この方法は、神経刺激に応答して筋肉やシュワン細胞におけるカルシウムシグナル伝達の役割など、神経筋分野の重要な質問に答えることができます。この技術の主な利点は、神経刺激に応答して特定の細胞タイプの活性化を画像化できることである。まず、トランスジェニックマウスを取得し、テキストプロトコルで詳述されているように遺伝子型化する。
安楽死後、肝臓のすぐ下の動物全体を横切り、虹色の16>はさみで心臓と肺のすぐ上に横断的に横断する。肝臓、心臓、肺を解剖する。吸引電極に引き込まれるのに十分な長さの筋神経の長さを維持するように注意すること。
さらに、横隔膜の周りの薄い隆起を除いて、リブケージと椎骨柱を取り除きます。ダイヤフラムとフレニック神経サンプルを、蛍光標識されたアルファブンガロトキシンのミリリットル当たり1マイクログラムを含むクレブスリンガー溶液を含むマイクロフュージチューブに入れる。試料を溶液中で10分間暗い中でインキュベートさせます。
minutienピンを使用して、シリコーン誘電ゲルでコーティングされた6センチメートルの皿に固定し、約8ミリリットルの酸素化クレブスリンガー溶液で満たしてダイヤフラムを固定化します。皿を顕微鏡のステージに置きます。その後、隔膜に対して、1分間に8ミリリットルでより多くのクレブスリンガー溶液を30分間浸透させます。
4倍の倍率で、マイクロマニピュレーターを用いて、吸引電極を左のレニック神経上に移動させる。吸引電極に取り付けられた管に接続された5ミリリットルのシリンジのバレルを引き出すことによって吸引を適用します。ブライトフィールド照明で視覚的に調べることにより、1ヘルツ刺激に応答してダイヤフラムが収縮することを確認します。
もしそうでなければ、電圧ノブを段階的に回して、筋肉収縮の目視検査で検証できる上限パルスを得るように電圧を調整します。まだ目に見えない場合は、注射器で神経を吹き飛ばし、吸引を適用して再び引き込もうとします。今度は、筋肉特異的ミオシン阻害剤BHCまたは電圧ゲートナトリウムチャネルアンタゴニストのムコノトキシンを加えるために、灌流をオフにします。
1 ミリリットルのクレブスリンガー溶液で DMSO で 200 ミリモルストック BHC の 4 マイクロリットルをピペット処理して BHC プレ希釈を準備します。皿からクレブスリンガー溶液の1ミリリットルを取り除きます。その後、あらかじめ希釈したBHCを皿に加えます。
30分後、新鮮なクレブスリンガー溶液の灌流をさらに20〜30分間オンにします。手袋を着用し、直径1ミリメートル、内径0.4ミリメートルのホウケイ酸フィラメントガラスをマイクロピペットプーラーに配置して記録電極を準備します。ダイヤルを締めて位置にクランプし、引き手のドアを閉めます。
次に、テキスト プロトコルで説明されているように、プーラーをプログラムします。胚性ダイアフラムの場合、アンプのソフトウェア制御を使用して抵抗を測定します。抵抗が60メガオーム近くにあり、古いダイアフラムの場合は10〜20メガオームであることを確認してください。
次に、3つの塩化カリウムモルを記録電極に積み込みます。10倍倍の倍率で、刺激電極としてステージの反対側にある第2のマイクロマニピュレータを用いて電極を筋肉に下げる。電気生理学的データ取得ソフトウェアを使用すると、静止膜電位がゼロからマイナス65ミリボルト以下に変化するまで待ちます。
1つのヘルツで刺激し、控えめなオーバーシュートを示す大きな可能性をチェックすることによって、筋肉の作用の可能性の存在を確認します。刺激アーティファクトとアクションポテンシャルを混同しないでください。20倍の倍率で、緑色の黄色の光励起の下で蛍光標識されたアルファブンガロトキシン神経筋接合部を探すことによって、筋肉の中心にエンドプレートバンドを見つける。
筋肉、運動ニューロン、またはシュワン細胞のカルシウム応答を画像に青色光励起に切り替えます。この例では、GCaMP 3は筋細胞で発現している。必要に応じて、バンドパスフィルタと二重波長イメージング用の二色性シングルエッジフィルタを使用してイメージスプリッタを設定します。
ルックアップテーブルバーの明るさバーを使用して実験を行い、遺伝子組み換えカルシウム指標表を発現する組織が塩化カリウムに反応してビニングをせずに20倍の倍率で飽和を示すレベルの110%に設定します。速いイベントを見逃さないように、毎秒20フレームで記録してください。吸引電極を使用してインパルスの列車を送達することにより、20〜40ヘルツの神経刺激の1〜45秒で刺激し、静的蛍光標識されたアルファブンガロトキシン神経筋接合信号と一緒に1つの細胞サブタイプで動的蛍光カルシウム応答を収集します。
薬理学的アゴニストは、浴用途または灌流によって添加することもできるし、動的蛍光カルシウム応答も同様に収集することができる。望ましい結果が得られたために画像化または電気生理学的実験が終わったら、灌流ラインを通して水を浸透させ、吸引電極を通して水を2〜3回吸い込み、塩が蓄積しないようにします。出生後7日目のWnt 1 GCaMP 3匹のマウス横隔膜の腎神経刺激に対するシュワン細胞カルシウム応答の空間地図は、神経筋接合部における末端パラシナプスシュワン細胞への制限を示す。
同じダイヤフラムを、蛍光標識されたαバンガロトキシンで標識した後に、神経筋接合のアセチルコリン受容体を有効に結合した。同じダイヤフラムもブライトフィールド照明の下で画像化され、神経筋接合部によって筋肉のシナプス後領域に記録電極を導いた。ここに示されているのは、個々のカルシウム過渡性の分析のために取られた色分けされた細胞または関心のある領域の空間的な境界である。
mth 5 GCaMPの3つのマウスダイヤフラムの筋肉細胞カルシウム応答の空間地図は、ミオシン阻害剤BHCの存在下でのP4の3つのマウス横隔膜のマウスの横隔膜刺激を、全横隔膜筋細胞の全領域全体に応答を示す。対照的に、mu-conotoxinの存在下で同じダイヤフラムの刺激は、アセチルコリン受容体クラスター濃縮エンドプレートバンドに対応するすべての横隔膜筋細胞の内側領域における空間的に制限されたカルシウム応答を引き起こす。この手順に従って、免疫体化学や免疫ブロット法のような他の方法は、エレクトロ生理学やカルシウムイメージングによって同定された細胞の分子プロファイルは何であるかなどの追加の質問に答えるために行うことができますか?
この方法は、正常な新生児マウスにおける神経刺激に対するシュワン細胞および筋肉細胞の集団応答に関する洞察を提供することができる。また、古いマウスの研究や、神経筋疾患関連タンパク質を発現するマウスの研究にも適用できる。
