Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo neuromuscolare, come il ruolo della segnalazione del calcio nei muscoli o nelle cellule di Schwann in risposta alla stimolazione nervosa. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si può immaginare l'attivazione di specifici tipi di cellule in risposta alla stimolazione nervosa. Per iniziare, ottenere topi transgenici e genotipi come descritto nel protocollo di testo.
Dopo l'eutanasia, si seziona trasversalmente l'intero animale appena sotto il fegato e appena sopra il cuore e i polmoni con forbici per l'iridectomia. Sezionare il fegato, il cuore e i polmoni. Fare attenzione a mantenere una lunghezza del nervo phrenic sufficientemente lunga da essere attratta in un elettrodo di aspirazione.
Rimuovere ulteriormente la gabbia toracica e la colonna vertebrale, ad eccezione della sottile cresta attorno al diaframma. Posizionare il diaframma e il campione di nervo phrenico in un tubo di microfugo con soluzione di Krebs-Ringer contenente un microgrammo per millilitro di bungarotossine alfa etichettate fluorescentmente. Lasciare incubare il campione nella soluzione per 10 minuti al buio.
L'uso di perni di minuzia immobilizza il diaframma fissarlo su un piatto di sei centimetri rivestito con gel dielettrico in silicone e riempito con circa otto millilitri di soluzione Krebs-Ringer ossigenata. Posizionare il piatto sul palco del microscopio. Quindi, perfondi il diaframma con più soluzione Krebs-Ringer a otto millilitri al minuto per 30 minuti.
A quattro volte l'ingrandimento, usando un micromanipolatore, spostare l'elettrodo di aspirazione sul nervo phrenico sinistro. Applicare l'aspirazione estraendo la canna di una siringa da cinque millilitri collegata al tubo collegato all'elettrodo di aspirazione. Assicurarsi che il diaframma si contrae in risposta alla stimolazione di un hertz esaminandolo visivamente con l'illuminazione Brightfield.
In caso meno, regolare la tensione ruotando la manopola di tensione in modo incrementale per ottenere un impulso supramaximale che può essere verificato mediante esame visivo della contrazione muscolare. Se ancora non visibile, soffiare il nervo con la siringa e tentare di disegnarlo di nuovo applicando l'aspirazione. Ora, spegnere la perfusione per aggiungere l'inibitore della miosina specifico del muscolo BHC o la mu-conotossina antagonista del canale del sodio gated di tensione.
Preparare la pre-diluizione BHC pipettando quattro microlitri di BHC da 200 millimolari in DMSO in un millilitro di soluzione Krebs-Ringer. Rimuovere un millilitro della soluzione Krebs-Ringer dal piatto. Quindi aggiungere il BHC pre-diluito al piatto.
Dopo 30 minuti, accendere la perfusione della fresca soluzione Krebs-Ringer per altri 20-30 minuti. Indossando guanti, preparare l'elettrodo di registrazione posizionando un vetro filamentoso borosilicato con un diametro esterno di un millimetro e un diametro interno di 0,4 millimetri in un estrattore di micropipette. Stringere i quadranti per bloccarlo in posizione e chiudere la porta dell'estrattore.
Quindi programmare l'estrattore come descritto nel protocollo di testo. Per i diaframmi embrionali, misurare la resistenza utilizzando i controlli software dell'amplificatore. Assicurarsi che la resistenza sia vicina a 60 megaohm e per i diaframmi più vecchi, da 10 a 20 megaohm.
Ora, caricare l'elettrodo di registrazione con tre cloruri molari di potassio. A 10 volte l'ingrandimento, abbassare l'elettrodo nel muscolo usando un secondo micromanipolatore sul lato opposto dello stadio come elettrodo stimolante. Utilizzando il software di acquisizione dati elettrofisiologici attendere che il potenziale della membrana a riposo cambi da zero a meno 65 millivolt o inferiori.
Stimolare in un unico hertz e verificare la presenza di un potenziale di azione muscolare controllando un grande potenziale che mostra un modesto superamento. Non confondere l'artefatto di stimolazione con un potenziale d'azione. A 20 volte l'ingrandimento individua la banda della piastra finale al centro del muscolo cercando giunzioni neuromuscolari alfa bungarotossine etichettate fluorescentmente sotto eccitazione a luce gialla verde.
Passare all'eccitazione della luce blu per immaginire le risposte di calcio nelle cellule muscolari, motoneuroni o Schwann. In questo esempio GCaMP tre è espresso nelle cellule muscolari. Se lo si desidera, impostare lo splitter dell'immagine con filtri passa banda e un filtro dicroico a bordo singolo per l'imaging a doppia lunghezza d'onda.
Eseguire esperimenti con la barra di luminosità sulla barra della tabella di ricerca impostata sul 110% del livello al quale l'indicatore di calcio codificato geneticamente che esprime il tessuto mostra saturazione a 20 volte l'ingrandimento senza binning in risposta al cloruro di potassio. Registra a 20 fotogrammi al secondo in modo da non perdere eventi veloci. Stimolare con uno o 45 secondi da 20 a 40 hertz di stimolazione nervosa fornendo un treno di impulsi utilizzando un elettrodo di aspirazione e raccogliere risposte dinamiche di calcio fluorescente in un sottotipo cellulare insieme al segnale di giunzione neuromuscolare alfa bungarotoxina fluorescente statico.
Gli agonisti farmacologici possono anche essere aggiunti per applicazione del bagno o per perfusione e le risposte dinamiche del calcio fluorescente possono essere raccolte allo stesso modo. Al termine degli esperimenti di imaging o elettrofisiologici perché sono stati raggiunti i risultati desiderati, perfondere l'acqua attraverso le linee di perfusione e succhiare l'acqua da due a tre volte attraverso l'elettrodo di aspirazione per garantire che i sali non si accumulino. Una mappa spaziale delle risposte del calcio cellulare di Schwann alla stimolazione nervosa phrenica di un diaframma del topo Wnt one GCaMP al settimo giorno postnatale mostra una restrizione alle cellule terminali parasynattiche di Schwann alla giunzione neuromuscolare.
Lo stesso diaframma è stato immaginato dopo l'etichettatura con alfa bungarotoxina etichettata fluorescentmente, che si lega per consentire i recettori dell'acetilcolina della giunzione neuromuscolare. Lo stesso diaframma è stato anche immaginato sotto l'illuminazione brightfield per guidare un elettrodo di registrazione verso la regione post-sinaptica del muscolo dalla giunzione neuromuscolare. Qui è mostrata la demarcazione spaziale di cellule codificate a colori o regioni di interesse prese per l'analisi dei singoli transitori di calcio.
La mappa spaziale delle risposte di calcio delle cellule muscolari di un mth 5 GCaMP tre diaframma del topo a P quattro alla stimolazione nervosa phrenic in presenza dell'inibitore della miosina BHC mostra una risposta in tutta la regione di tutte le cellule muscolari del diaframma. Al contrario, la stimolazione dello stesso diaframma in presenza di mu-conotossina causa una risposta al calcio limitata spazialmente nella regione mediale di tutte le cellule muscolari del diaframma che corrisponde all'ammasso di cellule finali arricchite del gruppo del recettore dell'acetilcolina. Seguendo questa procedura è possibile eseguire altri metodi come l'immunoirochimica o l'immunoblotting al fine di rispondere a domande aggiuntive come, qual è il profilo molecolare delle cellule identificate dall'elettrofisiologia o dall'imaging del calcio?
Questo metodo può fornire informazioni sulle risposte della popolazione delle cellule di Schwann e delle cellule muscolari alla stimolazione nervosa nei normali topi neonatali. Può anche essere applicato allo studio di topi più anziani o allo studio di topi che esprimono proteine associate alla malattia neuromuscolare.
