Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine neuromusculaire, comme le rôle de la signalisation du calcium dans les cellules musculaires ou schwann en réponse à la stimulation nerveuse. Le principal avantage de cette technique est que l’on peut l’image de l’activation de types de cellules spécifiques en réponse à la stimulation nerveuse. Pour commencer, obtenir des souris transgéniques, et génotypez-les comme détaillé dans le protocole de texte.
Après l’euthanasie, section transversale à travers l’animal entier juste en dessous du foie et juste au-dessus du cœur et des poumons avec des ciseaux iridectomy. Disséquez le foie, le cœur et les poumons. Prendre soin de maintenir une longueur du nerf phrénique suffisamment longue pour être aspirée dans une électrode d’aspiration.
Retirez davantage la cage thoracique et la colonne vertébrale, à l’exception de la mince crête autour du diaphragme. Placez le diaphragme et l’échantillon de nerf phrénique dans un tube de microfuge avec la solution Krebs-Ringer contenant un microgramme par millilitre d’alpha bungarotoxin étiqueté fluorescent. Laissez le spécimen couver dans la solution pendant 10 minutes dans l’obscurité.
À l’aide d’épingles minutien immobiliser le diaphragme en l’épinglant sur un plat de six centimètres recouvert de gel diélectrique en silicone et rempli d’environ huit millilitres de solution Krebs-Ringer oxygénée. Placez le plat au microscope. Ensuite, perfusez le diaphragme avec plus de solution Krebs-Ringer à huit millilitres par minute pendant 30 minutes.
À quatre reprises grossissement, à l’aide d’un micromanipulateur, déplacer l’électrode d’aspiration sur le nerf phrénique gauche. Appliquez l’aspiration en retirant le canon d’une seringue de cinq millilitres reliée au tube qui est fixé à l’électrode d’aspiration. Assurez-vous que le diaphragme se contracte en réponse à la stimulation hertzienne en l’examinant visuellement avec l’éclairage Brightfield.
Sinon, ajustez la tension en tournant le bouton de tension progressivement pour obtenir une impulsion supramaximale qui peut être vérifiée par l’examen visuel de la contraction musculaire. S’il n’est toujours pas visible, soufflez le nerf avec la seringue et essayez de la tirer à nouveau en appliquant l’aspiration. Maintenant, éteignez la perfusion pour ajouter l’inhibiteur de la myosine spécifique au muscle BHC ou l’antagoniste du canal de sodium fermé par tension mu-conotoxin.
Préparer la pré-dilution du BHC en pipetant quatre microlitres de 200 millimolaires de stock BHC dans DMSO en un millilitre de solution Krebs-Ringer. Retirer un millilitre de la solution Krebs-Ringer du plat. Ajouter ensuite le BHC pré-dilué au plat.
Après 30 minutes, allumer la perfusion de la solution Krebs-Ringer fraîche pendant encore 20 à 30 minutes. En portant des gants, préparez l’électrode d’enregistrement en plaçant un verre filamenté borosilicate d’un diamètre extérieur d’un millimètre et d’un diamètre intérieur de 0,4 millimètre dans un pull de micropipette. Serrez les cadrans pour le serrer en position et fermez la porte du tiroir.
Programmez ensuite le puller tel que décrit dans le protocole texte. Pour les diaphragmes embryonnaires, mesurez la résistance à l’aide des commandes logicielles de l’amplificateur. Assurez-vous que la résistance est proche de 60 mégaohms et pour les diaphragmes plus anciens, 10 à 20 mégaohms.
Maintenant, chargez l’électrode d’enregistrement avec trois chlorure de potassium molaire. À 10 fois le grossissement, abaissez l’électrode dans le muscle à l’aide d’un deuxième micromanipulateur de l’autre côté de la scène comme électrode stimulante. À l’aide d’un logiciel d’acquisition de données électrophysiologiques, attendez que le potentiel de la membrane de repos passe de zéro à moins 65 millivolts ou moins.
Stimulez à un hertz et vérifiez la présence d’un potentiel d’action musculaire en vérifiant un grand potentiel qui présente un dépassement modeste. Ne confondez pas l’artefact de stimulation avec un potentiel d’action. À 20 fois le grossissement localiser la bande de plaque d’extrémité au centre du muscle en recherchant fluorescente étiquette alpha bungarotoxin jonctions neuromusculaires sous excitation lumière jaune vert.
Passez à l’excitation de la lumière bleue pour l’image des réponses de calcium dans les cellules musculaires, motoneuriques ou schwann. Dans cet exemple GCaMP trois est exprimé dans les cellules musculaires. Si vous le souhaitez, configurez le séparateur d’image avec des filtres de passage de bande et un filtre dichroïque à bord unique pour l’imagerie à double longueur d’onde.
Effectuez des expériences avec la barre de luminosité sur la barre de table de recherche fixée à 110% du niveau auquel l’indicateur de calcium génétiquement codé exprimant les tissus présente une saturation à 20 fois le grossissement sans binning en réponse au chlorure de potassium. Enregistrez à 20 images par seconde afin de ne pas manquer d’événements rapides. Stimulez avec un à 45 secondes de 20 à 40 hertz de stimulation nerveuse en livrant un train d’impulsions à l’aide d’une électrode d’aspiration et de recueillir des réponses dynamiques de calcium fluorescent dans un sous-type cellulaire avec le statique fluorescent étiqueté alpha bungarotoxin signal de jonction neuromusculaire.
Les agonistes pharmacologiques peuvent également être ajoutés par application de bain ou par perfusion et les réponses fluorescentes dynamiques de calcium peuvent être rassemblées de la même manière. Lorsque les expériences d’imagerie ou d’électrophysiologie sont terminées parce que les résultats souhaités ont été atteints, perfuser l’eau à travers les lignes de perfusion et sucer l’eau deux à trois fois à travers l’électrode d’aspiration pour s’assurer que les sels ne s’accumulent pas. Une carte spatiale des réponses de calcium de cellules de Schwann à la stimulation phrénique de nerf d’un Wnt un GCaMP trois diaphragme de souris au septième jour post natal montrent une restriction aux cellules synaptiques terminales de Schwann à la jonction neuromusculaire.
Le même diaphragme a été photographié après étiquetage avec bungarotoxin alpha fluorescentement étiqueté, qui se lie pour permettre aux récepteurs d’acétylcholine de la jonction neuromusculaire. Le même diaphragme a également été photographié sous l’illumination de Brightfield pour guider une électrode d’enregistrement à la région post-synaptique du muscle par la jonction neuromusculaire. Il est indiqué ici la démarcation spatiale des cellules codées en couleur ou des régions d’intérêt prises pour l’analyse des transitoires individuels de calcium.
La carte spatiale des réponses de calcium de cellules musculaires d’un mth 5 GCaMP trois diaphragme de souris à P quatre à la stimulation phrénique de nerf en présence de l’inhibiteur de myosin BHC montre une réponse dans toute la région de toutes les cellules musculaires de diaphragme. En revanche, la stimulation du même diaphragme en présence de mu-conotoxine provoque une réponse de calcium spatialement restreinte dans la région médiale de toutes les cellules musculaires du diaphragme qui correspond à la bande de plaque d’extrémité enrichie par cluster récepteur d’acétylcholine. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes comme l’immuno histochimie ou l’immunoblotting peuvent être réalisées afin de répondre à d’autres questions telles que le profil moléculaire des cellules identifiées par électrophysiologie ou imagerie calcique?
Cette méthode peut fournir un aperçu des réponses de la population des cellules de Schwann et des cellules musculaires à la stimulation nerveuse chez les souris néonatales normales. Il peut également être appliqué à l’étude de souris plus âgées ou à l’étude de souris exprimant des protéines associées aux maladies neuromusculaires.
