שיטה זו יכולה לעזור לענות על שאלות מפתח בתחום neuromuscular, כגון התפקיד של סידן איתות בשריר או תאי שוואן בתגובה לגירוי עצבי. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שניתן לדמיין את ההפעלה של סוגי תאים ספציפיים בתגובה לגירוי עצבי. כדי להתחיל, להשיג עכברים מהו מהודרים, ו genotype אותם כמפורט בפרוטוקול הטקסט.
בעקבות המתת חסד, חתך רוחבי על פני החיה כולה ממש מתחת לכבד וקצת מעל הלב והריאות עם מספריים iridectomy. לנתח את הכבד, הלב והריאות. הקפדה לשמור על אורך העצב הפוrenic כי הוא מספיק זמן כדי להיגרר לתוך אלקטרודה יניקה.
עוד להסיר את כלוב הצלעות ואת עמוד החוליות, למעט הרכס הדק סביב הסרעפת. מניחים את הסרעפת ואת דגימת העצב הפרני בצינור microfuge עם פתרון קרבס-רינגר המכיל מיקרוגרם אחד למיליליטר של פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin. אפשר את הדגימה דגירה בתסומה במשך 10 דקות בחושך.
באמצעות סיכות minutien לשתק את הסרעפת על ידי הצמדת אותו על צלחת שישה סנטימטר מצופה ג'ל דיאלקטרי סיליקון ומלא כשמונה מיליליטר של פתרון קרבס-רינגר מחומצן. מניחים את המנה על במת המיקרוסקופ. לאחר מכן, לבלבל את הסרעפת עם פתרון קרבס-רינגר יותר בשמונה מיליליטר לדקה במשך 30 דקות.
בהגדלה פי ארבעה, באמצעות מיקרומניפולטור, הזיזו את אלקטרודה היניקה מעל העצב הפרעוני השמאלי. החל את היניקה על ידי משיכת החבית של מזרק חמישה מיליליטר מחובר צינורות המחובר אל אלקטרודה היניקה. ודא כי הסרעפת מתכווצת בתגובה לגירוי הרץ אחד על ידי בדיקה ויזואלית זה עם תאורת ברייטפילד.
אם לא, להתאים את המתח על ידי הפיכת כפתור המתח בהדרגה כדי להשיג דופק על-טבעי אשר ניתן לאמת על ידי בדיקה חזותית של התכווצות שרירים. אם עדיין לא נראה, לפוצץ את העצב עם המזרק ולנסות למשוך אותו שוב על ידי החלת יניקה. עכשיו, לכבות את זלבול להוסיף את מעכבי מיוסין ספציפי לשריר BHC או מתח מגודר נתרן ערוץ אנטגוניסט mu-conotoxin.
הכן את BHC טרום דילול על ידי צינור ארבעה microliters של 200 מילימולאר מלאי BHC ב DMSO במיליליטר אחד של פתרון קרבס-רינגר. מוציאים מיליליטר אחד של תוסף קרבס-רינגר מהצלחת. לאחר מכן מוסיפים את BHC מדולל מראש לצלחת.
לאחר 30 דקות, להפעיל את תדלוק של פתרון קרבס-רינגר טרי עוד 20 עד 30 דקות. לובש כפפות, להכין את האלקטרודה הקלטה על ידי הנחת זכוכית חוטית borosilicate עם קוטר חיצוני של מילימטר אחד קוטר פנימי של 0.4 מילימטרים לתוך מושך micropipette. הדק את המחוגים כדי להדק אותו למקומו ולסגור את דלת המוציא.
לאחר מכן תכנת את המוציא כמתואר בפרוטוקול הטקסט. עבור דיאפרגמות עובריות, למדוד את ההתנגדות באמצעות פקדי תוכנה של המגבר. ודא שההתנגדות קרובה ל-60 מגה-הום ולסרעפות ישנות יותר, 10 עד 20 מגה-ם.
עכשיו, לטעון את האלקטרודה הקלטה עם שלושה אשלגן כלורי דיוח. בהגדלה פי 10, מנמיכים את האלקטרודה לשריר באמצעות מיקרומניפולטור שני בצד הנגדי של הבמה כאלקטרודה מגרה. שימוש בתוכנה לרכישת נתונים אלקטרופיזיולוגיים ממתין עד שהממברנה המנוחה משתנה מאפס למינוס 65 מילי-וולט ומטה.
לעורר בהרץ אחד ולאמת את נוכחותו של פוטנציאל פעולה שריר על ידי בדיקת פוטנציאל גדול המציג overshoot צנוע. אין לבלבל חפץ גירוי עם פוטנציאל פעולה. ב 20 פעמים הגדלה לאתר את רצועת צלחת הקצה במרכז השריר על ידי מחפש פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin צמתים neuromuscular תחת העירור אור צהוב ירוק.
עבור לגירוי אור כחול לתגובות סידן תמונה בשרירים, נוירון מוטורי, או תאים שוואן. בדוגמה זו GCaMP שלוש מתבטא בתאי שריר. אם תרצה, הגדר את מפצל התמונה עם מסנני מעבר פס ומסנן קצה יחיד דיכרואי להדמיית אורך הגל הכפול.
בצעו ניסויים עם סרגל הבהירות על סרגל טבלת בדיקת המידע שנקבע ל-110% מהרמה שבה מחוון הסידן המקודד גנטית מבטא רוויה ברקמות בהגדלה פי 20 מבלי לבלום בתגובה לאשלגן כלורי. הקליטו במהירות של 20 פריימים לשנייה כדי לא לפספס אירועים מהירים. לעורר עם אחד עד 45 שניות של 20 עד 40 הרץ של גירוי עצבי על ידי אספקת רכבת של דחפים באמצעות אלקטרודה יניקה ולאסוף תגובות סידן פלואורסצנטי דינמי בתת סוג תא אחד יחד עם סטטי פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin נוירומוסקולרי צומת אות.
אגוניסטים תרופתיים ניתן להוסיף גם על ידי יישום אמבטיה או על ידי חיסון ואת התגובות סידן פלואורסצנטי דינמי ניתן לאסוף באותו אופן. כאשר ההדמיה או הניסויים האלקטרופיזיולוגיים הסתיימו מכיוון שהתוצאות הרצויות הושגו, מזיפים מים דרך קווי הזיוף ומוצצים מים פעמיים עד שלוש פעמים דרך אלקטרודה היניקה כדי להבטיח שמלחים לא יצטברו. מפה מרחבית של תגובות סידן תא שוואן גירוי עצבי פרוני של Wnt אחד GCaMP שלושה דיאפרגמת עכבר ביום שלאחר הלידה שבע להראות הגבלה לתאי שוואן parasynaptic מסוף בצומת neuromuscular.
אותה דיאפרגמה תדמית לאחר תיוג עם פלואורסצנטי שכותרתו אלפא bungarotoxin, אשר קשרים כדי לאפשר קולטני אצטילכולין של צומת neuromuscular. אותה דיאפרגמה גם דימוי תחת תאורת ברייטפילד כדי להנחות אלקטרודה הקלטה לאזור הפוסט סינפטי של השריר על ידי צומת neuromuscular. מוצג כאן הוא תיחום מרחבי של תאים מקודדים בצבע או אזורים של עניין נלקח לניתוח של ארעי סידן בודדים.
המפה המרחבית של תגובות סידן תא שריר של mth 5 GCaMP שלוש דיאפרגמת העכבר ב P ארבע לגירוי עצבי פרוני בנוכחות מעכבי מיוסין BHC מראה תגובה בכל האזור של כל תאי השריר הסרעפת. לעומת זאת, גירוי של אותה דיאפרגמה בנוכחות מו-קונוטוקסין גורם לתגובת סידן מוגבלת מבחינה מרחבית באזור המדיאלי של כל תאי השריר של הסרעפת התואמת את רצועת צלחת הקצה המועשרת של קולטן האצטילכולין. בעקבות הליך זה ניתן לבצע שיטות אחרות כגון אימונו-היסטוכימיה או אימונובלוט על מנת לענות על שאלות נוספות כגון, מהו הפרופיל המולקולרי של תאים המזוהים על ידי אלקטרופיזיולוגיה או הדמיית סידן?
שיטה זו יכולה לספק תובנה על תגובות האוכלוסייה של תאי שוואן ותאי שריר לגירוי עצבי בעכברים יילודים נורמליים. זה יכול להיות מיושם גם על המחקר של עכברים מבוגרים או על המחקר של עכברים המבטאת מחלות נוירומוסקולריות הקשורות חלבונים.
