Bu yöntem nöromüsküler alanda anahtar sorulara cevap yardımcı olabilir, sinir stimülasyonu yanıt olarak kas veya Schwann hücrelerinde kalsiyum sinyalrolü gibi. Bu tekniğin en büyük avantajı, sinir stimülasyonuna yanıt olarak belirli hücre tiplerinin aktivasyonunu görüntülenebilmektir. Başlamak için, transgenik fareler edinin ve metin protokolünde ayrıntılı olarak genotipleyin.
Ötenaziden sonra, karaciğerin hemen altında tüm hayvan boyunca ve sadece kalp ve akciğer üzerinde iridektomi makas ile enine bölüm. Karaciğeri, kalbi ve akciğerleri parçalar. Bir emme elektrot içine çekilecek kadar uzun frenik sinir uzunluğunu korumak için dikkatli olmak.
Ayrıca diyafram çevresindeki ince sırt dışında, göğüs kafesi ve vertebral sütun kaldırın. Diyafram ve frenik sinir örneğini krebs-Ringer çözeltisi içeren bir mikrofuge tüpe yerleştirin ve floresan alfa bungarotoksin etiketli mililitre başına bir mikrogram alın. Numunenin karanlıkta 10 dakika boyunca çözeltide kuluçkaya yatmasını bekleyin.
Minutien pimleri kullanarak silikon dielektrik jel ile kaplı ve oksijenli Krebs-Ringer çözeltisi yaklaşık sekiz mililitre ile dolu altı santimetre çanak üzerine sabitleyerek diyafram immobilize. Yemeği mikroskop aşamasına yerleştirin. Daha sonra diyaframı dakikada sekiz mililitrede 30 dakika boyunca daha fazla Krebs-Ringer çözeltisi ile perfitlendirin.
Dört kat büyütme, bir mikromanipülatör kullanarak, sol frenik sinir üzerinde emme elektrot hareket ettirin. Emme elektrot bağlı boru bağlı beş mililitrelik şırınga varil çekerek emme uygulayın. Diyaframın brightfield aydınlatmaile görsel olarak inceleyerek hertz stimülasyonuna yanıt olarak kasılmasını sağlayın.
Aksi takdirde, kas kasılmasının görsel incelemesi ile doğrulanabilecek bir supramaximal darbe elde etmek için voltaj dizini kademeli olarak çevirerek voltajı ayarlayın. Hala görünmüyorsa, şırınga ile sinir dışarı darbe ve emme uygulayarak tekrar çizmek için deneyin. Şimdi, kas spesifik miyozin inhibitörü BHC veya voltaj kapılı sodyum kanal antagonisti mu-conotoxin eklemek için perfüzyon kapatın.
Krebs-Ringer çözeltisinin bir mililitresinde DMSO'da 200 milimolar stok BHC'nin dört mikrolitresini pipetleyerek BHC ön seyreltmesini hazırlayın. Bir mililitre Krebs-Ringer çözeltisini yemekten çıkarın. Sonra çanak önceden seyreltilmiş BHC ekleyin.
30 dakika sonra, taze Krebs-Ringer çözeltisinin perfüzyonunu 20 ila 30 dakika daha açın. Eldiven giyen, bir milimetre dış çapı ve bir micropipeette puller içine 0,4 milimetre iç çapı ile bir borosilikat filamented cam yerleştirerek kayıt elektrot hazırlamak. Tuşları sıkın ve onu konuma sıkıştırın ve çekmece kapağını kapatın.
Daha sonra çekmeceyi metin protokolünde açıklandığı şekilde programlayın. Embriyonik diyaframlar için amplifikatörün yazılım kontrollerini kullanarak direnci ölçün. Direnci n60 megaohms ve eski diyaframlar için, 10-20 megaohms yakın olduğundan emin olun.
Şimdi, kayıt elektrotuna üç azı potasyum klorür yükleyin. 10 kez büyütme, uyarıcı bir elektrot olarak sahnenin karşı tarafında ikinci bir mikromanipülatör kullanarak kas içine elektrot indirin. Elektrofizyolojik veri toplama yazılımını kullanarak istirahat membranı potansiyel sıfırdan eksi 65 milivolt veya altında değişene kadar bekleyin.
Bir hertz teşvik ve mütevazı bir overshoot sergileyen büyük bir potansiyel için kontrol ederek bir kas eylem potansiyelinin varlığını doğrulamak. Uyarım artifakı ile eylem potansiyelini karıştırmayın. 20 kez büyütme yeşil sarı ışık uyarma altında floresan alfa bungarotoksin nöromüsküler kavşaklar etiketlenmiş arayarak kas merkezinde son plaka bandı bulmak.
Kas, motor nöron veya Schwann hücrelerinde görüntü kalsiyum yanıtları için mavi ışık uyarma geçin. Bu örnekte GCaMP üç kas hücrelerinde ifade edilir. İstenirse, çift dalga boyu görüntüleme için bant geçiş filtreleri ve dikroik tek kenar filtresi ile görüntü ayırıcısını ayarlayın.
Potasyum klorüre yanıt vermeden dokuyu 20 kat büyütme de doygunluğu ifade eden genetik olarak kodlanmış kalsiyum göstergesinin %110 seviyesine ayarlanan arama tablosu çubuğundaki parlaklık çubuğu ile deneyler yapın. Hızlı etkinlikleri kaçırmamak için saniyede 20 kare lik kayıt kaydedin. Bir emme elektrot kullanarak impulsların bir tren teslim ederek sinir stimülasyonu 20 ila 40 hertz bir ila 45 saniye ile teşvik ve statik floresan alfa bungarotoxin nöromüsküler kavşak sinyali etiketli ile birlikte bir hücre alt türünde dinamik floresan kalsiyum yanıtları toplamak.
Farmakolojik agonistler de banyo uygulaması veya perfüzyon ile eklenebilir ve dinamik floresan kalsiyum yanıtları aynı şekilde toplanabilir. İstenilen sonuçlar elde edildiği için görüntüleme veya elektrofizyolojik deneyler tamamlandığında, perfüzyon hatları na su geçirin ve tuzların birikmemesi için emme elektrotu ile suyu 2-3 kez emerek emerek. Doğum sonrası yedinci doğum gününde Wnt bir GCaMP üç fare diyafram frenik sinir stimülasyonu Schwann hücre kalsiyum yanıtları bir mekansal harita nöromüsküler kavşakta terminal parasinaptik Schwann hücreleri için bir kısıtlama göstermektedir.
Aynı diyafram floresan alfa bungarotoksin etiketli sonra görüntülendi, hangi bağlar nöromüsküler kavşak asetilkolin reseptörlerini etkinleştirmek için. Aynı diyafram da Brightfield aydınlatma altında nöromüsküler kavşak tarafından kas post-sinaptik bölgeye bir kayıt elektrot rehberlik etmek için görüntülendi. Burada gösterilen renk kodlu hücrelerin mekansal çizim veya bireysel kalsiyum geçici analizi için alınan ilgi bölgeleri.
Bir mth kas hücresi kalsiyum yanıtları mekansal harita 5 GCaMP p dört de möyürin inhibitörü BHC varlığında frenik sinir stimülasyonu için tüm diyafram kas hücrelerinin tüm bölgede bir yanıt gösterir. Buna karşılık, mu-conotoxin varlığında aynı diyafram stimülasyonu asetilkolin reseptör kümesi zenginleştirilmiş uç plaka bandına karşılık gelen tüm diyafram kas hücrelerinin medial bölgede mekansal olarak sınırlı kalsiyum yanıtı neden olur. Bu işlemin ardından immüno-histokimya veya immünoblotlama gibi ek sorulara cevap vermek için başka yöntemler de yapılabilir, elektrofizyoloji veya kalsiyum görüntüleme ile tanımlanan hücrelerin moleküler profili nedir?
Bu yöntem, schwann hücrelerinin ve kas hücrelerinin normal neonatal farelerde sinir stimülasyonuna popülasyon yanıtları hakkında bilgi sağlayabilir. Ayrıca yaşlı farelerin çalışmasına veya nöromüsküler hastalık ilişkili proteinleri ifade farelerin çalışma için uygulanabilir.
