이 방법은 신경 자극에 응하여 근육 또는 슈완 세포에서 칼슘 신호의 역할과 같은 신경 근육 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 신경 자극에 반응하여 특정 세포 유형의 활성화를 이미지화 할 수 있다는 것입니다. 시작하려면, 형질 전환 마우스를 얻고, 텍스트 프로토콜에 상세한 대로 유전자형을 얻을.
안락사 에 따라, 횡방향 간 바로 아래와 iridectomy 가위와 심장과 폐 바로 위에 전체 동물을 가로 질러 섹션. 간, 심장 및 폐를 해부합니다. 흡입 전극에 끌릴 만큼 충분히 긴 프린닉 신경의 길이를 유지하기 위해 주의.
다이어프램 주위의 얇은 능선을 제외하고, 흉곽과 척추 컬럼을 추가로 제거합니다. 형광으로 표지된 알파 분가로톡신의 밀리리터 당 1마이크로그램을 함유한 크렙스 링거 용액을 함유한 미세분리관에 다이어프램과 프린소 신경 샘플을 배치합니다. 표본이 어둠 속에서 10 분 동안 용액에 인큐베이션되도록 하십시오.
미누티엔 핀을 사용하여 실리콘 유전체 젤로 코팅하고 산소가 공급된 크렙스 링거 용액약 약 8밀리리터로 채워진 6센티미터 접시에 고정하여 다이어프램을 고정합니다. 현미경 단계에 접시를 놓습니다. 그런 다음 분당 8 밀리리터에서 30분 동안 더 많은 크렙스 링거 용액으로 다이어프램을 견딜 수 있습니다.
4배 배율에서, 마이크로 조작기를 사용하여, 좌측 프렌닉 신경 위로 흡입 전극을 이동합니다. 흡입 전극에 부착된 튜브에 연결된 5밀리리터 주사기의 배럴을 꺼내 흡입을 적용합니다. 다이어프램이 브라이트필드 조명으로 시각적으로 검사하여 헤르츠 자극에 대응하여 수축되는지 확인합니다.
그렇지 않은 경우, 전압 노브를 점진적으로 돌려 근육을 수축하는 육안 검사에 의해 확인할 수 있는 초막펄스를 달성하여 전압을 조절한다. 여전히 보이지 않는 경우 주사기로 신경을 날려 흡입을 적용하여 다시 그릴 수 있습니다. 지금, 근육 특이적 미오신 억제제 BHC 또는 전압 게이트 나트륨 채널 길항제 mu-conotoxin를 추가하기 위해 관혈을 끕니다.
크렙스 링거 솔루션의 1밀리리터에 DMSO에 200 밀리머 스톡 BHC의 4개의 마이크로리터를 배관하여 BHC 사전 희석을 준비하십시오. 접시에서 크렙스 링거 용액 1밀리리터를 제거합니다. 그런 다음 미리 희석 된 BHC를 접시에 추가합니다.
30분 후, 신선한 크렙스 링거 용액의 관류를 20~30분 간 돌립니다. 장갑을 착용하고, 1밀리미터의 외지와 0.4밀리미터의 내지름을 마이크로피펫 풀러에 배치하여 기록 전극을 준비합니다. 다이얼을 조여 제자리에 고정하고 풀러 도어를 닫습니다.
그런 다음 텍스트 프로토콜에 설명된 대로 풀러를 프로그래밍합니다. 배아 다이어프램의 경우 앰프의 소프트웨어 제어를 사용하여 저항을 측정합니다. 저항이 60 메가옴에 가깝고 오래된 다이어프램, 10~ 20메가옴에 가깝습니다.
이제 기록 전극을 3개의 어금니 칼륨염으로 적재합니다. 10배 배율에서, 자극전극으로 무대 반대편에 있는 두 번째 미세 조작기를 사용하여 전극을 근육으로 낮추어보라고 한다. 전기 생리학적 데이터 수집 소프트웨어를 사용하면 휴게멤브레인이 0에서 영하 65밀리볼트 이하로 변경될 때까지 기다립니다.
한 hertz에서 자극 하 고 겸손 한 오버 슈트를 전시 하는 큰 잠재력을 확인 하 여 근육 행동 잠재력의 존재를 확인. 자극 아티팩트를 작업 잠재력과 혼동하지 마십시오. 20배 배율은 녹색 노란 빛 여기 아래 형광표 알파 분가로톡신 신경근육 접합을 찾아 근육의 중심에 엔드 플레이트 밴드를 찾습니다.
근육, 운동 신경 또는 슈완 세포에서 칼슘 반응을 이미지하기 위해 청색 광 여기로 전환하십시오. 이 예에서 GCaMP 3근육 세포에서 발현된다. 원하는 경우, 밴드 패스 필터와 이중 파장 이미징을 위한 디크로이크 단일 가장자리 필터로 이미지 스플리터를 설정합니다.
슈타튬 염화물에 반응하여 비닝하지 않고 조직을 표현하는 유전적으로 인코딩된 칼슘 표시기가 20배 배율로 포화를 나타내는 레벨의 110%로 설정된 조회 테이블 바의 밝기 막대로 실험을 수행합니다. 빠른 이벤트를 놓치지 않도록 초당 20 프레임으로 기록하십시오. 흡입 전극을 사용하여 충동의 기차를 제공함으로써 신경 자극의 20 에서 40 헤르츠의 1 ~ 45 초로 자극하고 정적 형광표시 알파 bungarotoxin 신경 근육 접합 신호와 함께 한 세포 하위 유형에서 동적 형광 칼슘 반응을 수집합니다.
약리학 작용제는 또한 목욕 응용 프로그램에 의해 또는 관류에 의해 추가될 수 있고 동적 형광 칼슘 반응은 같은 방법으로 수집될 수 있습니다. 화상 진찰 또는 전기 생리학적 실험이 완료되면 원하는 결과가 달성되었기 때문에, 관류 선을 통해 물을 퍼퓨아서 흡입 전극을 통해 2~3회 물을 빨아 소금이 쌓이지 않도록 한다. 7일 산후일에 Wnt 1 GCaMP 3개의 마우스 횡격막의 프렌트 신경 자극에 대한 슈완 세포 칼슘 반응의 공간지도는 신경근육 접합부에서 말단 파라시냅틱 슈반 세포에 대한 제한을 나타낸다.
같은 다이어프램은 형광으로 표지된 알파 분가로톡신으로 라벨을 붙인 후 이미지화되었으며, 이는 신경 근육 접합의 아세틸콜린 수용체를 가능하게 하는 결속을 결합합니다. 동일한 다이어프램은 또한 신경 근육 접합에 의해 근육의 시냅스 후 부위에 기록 전극을 안내하기 위해 브라이트 필드 조명 에서 이미지되었다. 여기에 개별 칼슘 과도의 분석을 위해 취한 색 코딩 된 세포 또는 관심 영역의 공간 경계가 있습니다.
mth 5 GCaMP3 마우스 다이어프램의 근육 세포 칼슘 반응의 공간 맵은 모신 억제제 BHC의 존재에서 프렌닉 신경 자극에 모든 다이어프램 근육 세포의 전체 영역에 걸쳐 응답을 나타낸다. 대조적으로, 무코노톡신이 존재하여 동일한 다이어프램의 자극은 아세틸콜린 수용체 클러스터농축 단판 대역에 대응하는 모든 다이어프램 근육 세포의 내측 영역에서 공간적으로 제한된 칼슘 반응을 일으킨다. 이 절차에 따라 면역-히스토케또는 면역블로팅과 같은 다른 방법은 전기생리학 또는 칼슘 이미징에 의해 확인된 세포의 분자 프로파일과 같은 추가 질문에 답하기 위해 수행될 수 있습니까?
이 방법은 일반적인 신생아 마우스에 있는 신경 자극에 Schwann 세포 및 근육 세포의 인구 반응에 통찰력을 제공할 수 있습니다. 그것은 또한 더 오래 된 쥐의 연구 또는 신경 근육 질환 관련 된 단백질을 표현 하는 쥐의 연구에 적용할 수 있습니다.
