئي للخلايا التي تم تحديدها بواسطة الفيزيولوجيا الكهربائية أو تصوير الكالسيوم؟
يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة على استجابات سكانية من خلايا شوان والخلايا العضلية لتحفيز الأعصاب في الفئران الوليدية العادية. ويمكن أيضا أن تطبق على دراسة الفئران القديمة أو على دراسة الفئران التي تعبر عن الأمراض العصبية العضلية البروتينات المرتبطة.
