Este método pode ajudar a responder a perguntas-chave no campo neuromuscular, como o papel da sinalização de cálcio em células musculares ou schwann em resposta à estimulação nervosa. A principal vantagem dessa técnica é que se pode imaginar a ativação de tipos celulares específicos em resposta à estimulação nervosa. Para começar, obtenha camundongos transgênicos e genótipo-los conforme detalhado no protocolo de texto.
Seguindo a eutanásia, seção transversal em todo o animal logo abaixo do fígado e logo acima do coração e pulmões com tesoura de iridectomia. Dissecar o fígado, o coração e os pulmões. Ter cuidado para manter um comprimento do nervo frênico que é suficientemente longo o suficiente para ser arrastado para um eletrodo de sucção.
Remova ainda mais a caixa torácica e a coluna vertebral, exceto pelo cume fino ao redor do diafragma. Coloque o diafragma e a amostra do nervo frênico em um tubo de microfuge com solução Krebs-Ringer contendo um micrograma por mililitro de bungarotoxina alfa fluorescentemente rotulada. Deixe o espécime incubar na solução por 10 minutos no escuro.
O uso de pinos minutien imobiliza o diafragma prendendo-o em um prato de seis centímetros revestido com gel dielétrico de silicone e preenchido com aproximadamente oito mililitros de solução Krebs-Ringer oxigenada. Coloque o prato no palco do microscópio. Em seguida, perfuça o diafragma com mais solução Krebs-Ringer a oito mililitros por minuto durante 30 minutos.
Quatro vezes a ampliação, usando um micromanipulador, mova o eletrodo de sucção sobre o nervo frênico esquerdo. Aplique a sucção puxando o barril de uma seringa de cinco mililitros conectada ao tubo que está preso ao eletrodo de sucção. Certifique-se de que o diafragma contrai em resposta à estimulação hertz examinando-a visualmente com iluminação Brightfield.
Caso não, ajuste a tensão girando o botão de tensão incrementalmente para alcançar um pulso supramaximal que pode ser verificado por exame visual da contração muscular. Se ainda não estiver visível, exploda o nervo com a seringa e tente atraí-la novamente aplicando sucção. Agora, desligue a perfusão para adicionar o inibidor de minosina específica do músculo BHC ou o antagonista do canal de sódio de tensão, mu-conotoxina.
Prepare a pré-diluição bhc, pipetando quatro microlitadores de 200 mililitros de estoque BHC em DMSO em um mililitro de solução Krebs-Ringer. Remova um mililitro da solução Krebs-Ringer do prato. Em seguida, adicione o BHC pré-diluído ao prato.
Após 30 minutos, ligue a perfusão da solução Krebs-Ringer fresca por mais 20 a 30 minutos. Usando luvas, prepare o eletrodo de gravação colocando um vidro filamentado borossilicato com um diâmetro externo de um milímetro e um diâmetro interno de 0,4 milímetros em um puxador de micropipette. Aperte os mostradores para fixá-lo na posição e feche a porta do puxador.
Em seguida, programe o puxador como descrito no protocolo de texto. Para diafragmas embrionários, meça a resistência usando controles de software do amplificador. Certifique-se de que a resistência está perto de 60 megaohms e para diafragmas mais antigos, de 10 a 20 megaohms.
Agora, carregue o eletrodo de gravação com três cloreto de potássio molar. Em 10 vezes a ampliação, abaixe o eletrodo em músculo usando um segundo micromanipulador no lado oposto do palco como um eletrodo estimulante. O uso do software de aquisição de dados eletrofisiológicos espera até que o potencial de membrana de repouso mude de zero para menos 65 milvolts ou abaixo.
Estimule em um hertz e verifique a presença de um potencial de ação muscular verificando um grande potencial que exibe uma superação modesta. Não confunda artefato de estimulação com potencial de ação. Em 20 vezes a ampliação localize a faixa da placa final no centro do músculo procurando por junções neuromusculares alfa fluorescentemente rotuladas sob excitação de luz amarela verde.
Mude para excitação de luz azul para respostas de cálcio de imagem em células musculares, neurônios motores ou schwann. Neste exemplo, gCaMP três é expresso em células musculares. Se desejar, configure o divisor de imagens com filtros de passe de banda e um filtro de borda únicadicróica para a imagem de comprimento de onda dupla.
Realize experimentos com a barra de brilho na barra de mesa de pesquisa definida para 110% do nível em que o indicador de cálcio geneticamente codificado expressando tecido exibe saturação em 20 vezes a ampliação sem binning em resposta ao cloreto de potássio. Grave a 20 quadros por segundo para não perder nenhum evento rápido. Estimule com um a 45 segundos de 20 a 40 hertz de estimulação nervosa, fornecendo um trem de impulsos usando um eletrodo de sucção e colete respostas dinâmicas de cálcio fluorescente em um subtipo de célula, juntamente com o sinal de junção neuromuscular alfa fluorescentemente rotulado estático.
Agonistas farmacológicos também podem ser adicionados por aplicação de banho ou por perfusão e as respostas dinâmicas de cálcio fluorescente podem ser coletadas da mesma forma. Quando os experimentos de imagem ou eletrofisiológico são concluídos porque os resultados desejados foram alcançados, perfuuse a água através das linhas de perfusão e suge água duas a três vezes através do eletrodo de sucção para garantir que os sais não se acumulem. Um mapa espacial das respostas de cálcio celular schwann à estimulação do nervo frênico de um Wnt one GCaMP três diafragma de rato no sétimo dia de natal mostram uma restrição às células schwann parassintálicas terminais na junção neuromuscular.
O mesmo diafragma foi imageado após rotulagem com bungarotoxina alfa fluorescentemente rotulada, que se liga para permitir receptores de acetilcolina da junção neuromuscular. O mesmo diafragma também foi imageado sob a iluminação brightfield para guiar um eletrodo de gravação para a região pós-sináptica do músculo pela junção neuromuscular. Aqui mostrada é a demarcação espacial de células codificadas por cores ou regiões de interesse tomadas para análise de transitórios individuais de cálcio.
O mapa espacial das respostas de cálcio celular muscular de um mth 5 GCaMP três diafragma de camundongos em P quatro a estimulação nervosa frênica na presença do inibidor de miosina BHC mostra uma resposta em toda a região de todas as células musculares diafragma. Em contraste, a estimulação do mesmo diafragma na presença de mu-conotoxina causa uma resposta espacialmente restrita de cálcio na região medial de todas as células musculares diafragma que corresponde ao aglomerado receptor de acetilcolina enriquecido banda de placa final. Seguindo este procedimento outros métodos como imuno-histoquímica ou imunoblotting podem ser realizados a fim de responder a perguntas adicionais como, qual é o perfil molecular das células identificadas por eletrofisiologia ou imagem de cálcio?
Este método pode fornecer uma visão das respostas populacionais das células schwann e células musculares à estimulação nervosa em camundongos neonatais normais. Também pode ser aplicado ao estudo de camundongos mais velhos ou ao estudo de camundongos que expressam proteínas associadas à doença neuromuscular.
